外源性植物激素對鹽膚木葉片次生代謝產(chǎn)物及其抗氧化活性的影響①

胡克特，張萍，陳榮祥，3，李林，顧丁

1.遵義醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，貴州 遵義 563000；2.遵義市附屬第三醫(yī)院核醫(yī)學科，貴州 遵義 563000；3.遵義市理化分析測試工程技術(shù)研究中心，貴州 遵義 563000

鹽膚木(RhuschinensisMills)為漆樹科鹽膚木屬落葉小喬木，是我國重要的林業(yè)經(jīng)濟植物[1]，其莖和根常用于制作中藥[2-3]，我國重要的中藥材五倍子也是由癭綿蚜科某些昆蟲寄生于其中幾種植物復葉上而形成的癭瘤[4]． 五倍子所含酚酸類物質(zhì)是一種具有諸多用途的天然產(chǎn)物，常被用作醫(yī)療與水產(chǎn)漁業(yè)[5-7]，具有抗氧化、抗輻射、抗腫瘤等生物活性[8-10]，其中主要成分沒食子酸具有改善腦缺血再灌注損傷，改善心衰引起的心功能障礙和纖維化的功效[11-12]． 然而，目前五倍子酚酸獲取途徑比較單一，即主要是用五倍子提?。?近年來，由于自然環(huán)境遭到破壞而導致自然生長的蟲癭越來越少，從而使五倍子的產(chǎn)量越發(fā)降低，進而無法滿足市場的需求[13]． 較五倍子而言，鹽膚木葉片則相對資源豐富且易于獲得，因其中也含有一定量的五倍子酚類化合物[14-16]而具有較大的潛在價值． 隨著對植物蟲癭的研究，發(fā)現(xiàn)蟲癭的形成與植物激素有關[17]，前期研究發(fā)現(xiàn)五倍子與鹽膚木中內(nèi)源植物激素存在顯著差異，并有研究發(fā)現(xiàn)噴施赤霉酸(GA3)能夠使五倍子體積增大[18]，那么能否通過噴施外源性植物激素直接提高鹽膚木葉片的多酚質(zhì)量分數(shù)呢？通常酚類化合物的質(zhì)量分數(shù)在五倍子(含倍花)中是鹽膚木葉片的5～13倍[19]，倘若噴施外源性植物激素能提高鹽膚木葉片的沒食子酸等質(zhì)量分數(shù)，即可從葉片中提取其有用化合物，從而使多酚的獲取擺脫對倍蚜和五倍子的依賴，進而促進我國酚酸化合物相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展． 此外，還將為植物酚類代謝的相關研究提供參考． 為此，筆者初步研究了外源性植物激素對鹽膚木葉片次生代謝產(chǎn)物積累的影響，以期尋求一條替代從五倍子中獲取酚酸的途徑，并探究其抗氧化活性改變的情況，以及外源性植物激素主要調(diào)控何種鹽膚木次生代謝產(chǎn)物而影響其抗氧化性，以期發(fā)現(xiàn)其更多的應用價值．

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

紫外可見分光光度儀(Lambda265)，鉑金埃爾默儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱(GZX-9070MBE)，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；超高效液相色譜儀(UltiMate 3000 Bio—RS型)，賽默飛世爾科技有限公司；萬分之一電子天平(ME104/2)，梅特勒-托利多；純水及超純水系統(tǒng)(Chorus)，英國埃爾格．

無水乙醇(95%)，成都市科隆化學品有限公司；福林酚，飛凈生物科技有限公司；生長素 3-吲哚乙酸(IAA，CAS：87-51-4，純度≥98%)，細胞分裂素N-6-芐基腺嘌呤(BA，CAS：12-14-39-7，純度≥98%)，赤霉酸(GA3，CAS：77-06-5，純度≥90%)，北京綠澤森生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈、檸檬酸(色譜純)、沒食子酸標準品、無水碳酸鈉、DPPH自由基、ABTS二銨鹽、過硫酸鉀，阿拉丁生化科技股份有限公司．

1.2 實驗方法

1.2.1 植物材料及其處理

采用完全隨機實驗設計，使用IAA，6-BA，GA33種激素處理鹽膚木葉片，每種激素處理設置3個濃度梯度10，30，50 mg/L，再以混合激素處理設置同一濃度，即采用植物激素IAA，6-BA，GA3，其濃度為IAA 50 mg/L+6-BA 10 mg/L，IAA 50 mg/L+GA310 mg/L，6-BA 10 mg/L+GA310 mg/L，IAA 50 mg/L+6-BA 10 mg/L+GA310 mg/L；以乙醇溶液處理為對照(CK)共計14個處理． 先將植物激素溶解于95%的無水乙醇中，再用蒸餾水分別稀釋至所需濃度，其中酒精濃度為5%．

2020年6月23日9：00(天氣晴)，使用各處理溶液各100 mL噴施葉片，共噴施5 d，單次組合共計噴施500 mL，在第6 d采集葉片，之后每隔5 d采集1次葉片，共采集4次，采集時間為早上9：00，采集完畢立即帶回實驗室105 ℃殺青備用，然后于60 ℃烘干．

1.2.2 多酚提取

精確稱取0.1 g鹽膚木葉片粉末，采用80%甲醇溶液超聲提取多酚． 提取條件：料液比為1∶100(g/mL)，在16 ℃水中超聲提取50 min，冷卻，取1 mL于EP管中在12 000 r/min離心10 min，取上清，然后0.22 μm濾膜過濾．

1.2.3 多酚測定

提取方法參照1.2.2，然后稀釋10倍，采用福林法[20]，取樣品液0.5 mL，加入0.25 mol/L 福林酚試劑0.5 mL，混合靜置3 min，加入15% Na2CO31 mL混合靜置30 min，12 000 r/min，離心10 min，取上清，以未加樣品的對照組為空白，測定760 nm處的吸光度，建立沒食子酸標準曲線，將吸光度帶入公式計算沒食子酸標準品濃度：

Y=17.611X+0.002

式中，Y為吸光度，X為沒食子酸標準品濃度．

1.2.4 抗氧化性對比

酚類物質(zhì)是鹽膚木葉片中主要的抗氧化成分，而多酚濃度與抗氧化性存在正相關，故將總酚相對質(zhì)量分數(shù)最多組設為A組，空白組設為B組，使用3種抗氧化性實驗比較其抗氧化活性是否存在顯著差異，并以此探究其多酚質(zhì)量分數(shù)是否真正發(fā)生改變．

1.2.4.1 對DPPH自由基的清除

參考文獻[21]，取DPPH 1 mg，與有機溶劑定容至25 mL，混合震蕩可得濃度為0.04 mg/mL的母液． 取2 mL母液，設置濃度梯度加入樣品液并補加有機溶劑定容至1 mL，室溫反應30 min，于517 nm處測定吸光度(A)，空白以1 mL有機溶劑代替樣品液，計算清除率(I)：

I/%=(1-A試樣/A空白)×100%

式中，A試樣為樣品液的吸光度值，A空白為空白組的吸光度值．

1.2.4.2 對ABTS自由基的清除

參考文獻[22]，取ABTS二銨鹽3 mg溶于0.8 mL雙蒸水與1 mg過硫酸鉀溶于1.5 mL蒸餾水中，暗反應氧化12 h，稀釋30倍可得母液，取母液2 mL，與設置好濃度梯度的樣品液1 mL暗反應30 min，于734 nm處測定吸光度，空白以1 mL有機溶劑代替樣品，計算清除率(I)．

1.2.4.3 鐵還原能力

參考文獻[23]，以多酚濃度為x軸，吸光度為y軸，在593 nm處測定吸光度，比較不同處理鹽膚木葉片的多酚鐵還原能力．

1.2.5 對A組和B組進行多酚及類黃酮測定

采用色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm × 100 mm ，1.8 μm)；流動相條件：50 mmol/L檸檬酸鹽溶液(pH值為2.9)與甲醇，按以下梯度洗脫：0～14.5 min，10%～35%檸檬酸鹽溶液；之后采用40% 檸檬酸鹽沖洗2 min后回到初始梯度并平衡4 min，柱溫30 ℃，進樣體積1 μL，DAD檢測波長為275 nm．

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2003，SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，prism 8軟件作圖，每次測量均重復3次．

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線繪制

根據(jù)不同沒食子酸標準品濃度下，對應吸光度的測定結(jié)果繪制標準曲線如圖1，線性回歸方程為Y=17.611X+0.002，R2=0.999 7，其中Y為吸光度，X為沒食子酸標準品濃度．

2.2 噴施不同植物激素對鹽膚木葉片多酚的影響

不同種類及濃度激素處理后鹽膚木多酚質(zhì)量分數(shù)結(jié)果見圖2． 由圖2d中可知，與對照組相比，3種激素混合組顯著提高了葉中多酚的質(zhì)量分數(shù)(p<0.05)，見效較快． 計算得出在處理15 d時出現(xiàn)了最大增長率，持續(xù)時間長，在噴施后10～15 d都有不錯的效果，其余促進效果依次為IAA+6-BA，IAA+GA3，GA3+6-BA，其中GA3+6-BA組合在5 d內(nèi)為抑制，5 d后為促進．

圖2a中，高濃度IAA(50 mg/L)顯著提高了葉中多酚的質(zhì)量分數(shù)(p<0.05)，見效較快；隨著IAA濃度增高，多酚質(zhì)量分數(shù)隨著增高，在15 d時增長最顯著(p<0.05)，在第20 d，10 mg/L和30 mg/L與對照相比差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)．

圖2b中，中等濃度6-BA(30 mg/L)顯著提高了葉中多酚的質(zhì)量分數(shù)(p<0.05)，見效快；在處理第10 d時增長達到極值，10 mg/L組和50 mg/L組在5 d時與對照差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)． 在10 d時多酚質(zhì)量分數(shù)提高，其中10 mg/L組持續(xù)時間較長，在10～15 d均有不錯的效果． 在第20 d，3種濃度梯度與對照差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)．

圖2c中，中等濃度GA3(30 mg/L)顯著提高了葉中多酚的質(zhì)量分數(shù)(p<0.05)，見效較快；在15 d時增長達到峰值，僅在第10 d效果不如50 mg/L組，3種濃度均有較好的促進鹽膚木葉中多酚質(zhì)量分數(shù)的效果．

*表示p<0.05，差異有統(tǒng)計學意義．

2.3 抗氧化分析比較

由2.2結(jié)論選擇第15 d全噴組為A，第15 d對照組為B進行抗氧化分析和比較．

2.3.1 DPPH自由基清除能力

由圖3可以看出，鹽膚木葉質(zhì)量濃度在20～120 mg/L 時與DPPH自由基清除率成正相關，IC50表示半清除率，即A組IC50為49.70 mg/L，B組IC50為79.90 mg/L，A組DPPH清除率明顯高于B組，即可推測A組多酚質(zhì)量分數(shù)高于B組．

圖3 不同質(zhì)量濃度對DPPH的清除作用

2.3.2 ABTS自由基清除能力

由圖4可以看出，鹽膚木粉末質(zhì)量濃度在2～12 mg/L時與ABTS自由基清除率成正相關，A組IC50為2.15 mg/L，B組IC50為4.77 mg/L，可以推測A組多酚質(zhì)量分數(shù)高于B組．

圖4 不同質(zhì)量濃度對ABTS的清除作用

2.3.3 鐵離子還原能力

FRAP法的原理是抗氧化劑將Fe3+還原成Fe2+，其與FRAP試劑結(jié)合，在593 nm處具有最大吸收峰，吸光度越大，鐵離子還原性越好． 由圖5可以看出，多酚質(zhì)量濃度在20～100 mg/L之間與鐵離子還原能力成正相關，可以推測A組多酚質(zhì)量分數(shù)高于B組．

圖5 不同質(zhì)量濃度對Fe3+的還原能力

3次抗氧化實驗均顯示A，B兩組具有顯著的抗氧化性，A組抗氧化能力顯著高于B組，可推測A組多酚質(zhì)量分數(shù)高于B組，與2.2結(jié)果相符．

2.4 A，B組的主要次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量分數(shù)測定及分析

為探究植物激素促進了何種酚類化合物的合成，并使鹽膚木葉抗氧化性增強，筆者采用超高效液相色譜對提取物進行檢測，結(jié)果見表1，分離出的鹽膚木主要成分見圖6．

表1 實驗組與對照組鹽膚木樣品中化合物質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果

結(jié)果顯示鹽膚木葉中共檢測出6種主要成分，除沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯外，其余成分均有顯著增高，其中根皮苷、沒食子酸質(zhì)量分數(shù)增高較為顯著，也即是指混合植物激素主要是通過提高根皮苷與沒食子酸質(zhì)量分數(shù)增加其抗氧化性，而噴施混合植物激素對沒食子酸甲酯和沒食子酸乙酯的影響不大．

1為沒食子酸；2為沒食子酸甲酯；3為表沒食子兒茶素沒食子酸酯；4為沒食子酸乙酯；5為表兒茶素沒食子酸酯；6為根皮苷

圖6 標準品與樣品色譜圖

3 結(jié)論與討論

本研究通過直接測量與間接比較表明，IAA，6-BA，GA3具有促進鹽膚木酚類化合物積累的效果，并且受到激素種類、激素濃度和處理時間等因素的影響． 在本實驗條件下，IAA，6-BA，GA3的最適宜質(zhì)量濃度分別為50，30，30 mg/L；相比對照組，多酚最高增長率分別出現(xiàn)在第15，10，15 d，3種激素混合能達到更好的效果，其抗氧化性得到顯著提高，具有一定的應用意義．

不同植物激素之間的相互調(diào)節(jié)，在植物生長發(fā)育中起著關鍵作用． IAA的主要作用是促進細胞伸長、誘導和促進細胞分化[24]． 本研究結(jié)果表明，不同濃度的IAA均能夠提高鹽膚木葉的多酚質(zhì)量分數(shù)，其中高濃度的IAA(50 mg/L)是較適宜的濃度，此濃度在噴施5～20 d均有不錯的效果． 在使用Qtrap 6500質(zhì)譜儀發(fā)現(xiàn)五倍子中的IAA是葉片中的7.48倍，說明植物保持高水平的IAA有助于酚酸物質(zhì)的積累． 6-BA屬于人工合成細胞分裂素，在次生代謝產(chǎn)物的合成和積累以及應激反應過程中發(fā)揮著重要的作用[25]． 本實驗結(jié)果表明中等質(zhì)量濃度的6-BA(30 mg/L)是提高鹽膚木葉多酚質(zhì)量分數(shù)的適宜濃度，在5～15 d的鹽膚木多酚質(zhì)量分數(shù)顯著增高，其中原因可能是中等濃度的6-BA溶液提高了葉片中細胞分裂素的水平，抑制并清除了自由基，增強了光合作用[26]． 有研究表明6-BA有助于提高沙棗愈傷組織中縮合鞣質(zhì)的積累[27]． GA3是能夠加速細胞分裂與生長、促進植物生長、抑制植物器官衰老的植物生長調(diào)節(jié)劑[28]． 本實驗結(jié)果表明，不同濃度的GA3各采樣時間的鹽膚木葉多酚質(zhì)量分數(shù)均有不同程度的提升，以30 mg/L效果最佳． GA3已被證實是生長素運輸所必須的激素[29]，另有研究表明GA3能促進丹參毛狀根中多酚的積累[30]，并且GA3在其懸浮培養(yǎng)細胞中也能促進酚類化合物的形成[31]，與本研究結(jié)果相符．

本研究通過直接測量多種植物激素刺激下鹽膚木葉多酚質(zhì)量分數(shù)并且通過3種抗氧化實驗加以驗證，即噴施激素組酚酸質(zhì)量分數(shù)高于對照組，表明適當?shù)耐庠葱灾参锛に赜兄谔岣啕}膚木葉片的次生代謝物質(zhì)量分數(shù)，其中沒食子酸為五倍子中的主要成分，這可能使“噴施外源性植物激素提高鹽膚木葉片的酚酸質(zhì)量分數(shù)，并直接從葉片中提取酚類化合物，從而使酚類的獲取擺脫對倍蚜和蟲癭的依賴”的設想得以實現(xiàn)，進而有利于促進我國酚類化合物相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展；同時，還將為植物次生代謝及提高抗氧化性的相關研究提供新的思路． 進一步研究發(fā)現(xiàn)以根皮苷、沒食子酸及其衍生物為首的類黃酮及多酚類化合物受植物激素影響變化較大． 在既往的研究中[32-34]，根皮苷與沒食子酸具有良好的抗氧化性及藥用價值，希望此研究能為類似研究提供參考． 本研究初步確定了對鹽膚木葉片噴施外源性植物激素能提高酚酸質(zhì)量分數(shù)，但后續(xù)還需在理論方面弄清植物激素與鹽膚木葉片酚酸積累之間的關系及其機制．