慢性乙型肝炎治療的研究進展

李冰,王樹文,程曉博,曹曄,劉艷,金銀鵬

(復旦大學附屬上海市公共衛(wèi)生臨床中心,上海 201508)

據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，2019年全球約有2.96億人患有慢性乙型肝炎(CHB)，每年新增感染病例150萬例，其中我國攜帶者人數(shù)為1億，并以每年10萬的速度增長[1-2]。1980年代至2000年初期，在乙型肝炎(乙肝)疫苗推廣以前，我國5歲以下兒童乙肝病毒(HBV)感染率為5%，隨著乙肝疫苗的推廣，2019年HBV感染率降至1%。HBV持續(xù)感染會引起肝臟慢性炎性損害，持續(xù)半年以上轉(zhuǎn)為CHB，其中約1/3為重癥[3]。通過對乙肝e抗原(HBeAg)的檢測，CHB又可分為HBeAg陽性和陰性CHB。乙型肝炎病毒(HBV)是目前已知能夠感染人類的最小的雙鏈DNA病毒，其DNA分子僅由3 200個核苷酸組成，編碼乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和DNA多聚酶，其中HBsAg對診斷HBV感染具有重要的意義。雖然乙肝的發(fā)病機制尚未完全明確，但是研究表明HBV持續(xù)感染引發(fā)機體的免疫應答是導致肝損傷和炎癥持續(xù)發(fā)生，使病情發(fā)展至肝硬化甚至惡化為肝癌的主要原因[4]。病毒復制周期機制的發(fā)現(xiàn)引導了新治療藥物的發(fā)展。本文對抗HBV藥物及新的HBV治療方案進行了總結(jié)，期望能為乙肝臨床治療提供參考。

1 乙肝的治療現(xiàn)狀

根據(jù)我國《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》和2022年最新《擴大慢性乙型肝炎抗病毒治療的專家意見》以及2017年歐洲肝臟研究學會(EASL)指南[5]，HBV-DNA陽性、有乙肝肝硬化或乙肝肝癌家族史、年齡大于30歲，無論HBeAg水平如何，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)是否正常，都需要開始抗病毒治療。其臨床藥物主要為干擾素(IFN)和核苷(酸)類藥物(NAs)。

1.1 IFN

IFN由單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生，是一種能夠通過刺激細胞因子、激活免疫調(diào)節(jié)而直接抑制HBV復制的可溶性糖蛋白，為最早應用于乙肝臨床治療的藥物之一。根據(jù)半衰期的長短IFN可分為短效IFN和長效IFN。國內(nèi)常用的短效IFN為IFN-α，該藥通常應用于首次接受治療并希望在短期內(nèi)快速完成療程的年輕及有生育要求的病人。長效IFN更適用于病程相對較長的病人。有研究表明，對于CHB病人，長效IFN聚乙二醇干擾素α(Peg-IFN-α)的癥狀改善率以及HBeAg、HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率顯著高于短效IFN[6]。需要指出的是，IFN不宜在妊娠、肝衰竭及存在神經(jīng)系統(tǒng)病變的情況下使用，其不良反應包括骨髓抑制以及內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[7]。

1.2 NAs

治療乙肝的NAs主要有核苷類(拉米夫定、替比夫定、恩替卡韋等)和核苷酸類(阿德福韋、富馬酸替諾福韋酯、富馬酸丙酚替諾福韋等)。在病毒的復制過程中，NAs模擬、取代延長聚合酶鏈的天然核苷(酸)，抑制逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶，從而阻止聚合酶鏈的延長，起到抑制HBV-DNA復制的作用。雖然NAs抗病毒活性強、安全性高、臨床應用廣泛，但其耐藥屏障低，耐藥率高，并且易產(chǎn)生胃腸道反應、頭痛和腎毒性等不良反應，因此不宜長期服用[8]。為最大程度減少藥物副作用，新藥的研發(fā)一直在進行。2021年批準上市的用于乙肝治療的創(chuàng)新藥艾米替諾福韋片是第二代替諾福韋，為替諾福韋的亞磷酰胺藥物前體，是一種新型的核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。相較于替諾福韋，艾米替諾福韋通過優(yōu)化結(jié)構(gòu)，擁有更高血漿穩(wěn)定性，經(jīng)肝細胞代謝，活性代謝產(chǎn)物雙磷酸替諾福韋在肝臟高濃度聚集，從而實現(xiàn)肝靶向，提升了藥物的利用度，能更快發(fā)揮抗病毒的作用，強效抑制HBV復制。該藥只需要少于替諾福韋1/10的劑量便可獲得相似的抗病毒效用，且對骨密度及腎臟影響較小。

2 抗乙肝新藥的進展

由于現(xiàn)有抗病毒藥物只能控制HBV復制而無法清除病毒，且面臨耐藥性產(chǎn)生的問題，因此全球的科研工作者仍在努力優(yōu)化現(xiàn)有藥物或挖掘新的治療靶點以期阻斷新的肝細胞感染，消除病毒cccDNA儲存庫，進而有效抑制病毒復制并最終恢復機體的正常生理功能。新的抗HBV靶標包括抑制HBV復制、降低和阻斷HBV/丁型肝炎病毒(HDV)受體的鈉離子-牛磺酸膽酸共轉(zhuǎn)運蛋白(NTCP)表達、干擾HBV衣殼體的組裝等，雖然這些基于新機制的抗HBV藥物大多數(shù)仍處于臨床試驗期，但已有的研究表明，它們在抗病毒的有效性、安全性、耐藥性、不良反應等方面要優(yōu)于原有的抗病毒藥物。

2.1 病毒進入抑制劑

Myrcludex B是一種合成型脂質(zhì)肽，可通過阻斷HBV與NTCP受體的結(jié)合來抑制HBV進入肝臟細胞。一項Ⅱb期臨床試驗表明，慢性HBV/HDV復合感染病人通過Myrcludex B與Peg-IFN-α聯(lián)合治療以后，HBsAg清除率高達27%，并且3/4的病人出現(xiàn)了血清HBsAg轉(zhuǎn)陰[9]。

2.2 消除cccDNA儲存庫藥物

沉默或者清除被感染肝細胞中的cccDNA儲存庫是另一種新興的HBV治療方法。cccDNA是包裹在轉(zhuǎn)錄活性和非轉(zhuǎn)錄活性染色質(zhì)中穩(wěn)定的非整合型微染色體，是核酸酶基因編輯的HBV最佳治療靶標[10]。近來，定向誘變引起了極大的關(guān)注，此方法的原理是通過使用序列特異性RNA引導的核酸酶來編輯cccDNA使之永久沉默，從而治愈HBV感染病人。這類核酸酶包括鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄活化劑樣效應核酸酶(TALEN)以及CRISPR-CAS系統(tǒng)[11-14]。新型的分子cccDNA去穩(wěn)定劑ccc_R08，能顯著而持續(xù)地降低血清中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA和HBV-RNA的水平，并能降低HBV感染模型小鼠肝臟中cccDNA的水平[15]。

2.3 RNA干擾藥物

HBV具有5個病毒mRNA轉(zhuǎn)錄子，其中任何一個被干擾均可使病毒抗原的合成出現(xiàn)障礙，因此，另一種潛在的治療方法是RNA干擾。小干擾RNA(siRNA)屬于雙鏈RNA分子，長度為20～25個堿基對，可調(diào)節(jié)基因表達[16]。其中一條鏈與Ago2/RISC復合物相互作用而降解，另一條鏈則與互補mRNA結(jié)合，通過一種RNA誘導沉默的復合物的介導而使mRNA降解[17]。從理論上來說，這類化合物能夠影響HBV-DNA、HBeAg和HBcAg的水平，從而逆轉(zhuǎn)免疫力衰弱而激發(fā)有效的HBV特異性免疫，實現(xiàn)HBsAg血清轉(zhuǎn)陰和功能性治愈。值得注意的是，siRNA需要合適的載體來實現(xiàn)靜脈給藥，目前有一些臨床試驗通過特定途徑將HBV特異性siRNA傳遞到被感染肝細胞。特異性siRNA與GalNAc偶聯(lián)形成GalNAc-siRNA能夠通過皮下用藥進入體內(nèi)，與肝細胞上高度表達的脫唾液酸糖蛋白受體相互作用。EASL ILC于2018年首次報道了這種新型siRNA：AB-729在Ⅰa/b期臨床試驗中能夠以4個HBV的開放閱讀框(ORFs)作為靶標，有效地拮抗A～H型HBV，在高濃度下無細胞毒性；且前期實驗表明，每月給藥能夠顯著降低動物模型HBsAg、HBeAg和HBV-DNA水平[18]。ARB-1467是一類包含了3種siRNA的脂質(zhì)納米顆粒(LNP)，單次或多次給藥后能夠靶向3個不同的位點抑制轉(zhuǎn)錄后HBV抗原的合成，如HBsAg[19]。另一種藥物JNJ-3989(也稱ARO-HBV)能夠沉默HBV-RNA和宿主整合的HBV-DNA。實驗研究顯示，此藥能夠迅速降低所有可測量病毒產(chǎn)物的水平，包括HBeAg陽性和陰性病人的HBsAg水平[20]。此外，一項ⅡA期多中心隨機臨床試驗結(jié)果顯示，GSK3389404(一種反義多聚核苷酸)給藥3個月可以迅速降低HBeAg陽性和陰性病人的HBsAg水平[21]。

2.4 核心蛋白抑制劑

核心顆粒中的pgRNA是逆轉(zhuǎn)錄合成負鏈DNA鏈的模板，由于pgRNA能夠被核糖核酸酶(RNase)H裂解，所以RNase H抑制劑能夠抑制這個過程的發(fā)生并阻止正鏈DNA的合成。基于以上原理，RNase H抑制劑類藥物也是一種潛在的HBV治療方向，這類藥物如α-hydroxytropolones、N-hydroxyisoquinolinediones和N-hydroxylpyridinediones的臨床研究正在進行中[22-23]。

HBV核心蛋白在整個病毒復制周期內(nèi)能夠脫膜釋放rcDNA、合成核衣殼并包裹pgRNA、在病毒最終形成階段與HBsAg結(jié)合。該蛋白能夠結(jié)合細胞啟動子和cccDNA，改變核間隙并調(diào)節(jié)基因表達，因此核心蛋白抑制劑是一種潛在的研究方向。目前有兩類核心蛋白變構(gòu)調(diào)節(jié)劑(CpAMs)：Ⅰ型(雜芳基二氫嘧啶(HAP))和Ⅱ型(苯基丙烯酰胺、氨磺?；郊柞０泛推渌?。HAP衍生物能夠誘導核心蛋白二聚體組成異常的非衣殼聚合物從而降解核蛋白[24]。甲磺酸莫非賽定(GLS4)能夠抑制病毒在肝細胞系上清液中的堆積，降低肝腫瘤小鼠體內(nèi)HBV-DNA水平[25]。一種口服Ⅰ型CpAMs RO7049389能夠誘導異常HBV核蛋白聚集體的形成，阻止HBV的合成和復制?；赗O7049389藥物的安全性、耐受性、藥代動力學以及抗HBV活性的Ⅰ期臨床試驗仍在進行中，不過現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，給藥4周后，慢性、無肝硬化乙肝病人的HBV-DNA、HBV-RNA水平顯著下降，但是HBsAg水平?jīng)]有顯著變化[26]。另外，對比現(xiàn)有CHB療法，HAP_R01具有更高的血清HBeAg轉(zhuǎn)陰率，也是潛在的抗HBV藥物之一[27]。Ⅱ型CpAMs能夠加速衣殼的組裝，同時阻止pgRNA包裹，從而組裝空衣殼[28]。EDP514能夠降低小鼠HBV-DNA、HBV-RNA、HBsAg和HBeAg的水平，并且能夠與其他核心蛋白抑制劑協(xié)同抗病毒[29]。另外，AB-423、ABI-H0731、JNJ-56136379和JNJ-6379也正處于研究階段[30-31]。

2.5 HBsAg抑制劑

乙肝表面抗體(HbsAb)對HBV感染具有免疫抑制作用，包括獲得性免疫和天然免疫。臨床研究發(fā)現(xiàn)，血清中HBsAg的消除可以增強機體對HBV的免疫作用，并且放大Peg-IFN-a的效果[32]。REP-2055、REP-2139和REP-2165可以抑制肝細胞中HBsAg的釋放[33]。HBV/HDV合并感染病人持續(xù)15周、每周1次接受REP-2139-Ca靜脈注射，接下來15周每周1次聯(lián)合使用REP-2139/Peg-IFN-a靜脈注射，然后接受單藥Peg-IFN-a治療33周，試驗終止后，42%的病人體內(nèi)HBsAg被清除[34]。然而，多次使用REP-2139-Ca能夠加重肝臟負擔，而有試驗顯示REP-2165能使REP-2139在保持抗病毒活性同時減少對肝臟的毒副作用。

成年人從急性HBV感染中的自主恢復依賴于廣泛的多種特異性免疫反應。雖然先天免疫應答自然清除HBV感染的機制尚不明確，但最近的研究表明，NK細胞參與早期HBsAg的清除，其他細胞可能參與免疫調(diào)節(jié)[35]。在癥狀出現(xiàn)前，病毒滴度下降可能與病毒復制過程中NK和NKT細胞分泌IFN-α介導的非細胞溶解抑制有關(guān)。實驗表明，自然條件下針對病毒蛋白(例如HBcAg)的HBV的特異性細胞毒性T細胞(CTL)應答反應強烈并具有多克隆性質(zhì)，在清除被感染的肝細胞過程中十分重要[36]。

不同于急性HBV感染，CHB感染的原因與機體對HBV的特異性免疫反應有關(guān)。感染初期由于NK細胞和漿質(zhì)樹突細胞(pDC)功能異常導致分泌IFN-a不足而使得先天免疫反應過慢。下游的抗原呈遞細胞(例如DCs)成熟過程被HBsAg或者HBeAg破壞，從而誘導免疫耐受。另外，在免疫病理學方面，促炎細胞因子的存在導致單核/巨噬細胞、NK、NKT和T細胞浸潤肝組織，引起慢性肝炎[37]。然而，CTL的局限性和特異性使其不足以清除所有感染肝細胞內(nèi)的病毒。因此，任何新療法都應該旨在消除感染肝細胞的病毒、避免健康肝細胞被感染、建立長期病毒控制和消除cccDNA儲存庫。

Toll Like Receptors(TLRs)是抵御入侵微生物的第一道防線。它們感受病原體相關(guān)分子(PAMPs)，通過信息傳導產(chǎn)生細胞因子。TLR-7、8激動劑參與內(nèi)源性IFN的產(chǎn)生、IFN刺激基因(ISGs)的誘導以及其他信號通路(如JAK/STAT)的激活。TLR-7激動劑GS-9620在人類肝細胞系HepaRG和感染HBV原代細胞中，能夠通過誘導Ⅰ型IFN持久抑制復制，但是不能降低cccDNA水平[38]。然而此藥應用于NAs治療的HBV病人時，對HBsAg水平?jīng)]有顯著影響[29]。聯(lián)用TLR-7激動劑(RO7020531)和一類衣殼裝配調(diào)節(jié)劑(RO749389)能夠顯著降低AAV-HBV小鼠的HBV-DNA和HBsAg水平[40]。在人體內(nèi)，單次和多次遞增劑量的RO7020531能夠激發(fā)IFN-a誘導的細胞因子和ISGs產(chǎn)生[41]。維甲酸誘導基因1(RIG-1)能夠激活I(lǐng)SGs產(chǎn)生IFN-a和其他抗病毒細胞因子。未曾接受治療的CHB肝硬化病人接受RIG-1/NOD-2激動劑Inarigivir(SB 9200)12周再改用富馬酸替諾福韋治療12周后，HBV-DNA、HBV-RNA和HBsAg水平均降低[42]。另外，干擾素基因激動劑、PD-1抑制劑等也處于臨床研究階段。

獲得性免疫主要是通過疫苗調(diào)節(jié)來實現(xiàn)。最近研發(fā)的ABX-203(HeberNasvac)是一種含有HBsAg和HBcAg的鼻腔注射疫苗。Ⅲ期臨床研究表明，疫苗和Peg-IFN-a對于病人HBV-DNA的抑制率相似(59.0% vs 62.5%)，但是疫苗展示出更高的血清HBeAg轉(zhuǎn)陰率[43]。INO-1800是一種能夠編碼HBsAg和HBcAg序列的疫苗，在動物實驗中展示出強大而廣泛的細胞介導的免疫力[44]。然而該疫苗需要通過電穿孔給藥，這種給藥方法較難實施而且可能產(chǎn)生副作用。GS-4774是一種重組、熱滅活的酵母型疫苗，能夠編碼HBsAg、HBcAg和X蛋白，雖然臨床試驗中此疫苗相較口服抗病毒藥物并沒有實質(zhì)性的突破，但是它能刺激IFN-a、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素2(IL-2)的產(chǎn)生，并且能刺激CD8+T細胞的免疫抗炎活性[45]。

3 乙肝的中醫(yī)治療進展

中醫(yī)藥在乙肝治療中具有十分重要的地位。近年來中醫(yī)藥在單方和復方制劑抗HBV的研究方面取得了一定的進展。中醫(yī)通常將乙肝歸為“肝溫”“肝毒”“脅痛”“黃疸”等范疇，一般認為其中醫(yī)的病因病機為正氣不足、濕熱疫毒侵襲，導致濕熱郁結(jié)、肝郁脾虛、肝腎陰虛等[3,46-52]。治療上采用清熱利濕、舒肝健脾、滋陰解毒等治則。加減逍遙散是一個經(jīng)典的中醫(yī)方劑，常用來治療肝郁氣滯型的CHB病人。有研究表明，運用該方劑治療2月能夠顯著提升該型CHB病人的肝功能[53]；使用該方劑聯(lián)合恩替卡韋治療CHB半年后，病人的癥狀包括腹脹、肝郁等得到明顯改善，有效率高達83%[54]。中藥復方肝復康能夠增強T淋巴細胞的免疫清除功能，阻斷HBV復制，顯著降低HBsAg水平[55]。扶正解毒湯能夠抑制病毒復制、減輕肝損傷，服用半年后CHB病人的臨床癥狀明顯改善[56]。五虎湯配伍白術(shù)、大棗、萊菔子、茯苓等健脾益氣類中藥可以明顯改善CHB病人的脅痛、心悸及腹脹等癥狀[57]。小柴胡湯加減則能夠改善肝功能，提高HBV-DNA的轉(zhuǎn)陰率[58]。這些研究表明，中藥方劑有可能成為未來乙肝治療的藥物。

中藥單味藥及單體化合物治療乙肝的研究也受到廣泛關(guān)注。有研究結(jié)果表明，葉下珠制劑具有抗HBV活性、抑制HBsAg和HBeAg產(chǎn)生的作用，同時還能夠防止和延緩肝纖維化和肝硬化[59]?？鄥⒏械纳飰A苦參素可以阻止HBV的復制，顯著提高人體免疫力[60]。黃芪能夠激活肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應激作用，黃芪中的黃芪多糖能刺激細胞因子和內(nèi)源性IFN的產(chǎn)生，清除HBV，保護肝功能，防止或延緩肝癌的發(fā)生[61]。網(wǎng)絡藥理學研究表明，黃連及其活性成分(如穆坪馬兜鈴酸酰胺、鹽酸巴馬汀、槲皮素、小檗堿等)能夠通過多成分-多靶點協(xié)同與潛在靶標蛋白分子MAPK1、MAPK3、MMP3以及CASP3等對接，發(fā)揮保肝抗炎從而治療乙肝的作用[62]。

最近，有研究顯示，在CHB的治療上，針灸、穴位注射、針灸配合中藥或西藥治療，能夠顯著提高HBeAg和HBV-DNA的轉(zhuǎn)陰率[63-65]。針灸治療CHB可能是一個具有前景的課題。

4 CHB的聯(lián)合/序貫抗病毒治療

國際上CHB的治愈分為完全治愈和臨床治愈。完全治愈也稱病毒學治愈，是指血清中檢測不出HbsAg，血清整合HBV-DNA和肝內(nèi)cccDNA完全清除。由于目前尚無針對cccDNA的特異性靶向治療藥物，故完全治愈很難達到。CHB防治指南認為最理想的治愈為臨床治愈，臨床治愈又稱功能性治愈，是指血清中HBsAg和HBV-DNA均檢測不出，HBeAg轉(zhuǎn)陰，肝臟慢性炎癥緩解，肝功能指標ALT正常，肝組織病理學改善。隨著治療方案的不斷優(yōu)化，抗病毒藥物和免疫調(diào)節(jié)劑通過聯(lián)合/序貫治療，強效抑制病毒，恢復機體免疫應答，使臨床治愈的實現(xiàn)成為可能。有Meta分析結(jié)果顯示，在病毒學和血清學反應中IFN與NAs聯(lián)合治療CHB的效果優(yōu)于IFN的單一療法[66]。LIU等[67]通過檢索Web of Science和Embase databases數(shù)據(jù)庫，綜合性分析發(fā)表的相關(guān)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，IFN聯(lián)合NAs治療或者NAs治療后序貫IFN治療與NAs單一治療相比較能夠明顯提高HBsAg的清除率。CHEN等[68]的臨床研究結(jié)果顯示，HBeAg陰性CHB病人在接受NAs治療24周后增加Peg-IFNα-2b聯(lián)合治療，治療48周后，其HBsAg清除率和血清轉(zhuǎn)換率均顯著高于NAs單獨治療組。但是，在臨床上選擇IFN與NAs聯(lián)合使用或序貫使用或者單獨使用時不能一概而論，而要根據(jù)防治指南及病人自身的實際情況綜合考慮。

5 結(jié)語

乙肝是多發(fā)性頑疾。HBV通過不斷更新的cccDNA儲存庫而持續(xù)存在于肝細胞核中，半衰期較長。免疫應答受損和無效嚴重阻礙了感染HBV肝細胞的清除。乙肝并發(fā)癥的高發(fā)在世界上引起廣泛的關(guān)注，雖然抗病毒藥物能夠高效抑制HBV復制，但cccDNA清除、停藥反應以及耐受性差等仍是問題所在。因此，現(xiàn)有的乙肝治療藥物和方法仍有局限性，單一靶點治療乙肝毒性大、治愈率低。在過去的幾年中，關(guān)于病毒生命周期和病毒作用機制方面的研究取得了很大的進展，為新藥的開發(fā)指明了新的方向，包括HBV附著抑制劑、RNA干擾、核仁核心抑制劑、HBsAg抑制劑和免疫療法等。中醫(yī)藥治療乙肝也在臨床、實驗研究中展示出較好的療效與較低的副作用，因此臨床上中西醫(yī)結(jié)合、聯(lián)合/序貫治療乙肝可能會為當代醫(yī)學的發(fā)展提供新的方向。