高濃度膽紅素對流式細胞術外周血淋巴細胞亞群檢測的干擾和消除方法

薛 燕， 許 俐， 黨利亨， 王 朝， 崔亞瓊， 王 萍， 王 寧， 張新杰， 劉 洋

[1.天津市兒童醫(yī)院（天津大學兒童醫(yī)院） 天津市兒科研究所 天津市兒童出生缺陷防治重點實驗室，天津 300134；2.天津市兒童醫(yī)院（天津大學兒童醫(yī)院）新生兒內(nèi)科，天津 300134]

目前，流式細胞術（ flow cytometry，F(xiàn)CM）已在檢驗醫(yī)學領域被廣泛應用，其檢測結果受樣本采集、抗體選擇、紅細胞裂解方法等多種因素的影響[1-2]。在實際工作中，我們發(fā)現(xiàn)部分高濃度膽紅素樣本存在異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的CD3+細胞群與CD3-細胞群熒光表達分界不清，進而影響設門的情況，直接影響了FCM檢測結果的準確性。國內(nèi)外已有較多關于膽紅素對具體檢測項目的干擾機制及其糾正方法的研究[3-4]，但目前尚無膽紅素對FCM檢測的干擾的報道，且試劑說明書中亦無相關信息。為了驗證高濃度膽紅素是否會對采用FCM檢測外周血淋巴細胞亞群產(chǎn)生干擾，本研究擬采用配對差異實驗評估高濃度膽紅素對FCM外周血淋巴細胞亞群檢測結果的影響。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年10月—2021年10月于天津市兒童醫(yī)院住院，血清總膽紅素（total bilirubin，TB）＞200 μmol/L，且進行淋巴細胞亞群檢測的患兒51例，依據(jù)直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）或間接膽紅素（indirect bilirubin，IBil）水平分為高DBil組（DBil＞171 μmol/L 6例，其中男2例、女4例，年齡5個月～14歲，包括自身免疫性肝炎2例、急性肝功能衰竭2例、肝豆狀核變性1例、自身免疫性溶血性貧血 1例）和高IBil組[IBil＞171 μmol/L，45例，其中男25例、女20例，年齡1～41 d，包括新生兒高膽紅素血癥28例、新生兒溶血癥（ABO血型不合）7例、新生兒敗血癥10例]。另選取健康體檢兒童6名作為對照組，其中男3名、女3名，年齡1～11歲，采集其血液樣本（無黃疸）作為對照樣本。

1.2 方法

1.2.1 淋巴細胞亞群檢測 采用 FACSCantoⅡ流式細胞儀（美國BD公司）及配套六色淋巴細胞亞群檢測試劑盒（貨號662967）檢測外周血T細胞亞群（CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+）百分比、B細胞（CD3-CD19+）百分比、自然殺傷（natural killer，NK）細胞（CD3-CD16+/CD56+）百分比。首次檢測采用染色-裂解的免洗方法，具體操作步驟：在流式管中依次加入20 μL抗體、50 μL乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝全血樣本，震蕩混勻后在室溫下避光反應15 min，然后加入450 μL FASC溶血素（美國BD公司）裂解紅細胞，震蕩混勻后在室溫下避光孵育15 min，上機檢測。

1.2.2 TB和DBil檢測 采用cobas c701全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）或cobas c501全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（重氮法）檢測血清TB和DBil水平。計算IBil（IBil=TB-DBil）。TB、DBil和IBil的參考區(qū)間分別為0～26、0.0～8.0、3.4～10.3 μmol/L。

1.2.3 干擾試驗 采用配對差異實驗分析膽紅素對FCM淋巴細胞亞群檢測的干擾。將高DBil組樣本離心后制備成高DBil血漿，濃度分別為198.1、222.0、229.0、350.4、483.4、1 086.5 μmol/L，分別取50 μL加入隨機配對的對照樣本中，作為干擾樣本。2種樣本均按染色-裂解的免洗方法處理，并采用FCM檢測。

1.2.4 高濃度膽紅素干擾消除方法 （1）洗滌-染色-裂解法：將高DBil組樣本進行洗滌-染色-裂解處理，吸取200 μL EDTA抗凝全血加入流式管中，加入2 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）震蕩混勻，350×g離心5 min，輕輕吸取2 mL上清，棄去。將剩余樣本染色、裂解，并采用FCM檢測。（2）染色-裂解-洗滌法：將干擾樣本進行染色-裂解-洗滌處理，在經(jīng)染色-裂解免洗方法處理的干擾樣本中加入2 mL PBS，震蕩混勻，350×g離心5 min，輕輕吸取2 mL上清，棄去。剩余樣本采用FCM檢測。

1.2.5 干擾劑量評估 取4份無黃疸EDTA抗凝全血樣本，每份樣本按50 μL/管分裝，分別加入6個流式管中。取干擾檢查A試劑盒（日本Sysmex公司，批號ER8001）中的DBil干粉，加2 mL蒸餾水，溶解成3 236 μmol/L的高濃度原液，隨后用PBS稀釋成6個濃度梯度。分別吸取10 μL梯度溶液加入含50 μL全血樣本的流式管中，將每份樣本配制成6個DBil濃度梯度（0、100、150、200、250、500 μmol/L），覆蓋低、中、高濃度范圍。將所有樣本進行染色、裂解處理，采用FCM檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用配對t檢驗。采用Pearson相關分析評估干擾樣本與對照樣本淋巴細胞亞群檢測結果的相關性。呈非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 高DBil組和高IBil組膽紅素檢測結果

高DBil組TB為330（241.4～741.6）μmol/L，DBil為289.7（216.0～634.2）μmol/L。高IBil組TB為227.4（211.1～263.6）μmol/L，DBil為14.0（11.2～21.4）μmol/L。

2.2 高DBil組和高IBil組淋巴細胞亞群檢測結果

高IBil組基于六色熒光表達的淋巴細胞亞群設門策略不受影響，見圖1。高DBil組均出現(xiàn)FITC標記的CD3-與CD3+細胞群熒光表達分界不清，見圖2。

圖1 高IBil組淋巴細胞亞群分析散點圖

圖2 高DBil組經(jīng)染色-裂解法處理后FITC標記的CD3-與CD3+細胞群熒光表達情況

2.3 干擾試驗結果

對照樣本FITC標記的CD3-與CD3+細胞群熒光表達分界清晰。采用染色-裂解法處理干擾樣本后，出現(xiàn)FITC標記的CD3-與CD3+細胞群熒光表達分界不清。見圖3。

圖3 對照樣本和經(jīng)染色-裂解法處理后的干擾樣本FITC標記的CD3-與CD3+細胞群熒光表達情況

2.4 DBil干擾劑量

隨著DBil水平的升高，F(xiàn)ITC標記的CD3-與 CD3+細胞群逐漸靠近。當DBil≤150 μmol/L時，干擾較小，對FCM設門基本無影響；當DBil≥200 μmol/L時，干擾較大，F(xiàn)ITC標記的CD3-與CD3+細胞群出現(xiàn)部分重疊，影響FCM設門。見圖4。

圖4 不同濃度DBil樣本經(jīng)染色-裂解處理后，F(xiàn)ITC標記的CD3-與CD3+細胞群熒光表達情況

2.5 干擾消除方法

高DBil組樣本經(jīng)洗滌-染色-裂解法處理和干擾樣本經(jīng)染色-裂解-洗滌法處理后，采用FCM檢測，結果顯示，F(xiàn)ITC標記的CD3-與CD3+細胞群的熒光表達分界清晰。見圖5、圖6。

圖5 高DBil組樣本經(jīng)洗滌-染色-裂解法處理后，F(xiàn)ITC標記的CD3-與 CD3+細胞群熒光表達情況

圖6 干擾樣本經(jīng)染色-裂解-洗滌法處理后，F(xiàn)ITC標記的CD3-與 CD3+細胞群熒光表達情況

干擾樣本經(jīng)染色-裂解-洗滌法處理后的淋巴細胞亞群檢測結果與對照樣本經(jīng)染色-裂解方法處理后的淋巴細胞亞群檢測結果比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 干擾樣本經(jīng)染色-裂解-洗滌方法處理與對照樣本經(jīng)染色-裂解方法處理的淋巴細胞亞群百分比比較

2.6 對照樣本與干擾樣本經(jīng)處理后淋巴細胞亞群檢測結果的相關性

Pearson相關分析結果顯示，干擾樣本經(jīng)染色-裂解-洗滌法處理后的CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD4+、CD3-CD16+/56+、CD3-CD19+細胞百分比和CD4/CD8比值與對照樣本均呈顯著正相關（r值分別為0.977、0.994、0.950、0.941、0.996、0.965，P＜0.05）。

3 討論

為了驗證膽紅素成分是否能干擾FITC標記的CD3抗原的熒光表達，本研究設立了高DBil組和高IBil組。同時，結合工作中遇到的存在這種問題的樣本，本研究將樣本入選標準定為血清TB＞200 μmol/L。

田禾等[5]發(fā)現(xiàn)，高濃度膽紅素對FITC熒光信號的檢測有一定的干擾，且膽紅素濃度越高，干擾越大，但具體干擾機制尚不明確。膽紅素是人體血清中重要的內(nèi)源性熒光物質(zhì)之一，在一定波長光的激發(fā)下，呈現(xiàn)熒光發(fā)射光譜，其發(fā)射光主峰在520 nm處[6-7]。標記CD3抗原的FITC的最大激發(fā)波長為494 nm，發(fā)射光主峰在520 nm處。由于膽紅素和FITC的發(fā)射光譜非常接近，因此會發(fā)生熒光信號疊加，這可能是高濃度膽紅素會對FITC標記的CD3抗原的熒光表達產(chǎn)生干擾的原因。

本研究結果顯示，與高IBil組相比，高DBil組更易出現(xiàn)CD3-與CD3+細胞群分界不清。配對差異實驗結果顯示，將高濃度DBil血漿加入非黃疸樣本會導致FITC標記的CD3-與CD3+細胞群熒光表達分界不清，表明熒光信號受到了干擾。IBil與DBil對FITC熒光信號表現(xiàn)出不同的影響，可能與二者在人體內(nèi)的存在形式不同有關。IBil是紅細胞被破壞后形成的膽紅素，在外周循環(huán)中以與白蛋白結合的形式存在，不溶于水，每個白蛋白可以結合2個IBil分子。史曉敏等[8]的研究結果顯示，當IBil水平很高時，會導致白蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，形成一些比較微小的顆粒物質(zhì)。這種微小的顆?？赡茉贔CM淋巴細胞亞群檢測的設門策略的第1步，即以SSC/CD45設門分析定位淋巴細胞時已經(jīng)被判斷為非淋巴細胞的顆粒，不納入后續(xù)設門，因此對FITC熒光信號無影響。DBil是經(jīng)過肝臟加工后的膽紅素，其實質(zhì)為膽紅素分子與1個或2個葡萄糖醛酸分子單獨酯化形成的結構，易溶于血漿和樣本處理所用的裂解液，因此可能對FITC熒光信號的干擾較大。

本研究結果顯示，DBil對采用FCM檢測淋巴細胞亞群的干擾程度會隨濃度的升高而增大，當血中DBil≤150 μmol/L時，干擾較小，對設門基本無影響，不會影響FCM檢測；當血中DBil≥200 μmol/L時，干擾較大，F(xiàn)ITC標記的CD3-與CD3+細胞群出現(xiàn)部分重疊，影響設門。如不采取有效措施解決此問題，將影響FCM檢測結果的準確性。

本研究結果還顯示，采用洗滌-染色-裂解和染色-裂解-洗滌2種方法均能有效消除DBil對FITC熒光信號的干擾。從操作步驟上來說，洗滌-染色-裂解方法是在發(fā)現(xiàn)干擾后重新處理樣本，而染色-裂解-洗滌方法是將采用免洗方法處理的樣本僅通過洗滌這1個步驟即可再次上機檢測。后者更節(jié)約時間，且經(jīng)染色-裂解-洗滌方法處理的干擾樣本淋巴細胞亞群的檢測結果與對照樣本比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），二者淋巴細胞亞群檢測結果的相關性良好（r值均＞0.94，P＜0.05）。

目前，淋巴細胞亞群絕對計數(shù)在臨床上已廣泛開展。然而，高DBil樣本經(jīng)過洗滌后，無法通過單平臺直接得出各淋巴細胞亞群準確的絕對計數(shù)。本研究結果顯示，此類樣本洗滌后各淋巴細胞亞群的百分比與未干擾樣本比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。因此，可以根據(jù)洗滌前總淋巴細胞絕對計數(shù)和洗滌后重新檢測得到的各淋巴細胞亞群的百分比，通過計算獲得各淋巴細胞亞群的絕對計數(shù)。若流式細胞儀專用軟件檢測結果中不包括總淋巴細胞絕對計數(shù)，也可以通過公式：洗滌前總淋巴細胞絕對計數(shù)=（洗滌前淋巴細胞群區(qū)域的事件數(shù)/洗滌前絕對計數(shù)微球區(qū)域的事件數(shù)）×[每次測定的微球數(shù)量/總體積（50 μL）]計算得出，式中每次測定的微球數(shù)量可在絕對計數(shù)管包裝標簽上找到，試劑批次不同該值可能會不同。

綜上所述，高濃度DBil會干擾FITC的熒光信號，導致采用FCM檢測FITC標記的CD3-與CD3+細胞群熒光表達分界不清。采用染色-裂解-洗滌方法處理，可最大程度地消除這種干擾，保證FCM檢測結果的準確性。