獼猴桃褪綠環(huán)斑相關病毒RT-LAMP-LFD可視化檢測方法的建立

鄒佳伶， 彭期定， 王韻茹， 席德慧

(四川大學生命科學學院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室， 成都 610065)

1 引 言

獼猴桃是獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLindl.)的多年生落葉木質(zhì)藤本經(jīng)濟林樹種，其果實營養(yǎng)價值較高，含有豐富的維生素C和有機酸等，已成為我國重要的園藝農(nóng)產(chǎn)品[1,2].四川省是我國獼猴桃的主要產(chǎn)區(qū)之一，其栽培面積和產(chǎn)量居全國前列，基本形成了秦巴山-龍門山脈的獼猴桃產(chǎn)業(yè)帶[3-5].近年來，隨著我國獼猴桃種植面積的增加，病毒病害在獼猴桃等園藝作物中發(fā)生普遍，對獼猴桃生長和產(chǎn)量的影響也逐漸凸顯，已成為威脅獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[6,7].目前，國內(nèi)外約有19種感染獼猴桃的病毒被報道，其中，國內(nèi)的獼猴桃主要種植區(qū)共檢測到9種獼猴桃病毒[8,9]，獼猴桃褪綠環(huán)斑相關病毒(Actinidiachloroticringspot associated virus，AcCRaV)是2013年從我國獼猴桃樣品上首次被鑒定的負義單鏈RNA病毒，隸屬于無花果花葉病毒科(Fimoviridae)，歐洲山梣環(huán)斑病毒屬(Emaravirus)[10,11].AcCRaV在我國獼猴桃上的分布范圍較廣，湖北、陜西、安徽和四川等地區(qū)均有報道，檢出率為20%左右，癥狀大多表現(xiàn)為葉片褪綠、環(huán)斑和葉脈黃化等，潛在風險仍不明確[12,13].因此，建立高效和快捷的AcCRaV檢測方法對病毒病害的防治和早期預警，具有十分重要的意義.

目前，針對AcCRaV的檢測方法主要為反轉錄-聚合酶鏈式反應(Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)[6]，多重RT-PCR(Multiplex RT-PCR)和小RNA深度測序等[10-12]，這些檢測方法靈敏性和特異性較高，在一定程度上有助于病毒的檢測和識別，但也存在著檢測成本高，需要特定的儀器設備或者耗時費力等限制條件[14-16].近年來，一種在恒溫條件下實現(xiàn)快速擴增的逆轉錄-環(huán)介導等溫擴增技術(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)已被廣泛應用到植物RNA病毒的快速檢測中[17,18].LAMP檢測基于靶基因的6個區(qū)域設計4～6條特異引物，30～60 min即可完成擴增反應，同時，通過觀察產(chǎn)物混濁程度或加入核酸染料后的顏色變化等可判定擴增效果，但肉眼評估顏色或渾濁度的變化存在一定的誤差，影響檢測結果的可靠性[19，20].近期，LAMP結合橫向流動試紙條(Lateral flow dipstick，LFD)的檢測方法在一定程度上能減少檢測結果假陽性的現(xiàn)象，該方法已在水產(chǎn)微生物、食品微生物和植物病原菌的檢測中得到廣泛應用[20].LFD檢測方法，利用生物素(Biotin，BIO)標記的LAMP擴增產(chǎn)物與異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的探針形成雜交產(chǎn)物，根據(jù)雜交產(chǎn)物和LFD中FITC抗體標記的膠體金形成復合物，通過抗體捕獲和膠體金免疫層析技術，在試紙條上產(chǎn)生顏色變化來判斷檢測結果，具有快速、靈敏以及結果可視化等特點[21].

本研究將RT-LAMP與LFD檢測方法結合，根據(jù)AcCRaV的外殼蛋白基因(Coat Protein，CP)序列設計了LAMP檢測的特異性引物，通過擴增條件和反應體系的優(yōu)化，建立了最佳擴增體系；同時，對LAMP引物進行BIO和FITC標記，建立了RT-LAMP-LFD的檢測方法，使檢測結果可視化，為AcCRaV的快速檢測和獼猴桃病毒病害防控提供一種新的檢測手段.

2 材料與方法

2.1 試驗材料

2016年至2019年，本實驗組分別從四川不同地區(qū)采集獼猴桃(Actinidiaspp.)疑似病毒感染葉片樣品及健康葉片樣品，所有樣品均保存于-80 ℃冰箱備用.經(jīng)RT-PCR鑒定含有柑橘葉斑駁病毒(Citrusleaf blotch virus，CLBV)、獼猴桃褪綠環(huán)斑相關病毒(Actinidiachloroticringspot-associated virus，AcCRaV)、獼猴桃病毒1(Actinidiavirus 1，AcV-1)以及獼猴桃病毒A(Actinidiavirus A，AcVA)的獼猴桃樣品作為實驗對照，由本實驗室保存[12].

實驗相關試劑包括：Bst DNA聚合酶，MgSO4(100 mmol/L)以及dNTPs(10 mmol/L)購自New England Biolabs公司；HybriDetect橫向流動試紙條試劑盒(MGHD1)購自Milenia biotec公司；1000×SYBRGreen Ⅰ 核酸染液購自Solarbio公司.

2.2 方 法

2.2.1 RT-LAMP及RT-PCR引物的設計 根據(jù)GenBank中的AcCRaV的基因序列，以AcCRaV的外殼蛋白核苷酸序列為目標基因，通過DNAMAN V6進行多重序列比對，選擇序列相對保守的區(qū)域作為引物設計的靶基因序列，如圖1所示.利用在線引物設計軟件Primer Explorer V5 (http://primer explorer.jp/e/)進行LAMP引物的設計，比較各組引物的GC含量和引物末端穩(wěn)定性等因素，選擇合適的LAMP擴增引物.為實現(xiàn)擴增產(chǎn)物結果的可視化，將引物FIP和BIP的5′末端分別用生物素(Biotin)和異硫氰酸熒光素(FITC)進行標記，同時，RaV-F/R引物用于常規(guī)RT-PCR檢測，上述引物和修飾引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，LAMP引物序列信息如表1所示.

圖1 AcCRaV的RT-LAMP引物在外殼蛋白基因序列的位置箭頭表示外引物(F3, B3)，正向內(nèi)引物FIP (F1c + F2)，反向內(nèi)引物BIP (B1c + B2)的位置和方向Fig.1 Position of the designed RT-LAMP primers in coat protein gene of AcCRaV

表1 獼猴桃褪綠環(huán)斑相關病毒的RT-LAMP 和RT-PCR引物序列信息Tab.1 List of primers used for detection of AcCRaV by RT-LAMP and RT-PCR in this study

2.2.2 總RNA提取及cDNA合成 獼猴桃葉片樣品經(jīng)液氮研磨后，根據(jù)CTAB法用于提取獼猴桃樣品總RNA[4，12]，總RNA濃度和質(zhì)量使用Nano Photometer P-330(Implen GmbH，Munich，Germany)測定，選擇濃度大于0.1μg / μL的總RNA用于后續(xù)試驗.以提取的總RNA為模板逆轉錄合成cDNA，反應體系為20 μL，參照PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA合成試劑盒(TaKaRa, Dalian, China)完成cDNA的合成，并將產(chǎn)物存于-20 ℃?zhèn)溆?

PCR反應總體系為25 μL：含2×Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol / μL)各1 μL，cDNA 2 μL和ddH2O 8.5 μL PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)34次；72 ℃延伸5 min.

2.2.3 RT-LAMP擴增反應條件優(yōu)化 參照Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶推薦的擴增反應進行擴增，反應體系為25 μL，包括WarmStart DNA聚合酶 2.5 μL、Mg2+(100 mmol/L) 1.5 μL、dNTPs(10 mmol/L) 2.5 μL、F3/B3(10 μmol/L)各0.5 μL、FIP/BIP(10 μmol/L)各4 μL、擴增模板2 μL，加水補足至25 μL，60 ℃下恒溫反應1 h，擴增產(chǎn)物經(jīng)濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測.

為達到最佳的擴增效果，采用控制單一變量法，對LAMP擴增反應條件(Mg2+和dNTPs濃度，LAMP內(nèi)外引物比例，擴增溫度和擴增時間)進行優(yōu)化.dNTPs濃度優(yōu)化時，保持其他擴增條件不變，dNTPs反應終濃度設為0.2～1.0 mmol/L等5個濃度梯度, 以0.2 mmol/L依次遞增；在最佳dNTPs濃度下，Mg2+濃度設定為2～10 mmol/L等5個濃度梯度，以2 mmol/L依次遞增；內(nèi)外引物比(FIP/BIP: F3/B3)優(yōu)化時，使反應體系中外引物(F3和B3)終濃度保持0.2 μmol/L不變，內(nèi)外引物比例分別為1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1.得到LAMP擴增的最佳反應體系后，將恒溫擴增溫度設為56，57，58，59，60，61，62和63 ℃等8個溫度梯度，確定最佳反應溫度；在最佳反應體系和擴增溫度下，將擴增時間設為30，40，50，60，70和80 min等6個梯度，確定LAMP反應的最適擴增溫度.

2.2.4 RT-LAMP擴增產(chǎn)物檢測方法 RT-LAMP擴增產(chǎn)物可通過2%的瓊脂糖凝膠電泳、加入核酸染料判斷染色變化以及橫向流動試紙條檢測等3種方式對擴增結果進行分析[8].瓊脂糖凝膠電泳檢測利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果，出現(xiàn)梯度條帶則檢測結果為陽性，沒有條帶產(chǎn)生則檢測結果為陰性(圖2a).核酸染料檢測通過在反應產(chǎn)物中加入0.5 μL SYBR Green Ⅰ(10 000×)核酸染料，混勻后觀察溶液顏色變化，有擴增產(chǎn)物生成則溶液顏色為綠色，沒有產(chǎn)物生成溶液顏色為橙色(圖2b).側向流動試紙條(LFD)檢測時，3 μL反應產(chǎn)物添加到裝有100 μL的HybriDetect分析緩沖液的離心管中，放入橫向流動試紙條，孵育5 min，若試紙條的檢測線(Test line)和質(zhì)控線(Control line)均出現(xiàn)明顯條帶，則有擴增產(chǎn)物生成；僅在質(zhì)控線上有明顯條帶則檢測結果為陰性，沒有擴增產(chǎn)物生成(圖2c).

圖2 RT-LAMP產(chǎn)物的三種檢測方法(a) 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；(b) 添加SYBR Green Ⅰ后的檢測結果；(c) LFD檢測結果； M：DNA marker DL 5000；1：陽性結果；2：陰性對照Fig.2 Three detection methods for the production of RT-LAMP

2.2.5 RT-LAMP-LFD特異性測定 在最佳RT-LAMP反應體系下，分別以本實驗室保存的被CLBV、AcCRaV、AcVA和AcV-1的陽性獼猴桃樣品為模板，進行RT-LAMP擴增，反應結束后，分別進行瓊脂糖凝膠電泳，加入核算染料SYBR Green I和LFD三種方法來評價RT-LAMP的檢測特異性.

2.2.6 RT-LAMP-LFD的靈敏性評價 為評價建立的RT-LAMP的檢測靈敏性，提取感染了AcCRaV的獼猴桃葉片樣品總RNA，經(jīng)IMPLEN超微量分光光度計進行濃度測試，將反轉錄后的cDNA按10倍梯度稀釋法稀釋至10-8，以系列稀釋的cDNA為模板，進行RT-PCR和RT-LAMP擴增反應.分別進行瓊脂糖凝膠電泳，加入核算染料SYBR Green Ⅰ和LFD三種方法，評價RT-LAMP的檢測的靈敏性.

2.2.7 RT-LAMP-LFD檢測方法的應用 為評估建立的RT-LAMP-LFD檢測方法在田間獼猴桃中的檢測效果，分別對疑似病毒侵染的獼猴桃樣品進行RT-LAMP和普通RT-PCR檢測，普通RT-PCR 體系檢測選用引物為RaV F/R.RT-LAMP反應完成后，分別以瓊脂糖凝膠電泳和LFD檢測方法對產(chǎn)物結果進行判斷.

3 結果與分析

3.1 RT-LAMP檢測AcCRaV最佳反應體系的建立

為獲得最佳的檢測效果，對擴增反應的dNTPs和Mg2+濃度，內(nèi)引物(FIP/BIP)和外引物(F3/B3)濃度比以及反應溫度和時間進行優(yōu)化，結果如圖3所示.在dNTPs濃度優(yōu)化中，低濃度0.2 mmol/L下，擴增產(chǎn)物沒有梯形條帶產(chǎn)生，加入熒光染料后顏色為橙色；當dNTPs濃度在0.4～1.0 mmol/L時，擴增產(chǎn)物清晰且明顯，加入熒光染料后顏色變?yōu)樯罹G色；當dNTPs濃度為0.8 mmol/L時，擴增產(chǎn)物形成的梯狀電泳條帶比其他濃度下更清晰，明亮，因此0.8 mmol/L的dNTPs為最佳濃度(圖3a).對Mg2+濃度的優(yōu)化中，隨著Mg2+濃度的增加，電泳檢測形成的梯形條帶逐漸清晰，當濃度為6～8 mmol/L時，擴增產(chǎn)物條帶清晰明亮，擴增效率較高，因此，選擇Mg2+的反應濃度為6 mmol/L(圖3b).在內(nèi)外引物濃度比例(FIP/BIP: F3/B3)優(yōu)化中，當內(nèi)外引物濃度比為1∶1和2∶1時，擴增產(chǎn)物條帶較弱，內(nèi)外引物濃度比為5∶1時，擴增效果最佳，因此，最適內(nèi)外引物濃度比例為5∶1(圖3c).

相關的研究報道表明，適宜的擴增溫度和反應時間與DNA聚合酶的活性和反應的穩(wěn)定性相關[18]，對擴增溫度的優(yōu)化結果表明：擴增溫度為56～58 ℃時，電泳后沒有梯形條帶產(chǎn)生，且加入熒光染料后顏色為橙色；溫度為59～61 ℃時，電泳中擴增產(chǎn)物條帶逐漸清晰；擴增溫度為62 ℃時，條帶最清晰，明亮，因此，最佳擴增溫度為62 ℃(圖3d).為縮短檢測時間，對RT-LAMP反應時間進行優(yōu)化，結果如圖3e所示，反應時間過短，沒有梯形條帶產(chǎn)生，當反應時間在60 min及其以上時，擴增產(chǎn)物的趨于穩(wěn)定，電泳產(chǎn)生的梯形條帶清晰且明亮，加入熒光染料后顏色均呈現(xiàn)綠色，因此，檢測AcCRaV的最佳反應時間為60 min.

圖3 RT-LAMP檢測AcCRaV的反應條件優(yōu)化(a)：dNTPs濃度；(b)：MgSO4濃度；(c)：內(nèi)外引物濃度比例(FIP/BIP: F3/B3)；(d)：反應溫度；(e)：反應時間；M：DNA marker DL 5000；N：陰性對照(無菌ddH2O為模板)Fig.3 Optimization of RT-LAMP reaction conditions in detection of AcCRaV

3.2 RT-LAMP檢測AcCRaV的特異性

為評價RT-LAMP-LFD檢測方法的特異性，以CLBV，AcCRaV，AcV-1和AcVA病毒感染樣品的cDNA為模板，進行RT-LAMP擴增反應.結果如圖4所示，以AcCRaV感染的獼猴桃樣品cDNA為模板時，F(xiàn)ITC標記的RT-LAMP擴增產(chǎn)物在LFD試紙條的檢測線和質(zhì)控線上均有明顯條帶，而其它樣品及陰性對照僅在質(zhì)控線上有條帶產(chǎn)生(圖4c).同樣地，瓊脂糖凝膠電泳結果與LFD試紙條結果一致，僅在AcCRaV感染樣品的擴增產(chǎn)物中有梯形電泳條帶生成，而陰性對照和CLBV，AcV-1和AcVA感染樣品的擴增產(chǎn)物中均沒有條帶產(chǎn)生(圖4a).并且，在擴增產(chǎn)物中加入SYBR Green I核酸染料后，發(fā)現(xiàn)AcCRaV感染樣品的RT-LAMP產(chǎn)物顏色變?yōu)榫G色，陰性對照和其它樣品擴增產(chǎn)物顏色為橙色(圖4b)，這表明，建立的RT-LAMP-LFD檢測方法對AcCRaV具有較好的特異性.

圖4 RT-LAMP-LFD檢測AcCRaV的特異性(a)：瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；(b)：添加SYBR Green Ⅰ后的檢測結果；(c)：LFD檢測結果；(d)：反應溫度；(e)：反應時間； (m)：DNA marker DL 5000；N：陰性對照(無菌ddH2O為模板)；1：CLBV；2：AcCRaV；3：AcVA；4：AcV-1Fig.4 Specificity of RT-LAMP-LFD assays in detecting AcCRaV

3.3 RT-LAMP-LFD檢測AcCRaV的靈敏度評價

為明確建立的RT-LAMP-LFD檢測方法對AcCRaV檢測的靈敏度，本實驗將AcCRaV感染的獼猴桃樣品cDNA進行10倍梯度稀釋(100～ 10-8)，以稀釋后的cDNA為反應模板，分別進行RT-LAMP 和RT-PCR擴增反應，通過凝膠電泳，添加核酸染料和橫向流動試紙條3種檢測方法判斷擴增結果.檢測結果表明，隨著模板稀釋倍數(shù)的增加，電泳生成的梯形條帶逐漸減弱，且在擴增產(chǎn)物中加入LFD試紙條后，檢測線的條帶也逐漸減弱，當稀釋倍數(shù)為10-7時，梯形條帶消失，LFD試紙條檢測線條帶消失(圖5a，5c)；在常規(guī)RT-PCR檢測中，當稀釋倍數(shù)為10-5時，無擴增條帶產(chǎn)生(圖5d).當稀釋倍數(shù)大于10-6時，在RT-LAMP的擴增產(chǎn)物中，加入核酸染料后顏色均為橙色(圖5b)，在擴增產(chǎn)物中加入LFD試紙條后，僅在質(zhì)控線上產(chǎn)生條帶，這表明稀釋倍數(shù)大于10-6均無擴增產(chǎn)物生成(圖5c)，以上結果表明，建立的RT-LAMP結合橫向流動試紙條檢測靈敏度比常規(guī)RT-PCR高100倍.

圖5 RT-LAMP和RT-PCR檢測AcCRaV的靈敏度比較(a)和(d)瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；(b)添加SYBR Green Ⅰ后的檢測結果；(c) LFD檢測結果；1～9：cDNA的不同稀釋倍數(shù)(100 ～10-8)；M：DNA marker DL 5000；N：陰性對照(無菌ddH2O為模板)Fig.5 Comparation of the sensitivity between RT-LAMP and RT-PCR in detecting AcCRaV

3.4 RT-LAMP-LFD檢測獼猴桃中AcCRaV的應用

為評估建立的RT-LAMP對田間獼猴桃樣品中AcCRaV檢測的可行性，利用建立的RT-LAMP-LFD檢測方法對15份獼猴桃樣品進行檢測，并同時采用常規(guī)RT-PCR驗證其準確性.結果如圖6所示，在常規(guī)RT-PCR檢測中，共有10份樣品受到了AcCRaV的侵染，其中4號和9號樣品條帶較弱(圖6c).在RT-LAMP檢測中，通過凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行分析，有8份樣品的擴增產(chǎn)物有明顯的梯形條帶，2份樣品擴增產(chǎn)物的梯形條帶較弱(圖6a).通過LFD試紙條檢測擴增產(chǎn)物時，有10份樣品在試紙條中產(chǎn)生兩條紅色條帶，其中，4號和9號樣品與凝膠電泳檢測結果相似，在試紙條中，控制線上的出現(xiàn)的條帶較弱(圖6b).以上結果表明，RT-LAMP結果與RT-PCR方法檢測結果一致，因此，建立的RT-LAMP結合橫向流動試紙條的檢測方法準確度高，可實現(xiàn)檢測結果的可視化.

圖6 RT-LAMP-LFD和RT-PCR檢測田間獼猴桃樣品(a)和(c)：瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；(b)： LFD檢測結果；1～15：田間獼猴桃樣品；M：DNA marker DL 5000；N：陰性對照(無菌ddH2O為模板)Fig.6 RT-LAMP-LFD and RT-PCR detection of kiwifruit samples in the field

4 討 論

獼猴桃是我國重要的園藝作物，其種植面積和年產(chǎn)量均超過世界其它地區(qū)獼猴桃種植面積和產(chǎn)量的總和[5].四川地區(qū)氣候溫和，種質(zhì)資源豐富，已成為我國獼猴桃的主要栽培區(qū)[4，8].在獼猴桃病毒病的調(diào)查和種類鑒定中，相關研究表明病毒病害在獼猴桃中發(fā)生普遍，在中華獼猴桃(Actinidiachinensis)、美味獼猴桃(Actinidiadeliciosa)以及軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta)等多種獼猴桃栽培品種中均有病毒感染的現(xiàn)象[7，9，13].獼猴桃褪綠環(huán)斑相關病毒在我國主要獼猴桃種植區(qū)均有侵染獼猴桃的相關報道，本研究組在四川獼猴桃中也檢測到了該病毒，且在田間存在著多種病毒復合感染獼猴桃的現(xiàn)象[6，10，12].目前，隨著高精度檢測儀器和高通量測序技術的應用，一些新的病毒已經(jīng)在獼猴桃中被鑒定和報道，但這些檢測方法成本相對較高、耗時較長.近年來，環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)結合橫向流動試紙條的檢測方法因其具有特異性強，靈敏性高，檢測結果可視化等優(yōu)點，已廣泛應用于食品和動植物檢疫等方面[8，14，21].

本研究建立了針對AcCRaV的RT-LAMP-LFD檢測方法，根據(jù)AcCRaV外殼蛋白基因序列，選擇CP基因保守區(qū)域設計了特異性引物，通過特異性實驗驗證了RT-LAMP引物的特異性.由于LAMP擴增效率與LAMP反應條件密切相關[14]，我們對RT-LAMP反應條件進行了優(yōu)化.當dNTPs濃度為0.2 mmol/L時，RT-LAMP反應無擴增產(chǎn)物生成，dNTPs濃度在0.4～1.0 mmol/L時，擴增產(chǎn)物形成清晰且明顯的梯形電泳條帶，表明低濃度的dNTPs對等溫擴增具有較大影響.擴增溫度選擇在60～62 ℃時，擴增效率相對較高，但在低溫或高溫下，擴增產(chǎn)物相對較少，這可能是由于等溫擴增的DNA聚合酶在過低，過高的溫度下引起的擴增反應不穩(wěn)定或酶失活所引起；同時，不同反應溫度下，RT-LAMP擴增引物和陽性樣品cDNA模板結合能力的改變也可能影響擴增產(chǎn)物的生成[18，22].此外，Mg2+濃度的增加，在一定程度上能有利于增強RT-LAMP的擴增效果，Mg2+在4～10 mmol/L濃度范圍內(nèi)，均能實現(xiàn)對AcCRaV的有效擴增，表明Mg2+對RT-LAMP擴增是必要的，這與之前的相關報道結果一致[17].

本研究中，我們對建立的RT-LAMP-LFD檢測靈敏度進行測定，發(fā)現(xiàn)該方法檢測AcCRaV的靈敏性較常規(guī)RT-PCR高100倍，該方法在許多植物病毒檢測中也表出更高的檢測靈敏度[15，18]，這可能是相對于普通RT-PCR只能識別目標基因的兩個區(qū)域，LAMP引物能識別靶基因的6個不同區(qū)域有關[8，14].目前，LAMP檢測結果可通過觀察白色沉淀、凝膠電泳、SYBR Green Ⅰ或鈣黃素染色可視化等方法進行判斷[14，15]，本研究將LAMP與LFD試紙條結合，利用生物素和FITC標記的LAMP雜交產(chǎn)物特異性結合到LFD試紙條進行結果判定，避免了瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)生氣溶膠，以及插入類似核酸染料可能形成非特異性結合dsDNA等假陽性結果，實現(xiàn)了檢測結果的可視化[8，14，21].

綜上所述，本研究建立了RT-LAMP結合LFD試紙條檢測獼猴桃中AcCRaV的可視化檢測方法.該方法可以成功從獼猴桃樣品中檢測到AcCRaV，同時，RT-LAMP-LFD檢測方法相對于常規(guī)RT-PCR，對AcCRaV具有較高靈敏性.RT-LAMP-LFD檢測方法在62 ℃ 恒溫條件下，擴增60 min，進行5 min LFD試紙條孵育后即可完成檢測反應，檢測結果可通過試紙條肉眼判斷，具有簡便，快捷和結果可視化等優(yōu)點，這將為獼猴桃病毒的檢測提供了有力的手段，還可為其他植物病毒的檢測提供參考.