外泌體聯(lián)合可注射生物材料治療脊髓損傷

韓博 蔡闖 崔學(xué)文

脊髓損傷（SCI）常由車禍、跌倒和暴力導(dǎo)致，而患者往往很難獲得有效治療，由此引發(fā)的截癱、壓瘡、肺部感染等多種并發(fā)癥可能嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并大大增加損傷后的病死風(fēng)險[1]。近期研究認(rèn)為，SCI局部組織會在傷后出現(xiàn)水腫、出血、神經(jīng)元變性、炎癥和細(xì)胞凋亡等[2]，而在其周圍形成的神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕則會成為神經(jīng)元軸突再生的物理屏障，局部組織隨之壞死并形成空腔[3]。在多種因素綜合作用下，SCI將造成不可逆的后果。目前一致認(rèn)為，改善損傷區(qū)域微環(huán)境[4]，減輕損傷脊髓內(nèi)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥損害，減少程序性死亡或凋亡細(xì)胞[5]是治療SCI的普遍原則。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體治療SCI機(jī)制

近年多項研究均表明，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（MSC-Exo）在SCI修復(fù)方面潛力巨大，可以通過多種途徑對SCI改變產(chǎn)生正向影響。①通過上調(diào)血管生成相關(guān)基因表達(dá)促進(jìn)血管生成，改善缺血、缺氧的微環(huán)境，從而減少損傷部位修復(fù)的不利因素[6]。②誘導(dǎo)神經(jīng)元軸突生長，減少硫酸軟骨素蛋白聚糖產(chǎn)生，延緩星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖并抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成，從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[7-9]。③通過抑制細(xì)胞凋亡修復(fù)SCI，包括下調(diào)凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)水平，升高抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平[10]以及通過負(fù)性調(diào)節(jié)caspase-8依賴性凋亡途徑減少少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡[11]，從而改善SCI神經(jīng)纖維的脫髓鞘狀態(tài)，并對其形成有效保護(hù)。④通過抑制促炎巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞極化，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化并下調(diào)炎性因子表達(dá)，調(diào)節(jié)局部損傷組織的炎癥反應(yīng)[12-14]，從而在SCI修復(fù)中發(fā)揮重要作用。

許多實驗研究結(jié)果均表明，MSC-Exo在單獨應(yīng)用時有一定的局限性，而在與可降解水凝膠、納米顆粒、復(fù)合材料等可注射生物材料聯(lián)合應(yīng)用時，其在諸多領(lǐng)域優(yōu)勢突出。

2 可注射材料用于外泌體治療SCI

隨著微創(chuàng)手術(shù)的普及，可注射生物材料得到了廣泛研究。研究表明，可注射生物材料可以精確定位病變部位，反復(fù)注射則可實現(xiàn)組織完全再生，其中一些材料硬度與人類脊髓相當(dāng)，并具有非常優(yōu)秀的保水性[15]。另有許多材料可提供靶點與生長因子、酶、抗炎因子等功能化配體結(jié)合的機(jī)會，以允許細(xì)胞附著、發(fā)芽和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）再生，從而為可注射生物材料聯(lián)合MSC-Exo治療SCI奠定基礎(chǔ)。

2.1 水凝膠

水凝膠是由親水性聚合物鏈通過物理或化學(xué)交聯(lián)形成的三維結(jié)構(gòu)。由于聚合物主鏈中存在親水性官能團(tuán)，水凝膠可以吸收大量的水而發(fā)生廣泛膨脹，卻不會發(fā)生溶解[16]。作為一種高度水化的聚合物網(wǎng)絡(luò)，水凝膠能夠模擬細(xì)胞在自然狀態(tài)下的存活環(huán)境，因此成為藥物和細(xì)胞治療研究中的主要載體[17]。水凝膠較為柔軟，其水合形式與天然神經(jīng)組織相似，故常用于促進(jìn)SCI后的軸突生長和組織形成[18]。

溶膠狀態(tài)的水凝膠可呈現(xiàn)為理化性質(zhì)獨特的低黏度流體，在被注入傷口后則會發(fā)生原位凝膠化，而其凝膠狀態(tài)更加穩(wěn)定?？勺⑸渌z生物相容性良好，在給藥后可與傷口區(qū)域緊密接觸，且在發(fā)揮作用的過程中不會被輕易移除，因此可以有效填充病變腔，并與脊髓無縫結(jié)合[19]。水凝膠的另一個優(yōu)點是，它們可以通過微創(chuàng)技術(shù)被直接注射到靶區(qū)域或靶組織中，從而避免二次損傷[20]，因此水凝膠是治療SCI的理想傷口敷料。MSC-Exo具有免疫調(diào)節(jié)和組織再生功能，因此負(fù)載MSCExo的水凝膠常用于SCI協(xié)同治療。

Fan等[21]發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)電水凝膠可與神經(jīng)組織的電學(xué)特性和力學(xué)特性匹配，有望用于促進(jìn)SCI修復(fù)。負(fù)載MSC-Exo的雙網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)電水凝膠功能良好，可在SCI治療中抑制炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞募集能力并促進(jìn)神經(jīng)元和髓鞘相關(guān)軸突再生，有助于SCI小鼠恢復(fù)運動。

Cheng等[22]對一種包裹MSC-Exo的明膠甲基丙烯酸水凝膠（GelMA）進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該水凝膠可以明顯促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)分化，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕形成，并增加軸突生長，從而誘導(dǎo)SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)，且外泌體聯(lián)合水凝膠較單純外泌體修復(fù)效果更顯著。應(yīng)用負(fù)載MSC-Exo的水凝膠已成為一種值得肯定的SCI修復(fù)方法。

Li等[23]研究發(fā)現(xiàn)，基于PPFLMLLKGSTR肽修飾的透明質(zhì)酸（HA）水凝膠（pGel）和人胎盤羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）外泌體聯(lián)合應(yīng)用可對SCI神經(jīng)組織微環(huán)境產(chǎn)生影響，而誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）過度表達(dá)則會加速SCI炎癥進(jìn)展和神經(jīng)元變性過程。在該水凝膠被植入后，病變部位iNOS表達(dá)會顯著降低，提示該水凝膠在侵襲性炎癥急性期具有抗炎作用。

近年來，很多研究團(tuán)隊對各種類型的水凝膠聯(lián)合MSC-Exo治療方案進(jìn)行嘗試，如Mukhamedshina課題組[24]使用的纖維蛋白水凝膠、Zaviskova等[25]研究的透明質(zhì)酸水凝膠以及Yao等[26]采用的明膠水凝膠等，均被證實具有促進(jìn)SCI修復(fù)的作用。在不同的外部刺激作用下，水凝膠可以從溶膠向凝膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變[27]，使得水凝膠在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用可能性更大。在綜合其他優(yōu)勢的情況下，水凝膠已成為開發(fā)SCI及其他神經(jīng)損傷疾病治療方案的理想研究對象。

2.2 納米顆粒

與納米顆粒（NP）結(jié)合的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）在組織再生中應(yīng)用廣泛。NP是直徑為1～100 nm的超細(xì)顆粒，其制造方法即雙乳液/溶劑蒸發(fā)技術(shù)，可在NP中嵌入特定信號或細(xì)胞[28]。根據(jù)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)組成的不同，NP可以分為：①金屬NP，即金NP（AuNP）、銀NP（AgNP）和氧化鐵NP（IONP）；②無機(jī)NP，即硅NP（SiNP）、陶瓷NP（CNP）；③有機(jī)NP，即海藻酸鈉、聚乳酸-羥基乙酸和羥基磷灰石（HAp）[29]。

大量研究證實，外泌體在治療多種疾病方面潛力巨大，但相關(guān)研究領(lǐng)域仍然存在2個關(guān)鍵挑戰(zhàn)，即可重復(fù)制備能力及有效的體內(nèi)跟蹤治療能力。NP在體內(nèi)跟蹤治療方面具有許多優(yōu)點：高重復(fù)制備能力、長期跟蹤能力和多功能性潛力[30]。作為造影劑，AuNP的X射線衰減能力良好，毒性低，且體內(nèi)循環(huán)時間較長，在CT成像方面具有很大優(yōu)勢。因此，AuNP已被開發(fā)為CT檢查的有效對比劑[31]。

Chang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，將IONP作為表面涂層覆蓋在胎牛血清的蛋白質(zhì)上（實驗采用胎牛血清作為外泌體純化的生物測定分析物），并使用磁鐵捕獲和沉淀蛋白質(zhì)，可將溶液蛋白質(zhì)濃度降低至初始時的39.89%，從而達(dá)到外泌體純化目標(biāo)，且不會損壞外泌體。Azizi等[33]對暴露于NP的嗅鞘細(xì)胞進(jìn)行四甲基偶氮唑鹽（MTT）試驗，發(fā)現(xiàn)在不同NP濃度和不同NP培養(yǎng)時間的條件下，實驗組細(xì)胞性質(zhì)和活力與對照組并沒有顯著差異（P＞0.05），該結(jié)果表明NP對細(xì)胞存活和活力沒有不利影響，證實NP在嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)中的生物相容性和無毒性。Han等[34]為改善受損神經(jīng)元功能，將帶正電金納米顆粒（GNP）嵌入脊髓全切大鼠受損部位的胚胎脊髓源性神經(jīng)祖細(xì)胞（NPC）中，發(fā)現(xiàn)GNP不僅可以在體外促進(jìn)胚胎NPC的神經(jīng)元分化生長，而且可以誘導(dǎo)SCI大鼠受損神經(jīng)元恢復(fù)；嵌入GNP的NPC誘導(dǎo)SCI大鼠恢復(fù)運動功能的表現(xiàn)優(yōu)于單純NPC。上述研究均證實，NP在修復(fù)SCI和治療其他復(fù)雜的神經(jīng)損傷方面具有巨大潛力，因此負(fù)載MSC-Exo的NP有望成為治療SCI的可注射材料。

近年來，不少團(tuán)隊將金屬NP作為靶向載體，以磁鐵作為引導(dǎo)，將攜帶外泌體的金屬NP傳遞到靶細(xì)胞并發(fā)揮作用。Kim等[35]將IONP和MSC聯(lián)合制備IONP-外泌體納米囊泡（NV-IONP），發(fā)現(xiàn)外磁場不僅可以有效控制注入人體的IONP定位，而且可以增加NV-IONP內(nèi)各種治療性生長因子及其mRNA數(shù)量。NV-IONP通過磁引導(dǎo)到達(dá)損傷部位，發(fā)揮誘導(dǎo)血管生成、抗凋亡和抗炎作用，可以參與損傷脊髓修復(fù)，并顯著改善脊髓功能。

2.3 復(fù)合材料

復(fù)合材料是指由2種或2種以上不同理化特性的生物材料組合產(chǎn)生的新材料。用于SCI修復(fù)的可注射復(fù)合材料通常由嵌入水凝膠中的納米管/NP/納米纖維/微管制成。大量文獻(xiàn)表明，用于治療SCI的復(fù)合材料已得到廣泛研究，它們往往可以兼具2種及2種以上不同生物材料的理化性質(zhì)，因此具有獨特優(yōu)勢。

He等[36]構(gòu)建了一種由脫細(xì)胞脊髓細(xì)胞外基質(zhì)凝膠（DSCG）和明膠水凝膠（GelMA）組成的新型復(fù)合支架，該復(fù)合支架具有優(yōu)化的生物活性成分和有利的微結(jié)構(gòu)，能夠提供雙重仿生微環(huán)境，可以促進(jìn)經(jīng)血來源的MSC（MenSC）的黏附、增殖和分化，并完全橫斷SCI大鼠損傷間隙。該研究結(jié)果表明，復(fù)合支架與MenSC聯(lián)合應(yīng)用可以減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)元分化，并改善運動表現(xiàn)。Haggerty等[37]研究發(fā)現(xiàn)，負(fù)載MSC的納米纖維水凝膠復(fù)合物（NHC）可以使SCI部位由促炎環(huán)境向抗炎環(huán)境轉(zhuǎn)變，與負(fù)載MSC的磷酸鹽緩沖液（PBS）組相比，負(fù)載MSC的NHC組大鼠在損傷后有更多巨噬細(xì)胞極化為促再生表型，傷后8周時損傷范圍減小，星形膠質(zhì)細(xì)胞增多，軸突增多。Chen等[15]將聚乙烯醇（PVA）與硫化鉬/氧化石墨烯（MoS/GO）納米材料結(jié)合，制備出一種生物相容性、柔軟性良好且兼?zhèn)涓邔?dǎo)電性和高抗炎活性的復(fù)合水凝膠，并證實該水凝膠可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育，從而有助于運動功能恢復(fù)。

在諸多相關(guān)研究中，研究者選用不同材料進(jìn)行制備的復(fù)合材料很多。除上述材料外，還有自組裝多肽（SAP）以及各種類型的生物材料支架等。SAP是指通過親水性和疏水性氨基酸交替排列或正負(fù)電荷氨基酸有序排列設(shè)計，可以依據(jù)溫度和pH變化自互補(bǔ)組裝形成的納米纖維水凝膠支架，其優(yōu)點是能夠搭載更多細(xì)胞或藥物，但缺點也十分明顯，即成本過高。在大多數(shù)已有研究中，研究對象常以納米材料復(fù)合水凝膠、生物支架等復(fù)合形式發(fā)揮作用，它們在治療SCI時均保有個性化優(yōu)勢，因此探索穩(wěn)定、有效、低成本的載體是有待實現(xiàn)的下一個目標(biāo)。負(fù)載外泌體的復(fù)合材料療法為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的有效治療提供了一種有前途的策略。

3 結(jié)語

盡管多種可注射生物材料在臨床工作中早已廣泛應(yīng)用，其安全性和穩(wěn)定性已得到保障，但在聯(lián)合外泌體有效治療SCI方面仍有待完善。未來的研究方向之一可能是優(yōu)化可注射材料的生產(chǎn)，包括避免材料因溶脹不受控導(dǎo)致繼發(fā)性損傷、在材料制備過程中更精確地模擬ECM成分和機(jī)械性能及配合病灶進(jìn)行性能調(diào)控等。許多團(tuán)隊在此項研究中已經(jīng)取得較為明顯的進(jìn)展。目前用于SCI治療的負(fù)載MSC-Exo可注射生物材料的臨床試驗尚未取得滿意結(jié)果[38]，有效修復(fù)SCI的研究工作任重道遠(yuǎn)。Koffler等[39]開發(fā)了微尺度連續(xù)投影打印的方法，可以制造出能與嚙齒動物損傷脊髓相契合的三維仿生水凝膠支架，能夠?qū)崿F(xiàn)突觸再傳遞并顯著改善神經(jīng)功能。這項研究或許將成為未來研究的熱點之一。