基于轉(zhuǎn)錄組的油茶DHHC型鋅指蛋白基因家族的鑒定及分析

徐嘉娟，朱亞艷，李 芳，許 杰，王 港

(貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽(yáng) 550005)

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(posttranslational modification)與其穩(wěn)定性和生理功能的正確行使息息相關(guān)[1-3]。棕櫚酰化修飾是眾多翻譯后修飾形式中最常見(jiàn)且可逆的脂質(zhì)修飾類型，影響著蛋白質(zhì)的疏水性、穩(wěn)定性與活性，從而在蛋白質(zhì)定位、轉(zhuǎn)運(yùn)及蛋白互作等方面發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[4-5]，其可逆性增加了對(duì)底物蛋白調(diào)控的動(dòng)態(tài)性和精確性[6]，最終影響蛋白質(zhì)的各種生理功能。蛋白質(zhì)棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(protein s-acyltransferases，PATs)和棕櫚酰硫酯酶2種相反類型的酶動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)棕櫚?；揎梉7]。研究表明多數(shù)DHHC型鋅指蛋白家族成員具有PAT活性，該家族是一類富含DHHC-CRD(半胱氨酸富集域)的蛋白，具有C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)特征，在不同物種間具有遺傳保守性，高度保守的DHHC-CRD(C-X2-C-X9-HC-X2-C-X2-C-X4-DHHC-X5-C-X4-N-X3-F，X為非保守氨基酸)殘基是酶活性的關(guān)鍵決定位點(diǎn)[6,8-9]。

蛋白質(zhì)棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(PAT)最早發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母中，A.F.Rothetal[10]發(fā)現(xiàn)酵母DHHC型鋅指蛋白Akr1p具有PAT活性，對(duì)維持酵母細(xì)胞形態(tài)具有重要作用。研究表明棕櫚?；揎椩谡婧松镏猩婕皬V泛的細(xì)胞功能[11-12]。對(duì)植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)植物中存在大量的棕櫚?；鞍?，涉及植物的生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成、脅迫響應(yīng)等眾多生命活動(dòng)[13]。異三聚體G蛋白是一種非常重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分，參與細(xì)胞分裂、病原體防御、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程，在擬南芥中，其靶向質(zhì)膜需要依賴棕櫚?；揎梉14]。ROP是高等植物體內(nèi)廣泛存在的一類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)G蛋白，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)、激素應(yīng)答等方面具有重要調(diào)控作用，其亞細(xì)胞定位情況與棕櫚?；揎椕芮邢嚓P(guān)[15]。CDPK蛋白和CBL蛋白參與植物鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)，棕櫚酰化修飾在其生物功能的正確行使過(guò)程中具有重要作用[16-17]。

油茶(Camelliaoleifera)為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)常綠灌木或小喬木，是我國(guó)重要的木本食用油料樹種[18-19]。目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)油茶DHHC型鋅指蛋白基因家族的研究報(bào)道。本研究基于不同結(jié)實(shí)量的油茶葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在轉(zhuǎn)錄組水平上挖掘油茶DHHC型鋅指蛋白基因，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，為后期深入、系統(tǒng)地研究DHHC型鋅指蛋白基因家族在油茶生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成、逆境響應(yīng)等過(guò)程中所發(fā)揮的調(diào)控功能提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為種植于貴州省玉屏縣茶花泉油茶基地的盛產(chǎn)期長(zhǎng)林23號(hào)普通油茶無(wú)性系(氣候、種植條件一致)，選取生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致而結(jié)實(shí)量差異較大的單株，在抽梢期、花芽分化期、果實(shí)成熟期分別采集植株中上部的葉片，取樣后液氮速凍-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DHHC型鋅指蛋白基因家族鑒定 普通油茶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由本團(tuán)隊(duì)測(cè)序獲得(相關(guān)數(shù)據(jù)未發(fā)表)，共拼接組裝獲得275 805個(gè)unigenes。利用Phytozome12基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載模式植物擬南芥和水稻的DHHC型鋅指蛋白基因序列，將其作為探針序列，利用本地Blast軟件在油茶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中進(jìn)行blast搜索比對(duì)。同時(shí)，利用關(guān)鍵詞“protein S-acyltransferase”和“DHHC”進(jìn)行直接檢索，去除重復(fù)序列，篩選出油茶DHHC型鋅指蛋白家族基因，利用SMART和CCD對(duì)蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定，剔除不含DHHC型鋅指蛋白基因家族特征結(jié)構(gòu)域的基因。

1.2.2 DHHC型鋅指蛋白基因家族的生物信息學(xué)分析 對(duì)篩選出的油茶DHHC型鋅指蛋白基因，利用Expasy Prot Param等生物信息學(xué)軟件對(duì)其蛋白基本理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行分析(表1)。

表1 基因生物信息學(xué)分析軟件Table 1 Gene bioinformatics analysis software

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶DHHC型鋅指蛋白基因家族的鑒定

通過(guò)對(duì)油茶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的本地blast比對(duì)檢索和關(guān)鍵詞搜索，共獲得63條DHHC型鋅指蛋白基因序列，通過(guò)SMART和CCD對(duì)保守結(jié)構(gòu)域的篩選，獲得23個(gè)具有完整DHHC型鋅指結(jié)構(gòu)的序列。為方便研究，按照轉(zhuǎn)錄組unigene中的基因ID大小順序統(tǒng)一編號(hào)(CoDHHC1～23)(表2)。分離得到的23個(gè)DHHC型鋅指蛋白基因大小為731(CoDHHC1)～2 994 bp(CoDHHC17)。利用Expasy ProtParam對(duì)DHHC型鋅指蛋白基因家族編碼的氨基酸進(jìn)行理化性質(zhì)分析，23個(gè)基因編碼蛋白的氨基酸數(shù)量為194～725 aa。預(yù)測(cè)的理論分子量大小為 21.89～78.44 ku。等電點(diǎn)大小為5.18～10.01，其中只有3個(gè)CoDHHC蛋白等電點(diǎn)小于7，顯酸性，其余20個(gè)CoDHHC蛋白等電點(diǎn)均大于7，顯堿性，表明不同的DHHC蛋白在不同的微環(huán)境中生物學(xué)功能存在差異。不穩(wěn)定指數(shù)分析表明，有10個(gè)CoDHHC蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白，其余13個(gè)CoDHHC蛋白為穩(wěn)定蛋白。平均疏水指數(shù)為-0.541～0.503，其中10個(gè)CoDHHC蛋白的平均疏水指數(shù)大于0，為疏水性蛋白，其余13個(gè)蛋白為親水性蛋白。

表2 油茶DHHC型鋅指蛋白基因家族信息Table 2 DHHC gene family information of C.oleifera

亞細(xì)胞定位分析表明，CoDHHC1等14個(gè)蛋白在細(xì)胞核中有分布，CoDHHC4等5個(gè)蛋白在細(xì)胞膜中有分布，而CoDHHC6和CoDHHC22在高爾基體中有分布，在細(xì)胞核中也有分布，CoDHHC16和CoDHHC18在細(xì)胞膜中有分布，在細(xì)胞核中也有分布?？偟膩?lái)說(shuō)，CoDHHC蛋白的氨基酸序列及蛋白特性變化均存在一定差異，表明油茶DHHC型鋅指蛋白基因家族蛋白具有不同特性。

2.2 油茶DHHC型鋅指蛋白保守結(jié)構(gòu)域和基序分析

通過(guò)NCBI的CCD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CoDHHC基因家族編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，23個(gè)CoDHHC均含有DHHC型鋅指蛋白家族典型的DHHC-CRD(半胱氨酸殘基聚集域)結(jié)構(gòu)域，多數(shù)成員同時(shí)還含有DPG和TTxE(x為任意氨基酸)結(jié)構(gòu)域，與具有蛋白質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白所特有的結(jié)構(gòu)域相符。其中CoDHHC1/4/5/6/9/11/12/13/14/17/18/19/23同時(shí)含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，占油茶CoDHHC基因家族總數(shù)的56.52%，CoDHHC2/16/22只含有DPG和DHHC結(jié)構(gòu)域，CoDHHC3/7/8/15只含有DHHC和TTxE結(jié)構(gòu)域，而CoDHHC10/20/21僅含DHHC結(jié)構(gòu)域(表2，圖1)。

利用在線軟件MEME5.1.1分析CoDHHC蛋白中的保守基序(圖2、圖3)，結(jié)果表明，23個(gè)油茶DHHC基因家族成員之間所包含的保守基序(motif)數(shù)目及種類存在一定的差異，其中CoDHHC10只含有motif 1和motif 3這2個(gè)保守基序。所有CoDHHC蛋白成員均含有motif 1，19個(gè)成員含有motif 2，19個(gè)成員含motif 3。4個(gè)成員含motif 4，5個(gè)成員含motif 5，5個(gè)成員含motif 6，20個(gè)成員含motif 7，4個(gè)成員含motif 8，4個(gè)成員含motif 9，4個(gè)成員含motif 10，2個(gè)成員含motif 11，2個(gè)成員含motif 12，2個(gè)成員含motif 13，4個(gè)成員含motif 14，5個(gè)成員含motif 15，2個(gè)成員含motif 16，2個(gè)成員含motif 17，4個(gè)成員含motif 18，3個(gè)成員含motif 19，3個(gè)成員含motif 20。出現(xiàn)頻率越高的motif在油茶DHHC型鋅指蛋白基因家族中越重要，如出現(xiàn)頻率較高的motif 1和motif 3組成DHHC型鋅指蛋白家族的特征結(jié)構(gòu)域(DHHC-CRD)。

2.3 油茶DHHC型鋅指蛋白基因家族進(jìn)化關(guān)系分析

為更好地了解油茶DHHC型鋅指蛋白基因家族各成員之間的進(jìn)化關(guān)系以及生物學(xué)功能的相關(guān)性，利用MEGA7軟件對(duì)篩選的23個(gè)油茶DHHC型鋅指蛋白基因家族成員和擬南芥及水稻的DHHC型鋅指蛋白基因家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果表明，23個(gè)油茶DHHC型鋅指蛋白可以劃分為4個(gè)亞組，每個(gè)亞組均有油茶、擬南芥和水稻分布，GroupⅠ包含有2個(gè)DHHC型鋅指蛋白基因家族成員，占家族總數(shù)的8.70%；GroupⅡ包含有8個(gè)成員，占家族總數(shù)34.78%；GroupⅢ包含6個(gè)成員，占家族總數(shù)總數(shù)的26.09%；GroupⅣ包含有7個(gè)成員，占家族總數(shù)30.43%。其中第Ⅱ亞族的CoDHHC7和CoDHHC8的同源性最高，第Ⅲ亞族的CoDHHC5、CoDHHC12、CoDHHC14的同源性較高，第Ⅳ亞族的CoDHHC13、CoDHHC18、CoDHHC22的同源性較高?？偟膩?lái)說(shuō)進(jìn)化關(guān)系較進(jìn)的CoDHHC其氨基酸長(zhǎng)度和蛋白結(jié)構(gòu)較相似。

2.4 油茶DHHC型鋅指蛋白基因家族的表達(dá)分析

利用課題組的油茶葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，找到候選的23個(gè)DHHC型鋅指蛋白基因?qū)?yīng)轉(zhuǎn)錄本的RPKM值，采用Heml熱圖軟件進(jìn)行熱圖制作(圖5)。結(jié)果顯示，23個(gè)DHHC型鋅指蛋白基因在結(jié)實(shí)量大和結(jié)實(shí)量小的單株的不同發(fā)育時(shí)期的葉片中均有不同程度的表達(dá)。CoDHHC9、CoDHHC13、CoDHHC22在油茶抽梢生長(zhǎng)期的葉片中表達(dá)上調(diào)，CoDHHC6、CoDHHC12、CoDHHC18、CoDHHC23在花芽分化時(shí)期和果實(shí)成熟時(shí)期的葉片中表達(dá)量較高，而CoDHHC5、CoDHHC11、CoDHHC15在不同時(shí)期的葉片中表達(dá)量均較低。CoDHHC3、CoDHHC10在果實(shí)成熟時(shí)期即盛花期的葉片中表達(dá)上調(diào)，且在結(jié)實(shí)量小的單株葉片中的表達(dá)較結(jié)實(shí)量大的單株上調(diào)明顯。

3 結(jié)論與討論

基于不同結(jié)實(shí)量的普通油茶葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出23個(gè)DHHC型鋅指蛋白基因，利用生物信息學(xué)分析方法對(duì)其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行分析。結(jié)果表明，23個(gè)CoDHHC蛋白均包含1個(gè)保守的DHHC-CRD結(jié)構(gòu)域，主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜中，大部分蛋白具有4個(gè)跨膜區(qū)。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)23個(gè)DHHC型鋅指蛋白與擬南芥和水稻均有不同程度的同源關(guān)系。它們?cè)诮Y(jié)實(shí)量大和結(jié)實(shí)量小的單株的不同發(fā)育時(shí)期葉片中均有不同程度的表達(dá)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步對(duì)油茶DHHC型鋅指蛋白家族基因的克隆和功能分析奠定了基礎(chǔ)。

近年來(lái)，隨著越來(lái)越多物種全基因組測(cè)序的完成，多個(gè)物種已從基因組水平鑒定到DHHC型鋅指蛋白基因，該家族成員在不同的物種中數(shù)量也不盡相同。其中小立碗蘚(Physcomitrellapatens)中包含9個(gè)；裸子植物火炬松(Pinustaeda)中包含13個(gè)；擬南芥(Arabidopsisthaliana)中包含24個(gè)，水稻(Oryzasativa)有58個(gè)，楊樹(Populustrichocarpa)有39個(gè)，玉米(Zeamays)有50個(gè)；雙子葉植物苜蓿(Medicagotruncatula)中包含9個(gè)，馬鈴薯(Solanumlycopersicum)有24個(gè)[20]。本研究鑒定得到的23個(gè)DHHC型鋅指蛋白基因序列，均含有DHHC蛋白家族典型的DHHC-CRD(C-X2-C-X9-HC-X2-C-X2-C-X4-DHHC-X5-C-X4-N-X3-F，X為非保守氨基酸)結(jié)構(gòu)域，大部分序列還包含1個(gè)DPG和TTxE結(jié)構(gòu)域及4個(gè)跨膜區(qū)，與具有蛋白質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(PAT)活性的蛋白質(zhì)所特有的結(jié)構(gòu)域相符，可能具有PAT活性，通過(guò)棕櫚酰化修飾在油茶生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)等過(guò)程中起重要調(diào)控作用。而部分序列如CoDHHC3缺少DPG結(jié)構(gòu)域且只包含2個(gè)跨膜區(qū)，因其序列長(zhǎng)度可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域和基序的缺失，這可能是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序或序列拼接過(guò)程中的誤差所導(dǎo)致[21-22]。

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，23個(gè)油茶DHHC型鋅指蛋白基因和擬南芥、水稻的DHHC蛋白基因被分為4個(gè)亞類，其與擬南芥和水稻的DHHC型鋅指蛋白基因均具有不同程度的同源性，可能與DHHC-CRD結(jié)構(gòu)域在不同物種間具有較高的遺傳保守性有關(guān)。CoDHHC6、CoDHHC12、CoDHHC18、CoDHHC23在結(jié)實(shí)量較小的單株的花芽分化時(shí)期和果實(shí)成熟時(shí)期的葉片中表達(dá)量較結(jié)實(shí)量較大的單株中的表達(dá)量明顯上調(diào)，可能與結(jié)實(shí)量較小的單株開花數(shù)量較多而結(jié)實(shí)量大的單株花朵數(shù)量較少有關(guān)，說(shuō)明這些基因可能參與花芽分化及花朵發(fā)育過(guò)程。而CoDHHC3、CoDHHC10只在果實(shí)成熟時(shí)期的葉片中表達(dá)上調(diào)，而這一時(shí)期油茶正處于盛花期，因此它們可能參與花朵發(fā)育。Q.Wangetal[23]對(duì)擬南芥中20個(gè)DHHC型鋅指蛋白基因的組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，AtPAT7(At3g26935)在花、成熟果莢、莖中有表達(dá)，在花中的表達(dá)量較其他組織高。徐嘉娟等[8]研究表明，LcPAT7在鵝掌楸花芽和盛花期的葉片、葉芽、花瓣、雄蕊、雌蕊中均有表達(dá)，在花瓣和雌蕊中表達(dá)豐度最高。而與AtPAT7遺傳距離較近的CoDHHC6、CoDHHC18在花芽分化時(shí)期和盛花期葉片中表達(dá)上調(diào)，表明它們可能發(fā)揮相似的功能。

研究表明，PATs在真核生物中具有廣泛的細(xì)胞功能，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成、生殖發(fā)育及脅迫響應(yīng)等生命活動(dòng)具有重要的調(diào)控作用。P.A.Hemsleyetal[13]從擬南芥突變體中分離得到的DHHC型鋅指蛋白基因TIPl與酵母的AKR1p高度相似性，且存在PAT活性，參與擬南芥根毛的發(fā)育及細(xì)胞的極性生長(zhǎng)；研究發(fā)現(xiàn)，AtPAT10(At3g51390)能夠調(diào)節(jié)CBLs蛋白在液泡膜的定位，它的功能缺失會(huì)導(dǎo)致擬南芥葉片變小、變矮并且不育，同時(shí)還參與植株對(duì)外界鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程[6]。水稻OsDHHC1具有PAT活性，可促進(jìn)水稻分蘗、構(gòu)建合理株型，從而增加水稻的產(chǎn)量[24]；而OsDHHC13能促進(jìn)清除H2O2的相關(guān)酶基因表達(dá)，調(diào)節(jié)內(nèi)源性H2O2的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)水稻的抗氧化脅迫能力起正調(diào)控作用[25]。PATs功能的發(fā)掘?yàn)橹参镏晷蜆?gòu)建、增產(chǎn)增收以及品質(zhì)改良等分子設(shè)計(jì)育種工作提供了新的研究思路和基因資源。本研究利用生物信息學(xué)手段從序列同源性和結(jié)果相似性方面探討了油茶DHHC型鋅指蛋白基因家族的生物學(xué)功能，而它們?cè)谟筒枭L(zhǎng)發(fā)育、逆境信號(hào)響應(yīng)等過(guò)程中的具體功能還有待系統(tǒng)深入的研究。