兒童再生障礙性貧血異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后免疫重建的臨床研究

游紅亮, 湯苗苗, 李歡歡, 劉玉峰, 王 叨

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒童醫(yī)院血液腫瘤科, 河南 鄭州 450052)

再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)是兒童常見的骨髓衰竭性疾病,多認(rèn)為其發(fā)病機制為自身免疫系統(tǒng)紊亂引起的造血功能減低,異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)是治療本病的重要方法。移植后免疫功能的重建是影響預(yù)后的重要因素,且與移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)及感染的發(fā)生有著密切的關(guān)系[1]。目前關(guān)于兒童再生障礙性貧血移植后免疫功能重建的報道較少,本研究通過回顧性分析移植后患兒外周血淋巴細(xì)胞亞群變化,探討免疫重建規(guī)律,并分析其與急性GVHD(aGVHD)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料:回顧性分析2017年12月至2019年12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒童醫(yī)院血液干細(xì)胞移植中心行allo-HSCT 34例AA患兒,其中男性20例,女性14例；中位年齡8歲(1.8～14歲),輸血依賴AA 2例,重型AA 14例,極重型AA 18例,診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[2]。供受者HLA配型：5/10相合15例,6/10、7/10相合各1例,9/10相合4例,10/10相合13例,同胞全相合11例,無關(guān)全相合2例。移植前排除移植禁忌癥,詳細(xì)告知患兒家屬移植風(fēng)險,并簽署知情同意書。采用簡單隨機抽樣的方法選擇同期我院門診體檢的15例健康兒童為對照組,其中男9例,女6例,中位年齡7歲(1～13歲)。研究方案經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),征得患兒家屬同意并簽署知情同意書。

1.2移植方式及預(yù)處理方案:15例采用骨髓聯(lián)合外周血干細(xì)胞輸注,19例單用外周血干細(xì)胞。預(yù)處理采用白舒非(Bu)+氟達(dá)拉濱(Flu)+環(huán)磷酰胺(CTX)+兔抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白(ATG)：Bu0.8mg·kg-1·d-1,-7d、-6d；Flu 40mg·m2·d-1、CTX 600mg·m2·d-1及ATG 3mg·kg-1·d-1為 -5d、-4d、-3d、-2d。供者干細(xì)胞動員采用粒細(xì)胞刺激因子5～10μg·kg-1·d-1,q12h,皮下注射,共5～6d,于動員第5天開始采集供者骨髓液或外周血干細(xì)胞。

1.3aGVHD的診斷與預(yù)防:aGVHD的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[3],應(yīng)用環(huán)孢素(CsA)+短程甲氨蝶呤(MTX)+霉酚酸酯(MMF)預(yù)防aGVHD,具體為：CsA 3mg·kg-1·d-1,-3d開始靜脈滴注,胃腸道恢復(fù)后改為口服5～8mg·kg-1·d-1,維持在血藥濃度150ng～250ng/mL,根據(jù)病情逐漸調(diào)整劑量；短程MTX +1d 15mg/m2,+3d、+6d、+11d 10mg/m2；MMF 25～30mg·kg-1·d-1,-3d開始口服,至移植后30～60d。發(fā)生aGVHD時,應(yīng)用甲潑尼龍、環(huán)磷酰胺、抗CD25單抗及間充質(zhì)干細(xì)胞等。

1.4隨訪及淋巴細(xì)胞亞群檢測:隨訪至2020年6月,中位隨訪時間549d(3d～1112d),分析移植后患兒淋巴細(xì)胞亞群變化及發(fā)生aGVHD情況,分為無aGVHD組和有aGVHD組,比較兩組淋巴細(xì)胞亞群有無差異。MultiSET四色免洗制備外周血淋巴細(xì)胞亞群樣本,采用流式細(xì)胞儀式(FACS Calibur流式細(xì)胞儀,美國BD公司)檢測移植后第1、3、6、12個月時外周血淋巴細(xì)胞亞群比例,15例健康兒童的淋巴細(xì)胞亞群作為對照組。

2 結(jié) 果

2.1移植后aGVHD發(fā)生及生存情況:5例未獲得造血重建,29例造血重建成功。中性粒細(xì)胞計數(shù)>0.5×109L-1的植入中位時間為12.6d(7d～20d)及血小板>20×109L-1的植入中位時間為11d(4d～23d)。13例患兒發(fā)生了aGVHD,其中5例Ⅲ～Ⅳ度,8例為Ⅰ～Ⅱ度。皮膚排異I度5例、Ⅱ度1例、Ⅲ度4例,腸道排異Ⅰ度1例、Ⅱ度1例、Ⅲ度4例、Ⅳ度1例,肝臟排異Ⅰ度3例、Ⅲ度1例。至隨訪結(jié)束,存活24例,總生存率為70.59%。死亡10例,其中因aGVHD死亡2例,膿毒血癥4例,心力衰竭、重癥肺炎、腦出血及消化道出血各1例。

2.2與正常對照組相比淋巴細(xì)胞亞群變化:CD3+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞比例在移植后移植后第1、3、6、12個月均高于健康對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),并呈逐漸下降趨勢。CD4+細(xì)胞比例、CD4+/CD8+在移植后第1、3、6、12個月均低于于健康對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),并呈逐漸上升趨勢。B細(xì)胞比例在移植后第1、3、6個月均低于健康對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),并呈逐漸上升趨勢,在移植后第12個月與健康對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。NK細(xì)胞比例在移植后第1個月高于健康對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其后與健康對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(見表1)。

表1 allo-HSCT術(shù)后患兒與正常對照組淋巴細(xì)胞亞群對比

*P<0.05

2.3無aGVHD組與有aGVHD組相比淋巴細(xì)胞亞群變化:無aGVHD組與有aGVHD組相比,CD3+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞比例在移植后第1、3個月較低,NK細(xì)胞比例較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CD4+細(xì)胞比例、CD4+/CD8+、B細(xì)胞比例兩組間在移植后第1、3個月無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。在移植后6個月時兩組淋巴細(xì)胞亞群中除CD4+細(xì)胞比例在無aGVHD組與有aGVHD組相比較高外(P<0.05),其他均無明顯差異。在移植后12個月時兩組淋巴細(xì)胞亞群相比均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 無aGVHD組與有aGVHD組的淋巴細(xì)胞亞群對比

*P<0.05

3 討 論

預(yù)防aGVHD與感染是造血干細(xì)胞移植成功的關(guān)鍵,而移植后免疫功能的重建與兩者密切相關(guān)。HSCT后患兒免疫功能的恢復(fù)是動態(tài)變化的過程,各淋巴細(xì)胞亞群的變化又各有自己的規(guī)律,密切觀察移植后免疫重建的過程有重要的臨床意義。

我們研究顯示CD3+細(xì)胞比例在移植后第1個月時即恢復(fù)且高于正常水平(P<0.05),之后逐漸下降,移植后12個月時仍高于正常水平,CD8+細(xì)胞比例呈現(xiàn)同樣的規(guī)律。而CD4+細(xì)胞比例雖呈逐漸上升趨勢,但恢復(fù)較慢,移植后12個月時仍未至正常水平(P<0.05),造成CD4+/CD8+長期倒置,說明早期CD3+細(xì)胞中以CD8+細(xì)胞為主。Ingham等[4]研究顯示CD8+細(xì)胞在移植后3～6個月即可恢復(fù)正常水平,而CD4+細(xì)胞重建可長達(dá)1～2年,與本研究結(jié)果相似。移植后T細(xì)胞免疫重建主要有外周T淋巴細(xì)胞的擴增和供者T祖細(xì)胞在胸腺內(nèi)的發(fā)育成熟。有研究表明CD8+細(xì)胞增殖可不完全依賴胸腺功能,CD4+細(xì)胞卻依賴胸腺[5]。在移植前患兒均接受較強的化療,可造成胸腺功能不同程度的損傷,影響胸腺依賴途徑細(xì)胞的增殖,從而造成CD8+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞恢復(fù)時間的不同,出現(xiàn)移植后CD4+/CD8+長期倒置。有研究發(fā)現(xiàn)角質(zhì)細(xì)胞生長因子具有保護(hù)胸腺細(xì)胞和促進(jìn)其修復(fù)的作用[6],前體T細(xì)胞輸注也可增加胸腺細(xì)胞數(shù)量和供體的嵌合率[7],但目前臨床應(yīng)用處于探索階段。

NK細(xì)胞比例恢復(fù)較快,在移植后第1個月即高于健康對照組(P<0.05),在3個月時降至正常范圍,此后保持穩(wěn)定,與報道相似[8]。B細(xì)胞比例在移植后長期低于健康對照組(P<0.05),至移植后12個月時才達(dá)到正常范圍。有文獻(xiàn)報道B細(xì)胞在移植后不僅數(shù)量增長緩慢,且缺乏成熟B細(xì)胞的的功能,對CD4+T細(xì)胞依賴的抗體反應(yīng)長期不能恢復(fù),從而導(dǎo)致移植后患兒體液免疫缺陷,需間斷輸注丙種球蛋白加強支持。

aGVHD是多種免疫細(xì)胞和炎癥因子相互作用的結(jié)果,是移植后重要的并發(fā)癥。本組患兒中13例患兒發(fā)生了aGVHD,其中5例Ⅲ～Ⅳ度,8例為Ⅰ～Ⅱ度。無aGVHD組與有aGVHD組相比,CD3+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞比例在移植后第1、3個月時較低,NK細(xì)胞比例較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CD4+細(xì)胞比例、CD4+/CD8+、B細(xì)胞比例在移植后第1、3個月無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。多數(shù)研究顯示CD8+細(xì)胞是引起aGVHD重要效應(yīng)細(xì)胞,而CD4+細(xì)胞中的Treg細(xì)胞可抑制過度的免疫反應(yīng),參與預(yù)防aGVHD的發(fā)生[9]。有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞計數(shù)與aGVHD的發(fā)生呈一定程度的負(fù)相關(guān),NK細(xì)胞數(shù)量較高時,aGVHD發(fā)生率越低[10]。有研究報道供者NK細(xì)胞在受者體內(nèi)激活后,可滅活受者體內(nèi)的抗原遞呈細(xì)胞,阻斷aGVHD的起始環(huán)節(jié),發(fā)揮抗aGVHD作用[11]。由于B細(xì)胞恢復(fù)較慢,因此在aGVHD中起到作用有限,但有研究顯示B細(xì)胞功能缺陷可能與慢性GVHD有關(guān)[12]。

綜上所述,再生障礙性貧血患兒接受造血干細(xì)胞移植術(shù)后CD3+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞及NK細(xì)胞重建較快,而CD4+細(xì)胞、B細(xì)胞恢復(fù)緩慢。較高的CD8+細(xì)胞及較低NK細(xì)胞比例是導(dǎo)致aGVHD重要因素。定期檢測移植后患兒的淋巴細(xì)胞亞群變化有助于了解免疫重建情況及預(yù)防aGVHD。