調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的抗腫瘤新靶點(diǎn)和新策略研究進(jìn)展

袁濤 ，錢美佳 ，葛孚晶 ，杜佳泯 ，王姣 ，嚴(yán)芳潔 ，朱虹 ，楊波

（1. 浙江大學(xué)智能創(chuàng)新藥物研究院，浙江 杭州 310058；2. 浙江省抗腫瘤藥物臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058）

蛋白質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞的重要成分，也是維持和調(diào)控生命活動(dòng)的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)表達(dá)、折疊、功能或定位的異常均影響機(jī)體的正常生理功能[1]，因此維持這些過(guò)程處于穩(wěn)定和平衡的狀態(tài)，即保持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，是確保生命體正常生理活動(dòng)的關(guān)鍵[1-2]。蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)主要由蛋白合成和降解2個(gè)過(guò)程來(lái)動(dòng)態(tài)調(diào)控，其中蛋白質(zhì)合成是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的起始階段，新合成的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)不同種類的翻譯后修飾被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)不同部位，具有功能多樣性；降解則是避免蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊或異常定位與累積的關(guān)鍵終端調(diào)節(jié)機(jī)制，是維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的“守門員”[3]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）和自噬-溶酶體系統(tǒng)（autophagic-lysosomal system，ALS）是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的2種主要途徑，這2種途徑相互獨(dú)立又相輔相成，能快速高效地降解功能失常的蛋白質(zhì)或受損的細(xì)胞器，是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要方式[4]。

蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)不僅在維持機(jī)體正常生理功能中起到關(guān)鍵作用，還在應(yīng)激條件下細(xì)胞命運(yùn)的抉擇中發(fā)揮重要作用。一旦蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失調(diào)，就有可能導(dǎo)致包括惡性腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等疾病發(fā)生。諸多研究表明，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)重要的調(diào)控系統(tǒng)包括UPS和ALS等的功能異常是致癌蛋白異常累積的重要原因[4]。此外，腫瘤在快速發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，往往容易形成缺氧、營(yíng)養(yǎng)耗竭的腫瘤微環(huán)境，引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而激活未折疊蛋白反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失調(diào)，導(dǎo)致腫瘤血管生成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移以及免疫逃逸[5]。

由此可見，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)異常與腫瘤演進(jìn)各個(gè)階段均有著密切的聯(lián)系，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因之一。因而，基于蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制發(fā)展干預(yù)策略可為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供重要的新思路和新方向。本文綜述了近年來(lái)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)控領(lǐng)域的抗腫瘤新靶點(diǎn)和新策略的研究現(xiàn)狀，并對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行展望，以期為蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制在腫瘤及相關(guān)疾病治療中的進(jìn)一步研發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 基于調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的抗腫瘤靶點(diǎn)和策略

1.1 蛋白酶體及其靶向抑制劑

26S蛋白酶體是真核細(xì)胞中負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)降解的主要細(xì)胞器，由1個(gè)20S蛋白酶體核心顆粒及覆蓋于一端或兩端的19S調(diào)節(jié)顆粒組成（見圖1A）。20S核心顆粒（相對(duì)分子質(zhì)量約700 000）包含4個(gè)堆疊空心環(huán)：2個(gè)外環(huán)和2個(gè)內(nèi)環(huán)，其中2個(gè)外環(huán)形成阻礙蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)環(huán)的屏障；而2個(gè)內(nèi)環(huán)決定了蛋白酶體的活性。19S調(diào)節(jié)顆粒則可以識(shí)別帶有泛素化標(biāo)簽的底物蛋白[6]。

26S蛋白酶體是UPS的主要成分，該系統(tǒng)參與細(xì)胞內(nèi)80%蛋白質(zhì)的降解，在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平與功能方面發(fā)揮著核心作用[6]。在蛋白質(zhì)泛素化修飾過(guò)程中，泛素（ubquitin，Ub）首先由泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）活化，形成E1-Ub復(fù)合物；進(jìn)而通過(guò)轉(zhuǎn)?；饔门c泛素結(jié)合酶（ubquitin-conjugation enzyme，E2）結(jié)合；最后由泛素連接酶（ubiquitin-ligase，E3）介導(dǎo)底物泛素化[7]。泛素化的底物蛋白由19S調(diào)節(jié)顆粒識(shí)別并回收泛素分子，隨后將蛋白質(zhì)解折疊后轉(zhuǎn)移至20S核心顆粒，由活性蛋白酶亞基切割成肽產(chǎn)物，完成蛋白質(zhì)降解（見圖1A）。

通過(guò)介導(dǎo)蛋白質(zhì)的降解，蛋白酶體廣泛參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路和分子過(guò)程，如：細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、核 因 子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的 激活等，在高度依賴這些通路和蛋白的惡性腫瘤細(xì)胞中，抑制蛋白酶體的功能可發(fā)揮有效的抗腫瘤作用。研究表明，在淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤中，NF-κB信號(hào)往往處于異常激活的狀態(tài)，蛋白酶體抑制劑硼替佐米可通過(guò)阻斷NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NFκB，IκB）的降解，進(jìn)而發(fā)揮抗淋巴系統(tǒng)腫瘤的作用[8]；然而也有研究指出，在多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）中硼替佐米則可通過(guò)誘導(dǎo)IκBβ和受體結(jié)合蛋白2的磷酸化進(jìn)而誘導(dǎo)NF-κB活化[9]，這表明硼替佐米在不同類型腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用機(jī)制有所不同。目前，蛋白酶體抑制劑已成功上市用于MM等惡性腫瘤的治療，近年來(lái)，其在實(shí)體腫瘤中抗腫瘤作用也逐漸被挖掘。最新研究表明，人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）缺失的膽管癌細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體組分合成和組裝過(guò)程被過(guò)度激活，導(dǎo)致這類膽管癌細(xì)胞更依賴于蛋白酶體通路，因此硼替佐米對(duì)PTEN功能缺陷的膽管癌表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，提示基因突變背景可能會(huì)影響腫瘤對(duì)蛋白酶體靶向治療的敏感性[10]（見圖1B）。

靶向蛋白酶體為臨床血液系統(tǒng)腫瘤治療帶來(lái)極大的幫助，解決了MM與套細(xì)胞淋巴瘤患者無(wú)藥可治、預(yù)后差等問(wèn)題；但其逐漸凸顯的耐藥性和嚴(yán)重的劑量限制性毒性等問(wèn)題都亟待解決。此外，目前蛋白酶體抑制劑的適應(yīng)證范圍仍較為局限，臨床上主要應(yīng)用于血液系統(tǒng)腫瘤的治療，而實(shí)體腫瘤的特定基因背景與蛋白酶體抑制劑響應(yīng)度之間的關(guān)系，有可能是蛋白酶體抑制劑在相關(guān)實(shí)體腫瘤中是否可應(yīng)用于臨床治療的關(guān)鍵，值得深入研究。

1.2 靶向E3泛素連接酶

泛素化與去泛素化是調(diào)控蛋白穩(wěn)態(tài)的2個(gè)關(guān)鍵過(guò)程，分別由E3泛素連接酶和去泛素化酶所介導(dǎo)。目前已報(bào)道的E3泛素連接酶約有650個(gè)成員，其中約40%已被證實(shí)在UPS中發(fā)揮作用。大量研究表明E3泛素連接酶的失調(diào)與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，主要參與DNA損傷修復(fù)、基因表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，因此E3泛素連接酶已被認(rèn)為是較為理想的腫瘤治療靶點(diǎn)[11]。鑒于調(diào)控底物蛋白的多樣性，E3泛素連接酶在惡性腫瘤中的作用較為復(fù)雜，既有促腫瘤的作用，也發(fā)揮著抑制腫瘤進(jìn)程的作用，甚至同一種E3泛素連接酶，在不同的細(xì)胞背景下，其作用也有可能是雙向的（見圖1C）。

發(fā)揮促腫瘤作用的E3泛素連接酶調(diào)控降解的底物主要是抑癌蛋白。比如E3泛素連接酶小鼠雙微小體2同系物（mouse double minute 2 protein，MDM2）在多種腫瘤中過(guò)度表達(dá)，主要通過(guò)介導(dǎo)抑癌蛋白P53的降解，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。阻斷P53-MDM2相互作用的小分子抑制劑如nutlin-3等在抑制實(shí)體瘤和血液腫瘤中都取得了良好的效果[13-14]。E3泛素連接酶神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)蛋白4（neuronally expressed developmentally downregulated 4，NEDD4）是抑癌蛋白PTEN的負(fù)調(diào)節(jié)因子，NEDD4的上調(diào)增加了PTEN的降解，進(jìn)一步增強(qiáng)了大鼠肉瘤病毒蛋白（rat sarcoma virus，RAS）驅(qū)動(dòng)的腫瘤惡性表型[15]。當(dāng)調(diào)控的是促癌底物蛋白時(shí)，E3泛素連接酶則具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用。有研究表明，E3泛素連接酶羥腦苷脂（cereblon，CRBN）在肝、腎臟等多種人體器官中高表達(dá)。免疫調(diào)節(jié)酰亞胺類藥物沙利度胺及其衍生物來(lái)那度胺通過(guò)介導(dǎo)CRBN和底物之間的相互作用來(lái)驅(qū)動(dòng)靶向蛋白質(zhì)降解，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，也是目前臨床唯一在用的E3泛素連接酶調(diào)節(jié)劑，廣泛用于淋巴瘤和骨髓瘤的臨床治療[16]。

E3泛素連接酶在腫瘤中扮演的角色很大程度上取決于其所在的組織和細(xì)胞，特別是底物蛋白在相關(guān)組織、細(xì)胞中的豐度和功能，因此明確E3泛素連接酶調(diào)控底物蛋白的機(jī)制，進(jìn)而揭示其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，是將其開發(fā)為抗腫瘤靶點(diǎn)的重要前提。

1.3 靶向去泛素化酶

去泛素化酶主要介導(dǎo)底物蛋白泛素鏈的剪切和泛素分子的回收，從而抑制底物蛋白降解，或改變底物蛋白的功能和活性。截至目前，在人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)約100個(gè)去泛素化酶，分為7大家族，分別為：泛素特異性蛋白、泛素羧基端水解酶、卵巢癌蛋白酶、JAMM/MPN 結(jié)構(gòu)域相關(guān)的金屬肽酶家族、馬查多-約瑟夫蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白酶、單細(xì)胞趨化蛋白誘導(dǎo)蛋白家族和鋅指 UFM1 特異性多肽蛋白酶。去泛素化酶在腫瘤細(xì)胞中往往呈現(xiàn)表達(dá)和活性異常的狀態(tài)，由于其發(fā)揮酶活催化作用的結(jié)構(gòu)域較為明確，易于用小分子抑制劑調(diào)控其活性，因此近年來(lái)逐漸成為備受關(guān)注的抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)（見圖1D）。自2014年以來(lái)，已有靶向29種去泛素化酶的約61個(gè)去泛素化酶小分子抑制劑被相繼報(bào)道[17]。

1.3.1 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的去泛素化酶增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路的異常激活是腫瘤細(xì)胞的重要特征之一。大量研究表明，去泛素化酶在腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。河馬信號(hào)通路（Hippo pathway）廣泛參與了包括肝細(xì)胞肝癌、膽管癌等惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和侵襲[18]，其中Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）和具有 PDZ 結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ）是該信號(hào)通路最為重要的下游效應(yīng)蛋白。去泛素化酶USP10，USP9X以及JOSD2等通過(guò)正性調(diào)控YAP/TAZ蛋白的去泛素化過(guò)程，增加它們的蛋白穩(wěn)定性和功能，發(fā)揮促腫瘤作用；敲低或抑制這些去泛素化酶，則發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用[19-21]。此外，USP9X和USP10等還可去泛素化調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通 路 的 重 要 成 員 蛋 白SMAD4，發(fā)揮促腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，而spautin-1等USP10抑制劑可抑制腫瘤細(xì)胞的體外遷移運(yùn)動(dòng)[22]。

1.3.2 細(xì)胞凋亡相關(guān)的去泛素化酶逃避細(xì)胞凋亡是腫瘤細(xì)胞的基本特征之一。近年來(lái)，已發(fā)現(xiàn)多種去泛素化酶在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用，通過(guò)靶向去泛素化酶促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡是一種具有前景的抗腫瘤策略。USP2通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞 FLICE 樣抑制蛋白（cellular FLICE-like inhibitory protein，cFLIP）的去泛素化抑制其降解，從而抑制caspase-8二聚體的形成和激活，并最終抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程[23]。 ML364可以通過(guò)靶向抑制USP2的去泛素化酶活功能進(jìn)而誘導(dǎo)底物蛋白G1/S-特異性周期蛋白-D1（cyclin D1）的泛素化降解從而抑制結(jié)直腸癌和套細(xì)胞淋巴瘤的細(xì)胞周期和腫瘤生長(zhǎng)[24]。

1.3.3 DNA損傷修復(fù)相關(guān)的去泛素化酶DNA過(guò)度復(fù)制和損傷修復(fù)異常是腫瘤細(xì)胞的另一重要特征。近年來(lái)，去泛素化酶被廣泛報(bào)道參與DNA損傷修復(fù)途徑，因而成為相關(guān)腫瘤的干預(yù)靶點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，USP1通過(guò)去泛素化調(diào)控范科尼貧血蛋白（Fanconi anemia protein，F(xiàn)A）和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）促進(jìn)DNA修復(fù)。在USP1缺失的腫瘤中，PCNA會(huì)發(fā)生單泛素化進(jìn)而促進(jìn)復(fù)制叉的停滯和核基因組不穩(wěn)定性[25]。

1.3.4 蛋白酶體相關(guān)的去泛素化酶硼替佐米在臨床MM中的成功應(yīng)用證實(shí)了蛋白酶體在腫瘤治療中的重要作用，靶向蛋白酶體相關(guān)的去泛素化酶也成為一種具有前景的抗腫瘤策略。PSMD14，USP14和泛素C端水解酶L5（ubiquitin C-terminal hydrolase L5，UCHL5）是與蛋白酶體相關(guān)的3種去泛素化酶，其主要功能是移除底物蛋白上的多聚泛素鏈，促進(jìn)底物蛋白進(jìn)入蛋白酶體的催化核心，從而促進(jìn)底物蛋白的降解[17]。VLX1570通過(guò)抑制USP14和UCHL5的酶活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白的快速積累，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用[17]。VLX1570是首個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的去泛素化酶抑制劑，但由于不確定的臨床收益，該臨床研究現(xiàn)已被暫停（臨床試驗(yàn)編號(hào)：NCT02372240）。

1.4 蛋白水解靶向嵌合體技術(shù)

蛋白水解靶向嵌合體（proteolysis-targeting chimera，PROTAC）是一種利用UPS對(duì)靶蛋白進(jìn)行降解的技術(shù)。PROTAC通過(guò)特殊設(shè)計(jì)的“Linker”結(jié)構(gòu)，將E3泛素連接酶配體和靶蛋白配體連接起來(lái)，形成“PROTAC”三聯(lián)體的活性形式[26]（見圖1E）。由于基于多肽為配體的PROTAC活性很低，相對(duì)分子質(zhì)量較大的肽類配體會(huì)大大降低PROTAC入胞能力，且多肽分子可能會(huì)產(chǎn)生免疫原性，因而限制了其在臨床應(yīng)用[27]。而基于小分子配體的PROTAC成藥性大大提升，人們發(fā)現(xiàn)沙利度胺作為CRBN的配體，親和力很強(qiáng)，非常適合作為E3泛素連接酶的配體分子，據(jù)此開發(fā)了一系列可結(jié)合CRBN的小分子，產(chǎn)生了CRBN-based PROTAC分子[28]。此外，研究人員又基于E3泛素連接酶希佩爾-林道腫瘤抑制因子（von Hippel-Lindau tumor suppressor，VHL）開發(fā)了更多類似理化性質(zhì)的配體分子，設(shè)計(jì)出了VHL-based PROTAC分子，大幅度提高了小分子的透膜性，在細(xì)胞水平的抑制活性可以達(dá)到納摩爾級(jí)別，為后續(xù)基于受體相互作用絲氨酸蘇氨酸激酶2/雌激素相關(guān)受體α （receptor interacting serine threonine kinase 2/estrogen related receptor alpha，RIPK2/ERRα）和溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（bromodomain containing 4，BRD4）的PROTAC藥物研究奠定了基礎(chǔ)[29]。

此外，基于抗體的PROTAC（antibody-based PROTAC，AbTAC）也是一種前景良好的蛋白靶向降解策略。AbTAC本質(zhì)是一種完全重組的雙特異性免疫球蛋白G，抗體兩端可以同時(shí)靶向細(xì)胞表面目標(biāo)蛋白以及跨膜E3泛素連接酶環(huán)指蛋白43（ring finger protein 43，RNF43），進(jìn)而誘導(dǎo)蛋白復(fù)合物細(xì)胞內(nèi)化并被溶酶體降解[30]（見圖2B）。目前基于RNF43的AbTAC被證明可以靶向腫瘤細(xì)胞表面的程序性死亡受體配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1），但尚不清楚RNF43是否影響目標(biāo)蛋白的泛素化以及對(duì)其細(xì)胞內(nèi)化的影響[31]。

PROTAC技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)小分子藥物具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。首先，PROTAC分子可以靶向降解傳統(tǒng)意義上的“不可成藥靶點(diǎn)”。其次，PROTAC相對(duì)于傳統(tǒng)小分子藥物具有較高的選擇性。最后，PROTAC可以克服腫瘤耐藥問(wèn)題，例如PROTAC可有效降解突變型的B細(xì)胞受體-ABL原癌基因1（B-cell receptor-ABL proto-oncogene 1，BCR-ABL1），對(duì)T315I突變的腫瘤細(xì)胞具有較高的抑制活性[32]。當(dāng)然，研究發(fā)現(xiàn)PROTAC也具有一定的局限性，例如相對(duì)分子質(zhì)量大、生物利用度差和成藥困難等，這些問(wèn)題都有待進(jìn)一步解決。

1.5 分子膠水

與PROTAC類似，分子膠水（molecular glues）是一類可誘導(dǎo)E3泛素連接酶與底物蛋白發(fā)生相互作用，促進(jìn)底物蛋白經(jīng)泛素化被蛋白酶體降解的小分子。與PROTAC不同的是，分子膠水可以直接介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，導(dǎo)致靶蛋白泛素化降解[33]（見圖1F）。目前分子膠水研究的靶點(diǎn)仍然比較局限，已經(jīng)進(jìn)入臨床的分子膠水靶點(diǎn)大多是偶然發(fā)現(xiàn)的，主要集中于：Ikaros家族鋅指蛋白1/3（Ikaros family zinc finger 1/3，IKZF1/3）和G1-S相變蛋白1 （G1to S phase transition 1，GSPT1）等。首個(gè)被發(fā)現(xiàn)可調(diào)控蛋白穩(wěn)定性的分子膠水是沙利度胺，主要原理是其結(jié)合于E3泛素連接酶CRBN蛋白，可誘導(dǎo)多種底物的泛素化降解。此外，芳基磺胺類藥物除了用于抗菌之外，近年來(lái)還被發(fā)現(xiàn)可通過(guò)增強(qiáng)E3泛素連接酶DDB1/CUL4相關(guān)因子15（DDB1 and CUL4 associated factor 15，DCAF15）與RNA結(jié)合基序蛋白39（RNA binding motif protein 39，RBM39）的相互作用，進(jìn)而誘導(dǎo)RBM39的泛素化降解[34]。

分子膠水能夠通過(guò)蛋白降解的方式下調(diào)那些無(wú)小分子結(jié)合口袋的不可成藥靶蛋白，極大地?cái)U(kuò)大了可成藥靶蛋白的范圍；另外，分子膠水具有化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、相對(duì)分子質(zhì)量低和細(xì)胞通透性好的特點(diǎn)，成藥性更佳。但是基于天然產(chǎn)物及合成的分子膠水降解劑的發(fā)現(xiàn)具有偶然性，缺乏合理的設(shè)計(jì)策略，限制了分子膠水發(fā)現(xiàn)的效率和適用性，因此基于結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的藥物發(fā)現(xiàn)、計(jì)算機(jī)建模與虛擬篩選將是未來(lái)分子膠水設(shè)計(jì)的主要方向。

1.6 靶向熱休克蛋白

生物體在高溫等壓力條件下啟動(dòng)的以基因表達(dá)變化為特征的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制稱為熱休克反應(yīng)。在此過(guò)程中，熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）發(fā)揮關(guān)鍵作用，其作為分子伴侶充當(dāng)折疊酶和保持酶，協(xié)助新合成蛋白的從頭折疊，并防止蛋白質(zhì)聚集。細(xì)胞應(yīng)激時(shí)，異常折疊的蛋白質(zhì)暴露的疏水氨基酸增加，被HSP27復(fù)合物識(shí)別，隨后HSP70以ATP依賴的方式置換蛋白質(zhì)，使部分蛋白恢復(fù)正常折疊狀態(tài)，同時(shí)將部分異常蛋白質(zhì)傳遞給HSP90；蛋白質(zhì)完成折疊后，HSP90和輔助伴侶從成熟的功能性蛋白質(zhì)中解離[35]（見圖1G）。

圖1 基于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)控策略Figure 1 Regulation strategy of protein homeostasis based on ubiquitin-proteasome system

與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞對(duì)HSPs表現(xiàn)出較為明顯的依賴性。HSPs已被報(bào)道與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)，在多種腫瘤中過(guò)度表達(dá)并與患者的預(yù)后不良正相關(guān)，包括肺癌、胃癌和乳腺癌等[36]。HSP90和HSP70作為熱休克反應(yīng)的核心伴侶分子，參與調(diào)節(jié)許多致癌蛋白如P53突變體、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）等的表達(dá)水平和蛋白穩(wěn)定性，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展具有重要作用[37-38]。HSP70和HSP27還能夠通過(guò)多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，如干預(yù)細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)、降低細(xì)胞溶質(zhì)鈣水平和穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞內(nèi)的溶酶體等[39-40]。靶向抑制HSP90還能夠破壞DNA修復(fù)機(jī)制，上調(diào)干擾素響應(yīng)，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)[38]。

1.7 調(diào)控自噬過(guò)程

除了UPS之外，ALS是細(xì)胞內(nèi)另一種重要的降解途徑，通常與UPS等其他蛋白降解途徑協(xié)同降解錯(cuò)誤折疊或受損的蛋白質(zhì)。細(xì)胞中形成的較大聚集體、半衰期長(zhǎng)的蛋白質(zhì)或與受損細(xì)胞器相關(guān)的蛋白質(zhì)往往通過(guò)ALS降解（見圖2A）。泛素鏈類型參與決定了底物蛋白的降解途徑，Lys-63泛素鏈往往誘導(dǎo)底物蛋白經(jīng)由ALS降解[4]。

自噬在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮雙重作用。目前大多數(shù)研究認(rèn)為，在腫瘤發(fā)生早期，自噬主要發(fā)揮抑癌作用，通過(guò)清除受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，從而維持應(yīng)激條件下的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)生[41]。一旦腫瘤進(jìn)展到晚期，自噬則作為細(xì)胞的保護(hù)和防御機(jī)制，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)外來(lái)刺激和壓力的抵抗作用，維持腫瘤細(xì)胞的存活、代謝和生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[42]。這一作用在特定的腫瘤類型和條件下會(huì)更為明顯，如RAS通路異常激活的腫瘤表現(xiàn)出對(duì)自噬的高度依賴性。根據(jù)自噬過(guò)程的不同階段，可以通過(guò)調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、自噬相關(guān)蛋白6（autophagy-related protein 6，ATG6）或磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）復(fù)合物活性在上游靶向自噬，也可以通過(guò)調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白4B（autophagy-related protein 4B，ATG4B）活性在下游靶向自噬。另外，還可以用溶酶體酸化抑制劑阻斷自噬體與溶酶體的融合[43]。P62作為選擇性自噬受體能夠介導(dǎo)致癌蛋白的選擇性自噬降解。例如，P62介導(dǎo)了誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病的早幼粒白血病基因/維甲酸受體基因α（PML nuclear body scaffold/retinoic acid receptor alpha，PMLRARα）融合蛋白的選擇性自噬降解，而抑制mTOR活性能夠激活自噬并加速PML-RARα降解[44]。

自噬抑制劑能夠與靶向治療、放射治療和免疫治療聯(lián)合治療腫瘤，臨床試驗(yàn)也已證明靶向自噬用于腫瘤治療的安全性較為可控[45]。然而，腫瘤中的自噬途徑具有高度的環(huán)境和細(xì)胞背景的依賴性，如果想要更好地調(diào)控自噬用于腫瘤治療，需進(jìn)一步了解不同條件下，自噬發(fā)生的具體過(guò)程、對(duì)腫瘤的影響以及相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。

1.8 其他調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的策略

除了上述策略之外，尚有不少新興的調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的抗腫瘤策略進(jìn)展飛速，這些新策略正在顛覆傳統(tǒng)的藥物發(fā)現(xiàn)模式，為蛋白降解劑及其他相應(yīng)藥物的開發(fā)提供新的思路。隨著對(duì)ALS研究的深入，相較于僅能降解胞內(nèi)蛋白質(zhì)的蛋白酶體途徑，通過(guò)溶酶體進(jìn)行靶向蛋白質(zhì)降解的策略可有效干預(yù)細(xì)胞外及膜蛋白、受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚集體。

溶酶體靶向嵌合體（lysosome-targeting chimera，LYTAC）是由與化學(xué)合成的糖肽配體融合的小分子或抗體組成，LYTAC分子可以同時(shí)結(jié)合膜蛋白或細(xì)胞外蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域以及位于細(xì)胞表面的溶酶體靶向受體，形成三元復(fù)合物后，通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)化隨后被降解[46]（見圖2B）。LYTAC可以解決PROTAC無(wú)法有效地靶向膜或細(xì)胞外蛋白的問(wèn)題。目前可以被LYTAC攜帶的目標(biāo)蛋白配體包括抗體、小分子和短肽3種類型，但由于抗體的組織通透性差，小分子配體無(wú)法靶向“不可藥靶”蛋白，所以抗體和小分子在應(yīng)用方面具有很大的局限性，而因?yàn)榻Y(jié)合短肽具有易于合成、結(jié)構(gòu)配比靈活等優(yōu)勢(shì)成為L(zhǎng)YTAC配體的發(fā)展重點(diǎn)[47]。目前，有臨床前研究表明，共價(jià)偶聯(lián)西妥昔單抗的LYTAC分子被證明可在各種細(xì)胞系中特異性降解表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），并且偶聯(lián)抗PD-L1抗體的LYTAC分子可加速細(xì)胞表面PD-L1的溶酶體降解[46]。

自噬靶向嵌合體（autophagy-targeting chimera，AUTAC）是另一種靶向蛋白降解的策略。針對(duì)細(xì)胞內(nèi)無(wú)法被蛋白酶體降解的蛋白質(zhì)，基于ALS的AUTAC彌補(bǔ)了PROTAC對(duì)于UPS過(guò)度依賴的缺陷[48]。AUTAC由靶蛋白的小分子結(jié)合劑和鳥嘌呤衍生物組成（見圖2B）。鳥嘌呤衍生物引發(fā)底物蛋白K63泛素鏈修飾，隨后被溶酶體降解。AUTAC既可降解胞質(zhì)蛋白，又可通過(guò)線粒體自噬促進(jìn)線粒體更新。

圖2 基于自噬溶酶體系統(tǒng)的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)控策略Figure 2 Regulation strategy of protein homeostasis based on autophagic-lysosomal system

2 蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)控藥物的臨床應(yīng)用和臨床研究 進(jìn)展

2.1 已經(jīng)獲批上市的藥物

2.1.1 蛋白酶體抑制劑近年來(lái)已成功上市了3種蛋白酶體抑制劑相關(guān)藥物，即硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米[7]。硼替佐米是首個(gè)同類二肽硼酸鹽蛋白酶體抑制劑，可逆地抑制20S蛋白酶體β5亞基的糜蛋白酶樣活性，并部分抑制β1亞基的胰蛋白酶樣活性；卡非佐米是第2代不可逆環(huán)氧酮蛋白酶體抑制劑，共價(jià)攻擊β5亞基的活性位點(diǎn)蘇氨酸殘基；二肽基亮氨酸硼酸——伊沙佐米是首個(gè)成功開發(fā)的口服蛋白酶體抑制劑，拓寬了前兩者的靜脈給藥途徑，且具有較短的解離半衰期及良好的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)特征。

2.1.2 E3泛素連接酶調(diào)節(jié)劑目前，唯一已上市的E3泛素連接酶調(diào)節(jié)劑是靶向調(diào)節(jié)CRBN的來(lái)那度胺及其衍生物。在上世紀(jì)50年代，沙利度胺作為孕婦止吐藥廣泛應(yīng)用，最終釀成上萬(wàn)例畸形嬰兒的慘劇。盡管有副作用，對(duì)沙利度胺的潛在應(yīng)用仍在繼續(xù)研究，并于1998年被批準(zhǔn)用于治療麻風(fēng)病，2006年被批準(zhǔn)用于MM。由此，揭開了沙利度胺在抗腫瘤領(lǐng)域中的應(yīng)用，為了改善藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)，研究人員開發(fā)了優(yōu)化的沙利度胺衍生物，如來(lái)那度胺和泊馬度胺，并分別于2006年和2013年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)上市。

2.2 處于臨床試驗(yàn)階段的候選藥物及靶向策略

2.2.1 E3泛素連接酶調(diào)節(jié)劑MDM2抑制劑通過(guò)抑制MDM2的E3泛素連接酶活性并阻斷MDM2和P53的相互作用發(fā)揮抗腫瘤作用。亞盛藥業(yè)在研的APG-115通過(guò)抑制MDM2后激活P53，從而激活巨噬細(xì)胞 M1極化和T細(xì)胞活化的抗腫瘤免疫，也填補(bǔ)了我國(guó)MDM2靶點(diǎn)開發(fā)的空白[49]。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）抑制劑在促進(jìn)抗腫瘤免疫中起著至關(guān)重要的作用，如LCL-161誘導(dǎo)MM的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）依賴性凋亡，并促進(jìn)抗腫瘤免疫[50]。除了開發(fā)E3泛素連接酶抑制劑外，也有激動(dòng)劑在開展臨床前研究。Indisulam可以充當(dāng)E3泛素連接酶Cullin-4和DCAF15以及RBM39之間的分子黏合劑，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中開展Ⅱ期臨床研究[34]（見表1）。

2.2.2 去泛素化酶抑制劑去泛素化酶明確的酶活催化位點(diǎn)為小分子抑制劑的開發(fā)提供了條件。該領(lǐng)域研究起步較晚，目前僅有VLX1570和KSQ-4279進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。2015年，USP14/UCHL5選擇性抑制劑VLX1570被批準(zhǔn)用于MM患者的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)（臨床試驗(yàn)編號(hào)：NCT02372240），然而由于臨床收益不明確，目前處于暫停階段。2017年，USP1抑制劑KSQ-4279進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)，用于乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility genes，BRCA）缺失的晚期實(shí)體瘤患者治療（臨床試驗(yàn)編號(hào)：NCT05240898），其機(jī)制與前述提到的USP1對(duì)DNA修復(fù)系統(tǒng)的調(diào)控作用有關(guān)（見表1）。

2.2.3 蛋白靶向嵌合體技術(shù)2015年，以泊馬度胺為 E3泛素連接酶配體的dBET1 PROTAC成功降解了BET蛋白，PROTAC 自此進(jìn)入了飛速發(fā)展期[33]。2019年，首個(gè)雙功能 PROTAC 降解劑 ARV-110進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，ARV-110應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者。另一個(gè)PROTAC分子ARV-471應(yīng)用于雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性、HER2陰性乳腺癌患者的臨床研究（臨床試驗(yàn)編號(hào)：NCT04072952）。截至目前，已有15個(gè)PROTAC藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段（見表1）。

2.2.4 分子膠水研發(fā)進(jìn)展最快的分子膠水藥物目前處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段，分別為百時(shí)美施貴寶的CC-90009，CC-92480以及C4 Therapeutics的CFT7455。CC-90009能夠驅(qū)動(dòng)GSPT1與CRBN結(jié)合，從而導(dǎo)致GSPT1的蛋白酶體依賴性降解，進(jìn)而導(dǎo)致急性髓細(xì)胞性白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）細(xì)胞凋亡，并有效殺傷白血病干細(xì)胞，主要用于治療復(fù)發(fā)性或難治性AML[51]。CC-92480和CFT7455都是E3泛素連接酶CRBN的調(diào)節(jié)劑，可以介導(dǎo)IKZF1/3的泛素化降解，主要用于治療復(fù)發(fā)性或難治性MM[52]，其中CFT7455被FDA授予MM的“孤兒藥”資格認(rèn)定；此外臨床數(shù)據(jù)顯示，CC-92480在治療劑量下，客觀緩解率可達(dá)48%（見表1）。

2.2.5 熱休克蛋白抑制劑天然產(chǎn)物格爾德霉素是HSPs第1代抑制劑，其溶解性差，肝毒性大，且會(huì)通過(guò)旁路機(jī)制導(dǎo)致HSP70和HSP90的表達(dá)增加，引起治療抗性。此后研究者多次進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，研發(fā)出17-AAG和17-DMAG等衍生物，一定程度上改善了毒性、穩(wěn)定性等性質(zhì)，但無(wú)法克服HSP70和HSP90的適應(yīng)性上調(diào)[53]。第2代抑制劑AUY922，STA9090，PU-3和XL888等小分子藥物較好地解決了這一問(wèn)題，目前已有多個(gè)藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)，進(jìn)展最快的STA9090用于乳腺癌的治療目前正在進(jìn)行Ⅱ期臨床研究（臨床試驗(yàn)編號(hào)：NCT01273896）[53]（見表1）。

2.2.6 自噬抑制劑氯喹衍生物在臨床上長(zhǎng)期用于治療瘧疾和風(fēng)濕病[43]。羥氯喹能使溶酶體脫酸并阻斷其與自噬體融合從而抑制自噬。目前圍繞羥氯喹，科研人員正在嘗試一系列聯(lián)用策略，如羥氯喹與索拉非尼聯(lián)用治療肝癌，與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）抑制劑考比替尼及阿特珠單抗聯(lián)用治療消化道腫瘤，與MEK抑制劑曲美替尼聯(lián)用治療V-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）突變難治性膽道癌，與阿維魯單抗及帕博西尼聯(lián)用治療乳腺癌，與達(dá)拉非尼及曲美替尼聯(lián)用治療黑色素瘤等。這些策略均處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段（見表1）。

表1 蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)控藥物的臨床研究進(jìn)展Table 1 Progress of clinical research on drugs based on proteostasis

續(xù)表1

3 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，靶向調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的抗腫瘤策略取得了較大發(fā)展，繼蛋白酶體抑制劑之后，相繼有多個(gè)新品種和新靶點(diǎn)類型的藥物用于臨床治療。圍繞E3泛素連接酶、去泛素化酶在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制的深入研究，將進(jìn)一步推動(dòng)以這些蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)控酶為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物研發(fā)進(jìn)程，其中特別需要關(guān)注的是在腫瘤特定基因突變背景下異常激活并發(fā)揮重要作用的調(diào)控酶。而PROTAC，LYTAC和AUTAC等蛋白降解策略，利用UPS或ALS途徑降解致癌靶蛋白，與傳統(tǒng)靶點(diǎn)干預(yù)策略的“占位驅(qū)動(dòng)”作用模式不同，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，特別是針對(duì)雄激素受體（androgen receptor，AR）的PROTAC降解劑已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但未來(lái)研究仍需進(jìn)一步關(guān)注蛋白降解策略的靶點(diǎn)選擇及降解劑的成藥性。