環(huán)巴胺對前列腺增生癥大鼠細胞增殖與凋亡的影響

朱文雄， 袁軼峰， 張 熙， 劉 濤， 李 博， 陳其華

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院， 湖南 長沙 4100072.湖南省第二人民醫(yī)院， 湖南 長沙 410007)

前列腺增生癥(Benign prostatic hyperplasia，BPH)是老年男性常見的泌尿道疾病[1]，引起下泌尿道癥狀，如尿頻、尿急、排尿等待、排尿無力、尿后余瀝不盡等，50歲以上男性發(fā)病率接近50%[2]，80歲以上男性發(fā)病率接近80%[3]。BPH病因目前尚未闡釋清楚，新近研究表明其發(fā)生與前列腺上皮、間質細胞增殖和凋亡比例失調關系密切。目前BPH的治療方案包括侵入性手術策略、微波熱療和藥理學治療。隨著α受體阻滯劑、5α還原酶抑制劑等藥物的應用，使得BPH的非手術治療成為可能。新近研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog(Hh)信號通路對胚胎發(fā)育、干細胞自穩(wěn)態(tài)、細胞分化、組織極化和細胞增殖等過程起著非常重要的調控作用，眾多增生性疾病、腫瘤發(fā)生都與該通路的異常密切相關。環(huán)巴胺(Cyclopamine)是一種強大的Hedgehog信號通路阻斷劑，近年來其對前列腺癌的治療作用越來越受到大家的關注[4]，但其對BPH的干預作用尚不明確。本研究于2020年6月至2021年5月通過構建BPH模型大鼠，觀察前列腺細胞增殖與凋亡情況，探討環(huán)巴胺對BPH的干預效果。

1 資料與方法

1.1動物:成年雄性SD大鼠，體重為400g～450g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2019-0006。

1.2主要試劑與儀器:環(huán)巴胺，F(xiàn)ERMENTEK公司。丙酸睪酮，華中藥業(yè)股份有限公司。蘇木素-伊紅，北京索萊寶科技有限公司。蛋白酶K，MB5088，大連美侖生物技術有限公司。枸櫞酸，F(xiàn)K-mL2089，上海樊克生物科技有限公司。TUNEL，ZK-8005，北京中杉金橋生物技術有限公司。DAB/H2O2顯色液，2014，Invitrogen，上海英駿生物技術有限公司。胎牛血清，F(xiàn)CS500，Excell Bio，上海依科賽生物制品有限公司。MTT溶液，GD-Y1317，上海古朵生物科技公司。二甲基亞砜，D2650，美國sigma公司。蔡司熒光顯微鏡，Axio Observer A1/D1/Z1，德國。自動酶標讀數(shù)儀，BS-1101，南京德鐵實驗設備有限公司。

1.3BPH大鼠模型的構建[5]:先按劑量40mg/kg采用腹腔注射2%戊巴比妥鈉的方式進行麻醉，對大鼠皮膚進行消毒，在無菌環(huán)境下經(jīng)陰囊摘除雙側睪丸。術后大鼠恢復7d，于第8天選取已去勢且狀態(tài)恢復較好的模型大鼠，每天按劑量4mg/kg皮下注射丙酸睪酮(將丙酸睪酮溶于植物油中)，持續(xù)30d。

1.4分組、給藥與標本獲取:將造模成功的30只BPH大鼠隨機分為模型組(BPH組)和環(huán)巴胺組(Cyclopamine組)，未造模的15只大鼠為正常對照組(Normal組)。Cyclopamine組大鼠按劑量50mL/Kg腹腔注射10μmoL/L環(huán)巴胺，1次/d，連續(xù)7d；Normal組和BPH組大鼠腹腔注射等劑量生理鹽水，1次/d，連續(xù)7d。給藥結束后，CO2處死大鼠，獲得各組大鼠前列腺組織，對每組大鼠進行以下指標的測定。用分析天平測前列腺組織濕重，用容積法測各組大鼠前列腺體積，測前列腺指數(shù)(PI)，PI=前列腺濕重/體重。所有動物實驗均經(jīng)過相關倫理委員會的批準。

1.5前列腺組織HE染色:取右側頭葉和腹葉前列腺，10%福爾馬林固定24h，常規(guī)沖水，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片厚5μm，45℃攤片，撈片，60℃烘烤1h后二甲苯脫蠟。水化后常規(guī)蘇木精-伊紅染色，再經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后在蔡司熒光顯微鏡下觀察前列腺組織病理學變化。

1.6TUNEL法檢測前列腺細胞的凋亡:將前列腺組織切片放入3% H2O2，室溫孵育10min，蒸餾水洗3次，2min/次；蛋白酶K(20μg/mL)37℃消化30min，PBS洗滌3次，2min/次；室溫下與3% H2O2作用5min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS洗滌3次，2min/次；加入含0.1% TritonX-100的0.1%枸櫞酸混合液，置冰上4min，PBS洗滌3次，2min/次；加50μL TUNEL混合液，37℃反應1h，PBS洗滌3次，2min/次；DAB/H2O2顯色液室溫作用5min，水洗終止反應，蘇木素復染，脫水、透明、封片。光學顯微鏡下隨機采集5個非重疊視野，觀察凋亡小體(apoptotic body)，檢測100個角膜組織中的TUNEL陽性細胞數(shù)，取其平均值。凋亡陽性率以單位面積內(nèi)凋亡細胞數(shù)占細胞總數(shù)百分比表示。本實驗重復三次。

1.7前列腺細胞的提取、培養(yǎng):取大鼠的前列腺組織，前列腺每葉各取部分，D-Hanks液清洗2次后剪碎，去除肉眼可見的大血管組織，用2%胰蛋白酶室溫消化前列腺各葉30min，離心后用0.06% Ⅱ型膠原酶室溫消化15min，過濾，取濾液加上皮細胞培養(yǎng)液混勻，接種于包被有纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每48～72h換液1次。培養(yǎng)液為上皮細胞培養(yǎng)液，加入10%胎牛血清，添加體積比為1∶100的胰島素-轉鐵蛋白-硒添加物、0.5μg/L β-內(nèi)皮細胞生長因子ECGF，100×103U/L青霉素和鏈霉素雙抗。取前列腺移行帶組織按上述方法處理，提取培養(yǎng)前列腺間質細胞。

1.8MTT法檢測前列腺細胞增殖:取對數(shù)生長期的前列腺上皮細胞和間質細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基制備成2.5×105個/mL的細胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板。根據(jù)實驗分組，每組各設8孔，每孔100μL，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1d、2d、3d、4d、5d時取出培養(yǎng)板，每孔加入5g/L MTT溶液10μL繼續(xù)培養(yǎng)4h后，將每孔中的上清液吸出，在無光的環(huán)境下每孔加100μL二甲基亞砜，輕輕振蕩混勻10min，使其充分溶解由活細胞產(chǎn)生的甲瓚晶體，加入自動酶標讀數(shù)儀490nm處測定各孔吸光度(OD)值。每次實驗重復3次，以時間點為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞活力曲線圖。

1.9統(tǒng)計學分析:所有數(shù)據(jù)均應用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件進行處理，計量資料采用均值±標準差的形式表示，兩組間比較為t檢驗，多組間的比較應采用單因素方差分析。兩變量相關性采用Pearson相關性分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1各組大鼠前列腺組織濕重、體積、前列腺指數(shù):三組大鼠前列腺組織濕重、體積、前列腺指數(shù)如表1所示。與Normal組相比，BPH組和Cyclopamine組濕重、體積及前列腺指數(shù)顯著升高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。Cyclopamine組與BPH組相比，Cyclopamine組濕重、體積及前列腺指數(shù)顯著降低，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表1 各組大鼠前列腺組織濕重體積前列腺指數(shù)

2.2前列腺組織病理學檢查結果:前列腺組織HE染色結果如圖1顯示：Normal組樣本光鏡下可見腺上皮細胞排列整齊，多呈單層柱狀或立方型，分泌物少，表面光滑，腺上皮細胞核圓形，位于基底部，核仁明顯，腺體大小一致、排列清晰，腺腔無擴張；BPH組樣本光鏡下可見腺上皮呈乳頭狀增生同時向腺腔內(nèi)突出，呈現(xiàn)為鋸齒狀，腺上皮細胞呈高柱狀、復層，間質和血管擴張，伴隨出現(xiàn)充血、水腫，腺體數(shù)量多，排列密集，部分腺體擴張，腺腔變大；Cyclopamine組樣本光鏡下腺上皮細胞多為單層柱狀，間質和血管擴張充血、水腫較輕，小部分腺腔變大，腺體少數(shù)增生，排列整齊，少部分呈乳頭狀突入腔內(nèi)。

圖1 前列腺組織病理學觀察(HE染色×400)

2.3TUNEL法檢測前列腺細胞凋亡結果:TUNEL染色在光學顯微鏡下的觀察結果如表2、圖2所示：與Normal組相比，BPH組和Cyclopamine組凋亡小體表達率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與BPH組相比，Cyclopamine組凋亡小體表達率明顯上升(P<0.05)，說明環(huán)巴胺能上調前列腺增生中凋亡小體的表達。

圖2 TUNEL法染色結果及凋亡小體表達率注：A：TUNEL染色(×400)；B：凋亡小體表達率結果。與Normal組比較，*P<0.05；與BPH組比較，#P<0.05。

表2 各組大鼠前列腺細胞凋亡情況

2.4MTT法測前列腺上皮和間質細胞增殖能力結果:MTT法測前列腺間質和上皮細胞的結果如表3及圖3A-B所示，前列腺間質細胞增殖能力的變化(圖3A)；上皮細胞增殖能力的變化(圖3B)。與Normal組相比，BPH組和Cyclopamine組細胞增殖速率明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與BPH組相比，Cyclopamine組細胞增殖速率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明環(huán)巴胺能夠抑制前列腺間質和上皮細胞的增殖，降低其細胞增殖速率。細胞計數(shù)法記錄前列腺中間質和上皮細胞的細胞數(shù)量的變化(表4及圖3C-D)。三組細胞中的間質細胞和上皮細胞的變化與MTT法測細胞增殖的變化趨勢基本一致。

表3 各組大鼠前列腺上皮和間質細胞增殖情況

表4 各組大鼠前列腺上皮和間質細胞增殖情況

圖3 MTT法測細胞增殖能力及細胞計數(shù)法測細胞數(shù)量

3 討 論

BPH被認為是老年男性最常見的疾病之一，其病理特點為平滑肌以及前列腺過渡區(qū)內(nèi)的上皮細胞增殖。是一種簡單的微小結節(jié)性增生，并逐漸發(fā)展成為肉眼可見的結節(jié)性腫大，并且還可引起尿路癥狀[6]。由于BPH的發(fā)病機制不甚明了。目前BPH的治療包括經(jīng)尿道前列腺切除術，藥物治療和植物療法等[7]。在BPH的研究探索過程中，一些學者提到BPH是上皮和前列腺間質之間由胚胎誘導的相互作用重新喚醒的結果，上皮細胞和間質細胞被發(fā)現(xiàn)在BPH的發(fā)病中具有重要意義[8]。

刺猬蛋白(Hedgehog)是指在胚胎發(fā)育期間首次在果蠅中檢測到的一組蛋白質[9]。Hedgehog信號通路被證實是在胚胎組織構建過程中組織細胞增殖和分化的重要參與者，能夠導致腫瘤侵襲和轉移，該信號通路一旦被激活就可以對包括前列腺癌、胰腺癌和胃癌在內(nèi)的疾病的發(fā)生以及發(fā)展產(chǎn)生積極影響。有研究報道了前列腺癌中Hedgehog信號通路的激活[10]。此前，大量研究建立了環(huán)巴胺和Hedgehog信號通路之間的密切聯(lián)系[11]。作為Hedgehog信號通路的抑制劑，環(huán)巴胺在抑制前列腺癌和提高生存率方面起著至關重要的作用[12]，其能特異性地與膜蛋白受體Smo結合，抑制該蛋白的活性，從而阻斷Hedgehog信號向核轉錄因子Gli及下游靶基因傳導。前列腺癌和BPH同屬前列腺細胞過度增殖性疾病，而Hedgehog信號通路在前列腺細胞的生長中已經(jīng)被證明是正調節(jié)劑和增殖刺激物。因此我們認為環(huán)巴胺很可能能夠抑制前列腺細胞的增生。為了了解它在調節(jié)BPH中的功能和作用，本研究探索了環(huán)巴胺對BPH大鼠前列腺上皮和間質細胞增殖與凋亡的影響。

研究結果表明，環(huán)巴胺能夠降低BPH大鼠的前列腺濕重、體積和前列腺指數(shù)，且對前列腺增生組織的病理形態(tài)有改善作用。就BPH的病理特征而言，通常可以觀察到過渡區(qū)以及尿道周圍區(qū)域內(nèi)的上皮和纖維肌肉組織的結節(jié)性過度生長。腺體增生和間質增生都可以促進前列腺體積和重量的增加。BPH模型大鼠確實顯示了較高的前列腺體積和濕重，再結合HE染色結果，我們考慮環(huán)巴胺可能可以抑制BPH。我們的研究還顯示，環(huán)巴胺能夠抑制BPH大鼠前列腺組織的細胞增殖和促進細胞凋亡。盡管發(fā)病機理不明確，但BPH的發(fā)展與間質和上皮細胞凋亡的減少密切相關。在前列腺細胞的生長中，Hedgehog信號通路已經(jīng)被證明是正調節(jié)劑和增殖刺激物。一旦被環(huán)巴胺抑制，Hedgehog信號通路可導致更多細胞凋亡，引發(fā)間質和上皮細胞總量的下降，從而阻抑BPH的進展。因此，我們認為環(huán)巴胺能夠減少BPH大鼠前列腺上皮和間質細胞的增殖并促進細胞的凋亡，其通過阻斷Hedgehog信號通路抑制BPH進展的具體機制還有待進一步的研究去闡明。環(huán)巴胺具有較強的抑制BPH細胞增殖和促進細胞凋亡的作用，但費用目前較為昂貴、給藥方式比較單一、毒副作用尚不明確，其發(fā)展成為一種治療BPH的新藥還有很長的路要走。