極小種群野生植物白花兜蘭ISSR遺傳多樣性分析*

秦惠珍，盤(pán) 波，趙 健，鄒 蓉，韋 霄，唐鳳鸞

(廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)與資源持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541006)

白花兜蘭(Paphiopedilumemersonii)為蘭科(Orchidaceae)兜蘭屬(Paphiopedilum)中極具觀賞價(jià)值的瀕危類群之一[1]，是我國(guó)特有的蘭科兜蘭屬物種，僅分布于廣西和貴州南部極其狹窄的喀斯特地區(qū)，生于石灰?guī)r山坡多石之地，海拔600-700 m，原生境條件嚴(yán)酷、復(fù)雜，氣候存在特有性，屬于極小種群野生植物。白花兜蘭由于具有極高的觀賞價(jià)值和科研價(jià)值等，近年來(lái)遭到掠奪性采挖，導(dǎo)致其種群數(shù)量迅速減少而瀕臨滅絕[2,3]。早在1997年，包括白花兜蘭在內(nèi)的所有兜蘭屬植物就被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)附錄Ⅰ中，禁止國(guó)際貿(mào)易[4]。在《中國(guó)物種紅色名錄》中，白花兜蘭被列入極危種，屬于國(guó)家Ⅰ級(jí)保護(hù)植物，具有極高的保護(hù)與研究?jī)r(jià)值。目前，關(guān)于白花兜蘭的研究主要集中在葉表皮形態(tài)特征[5]、群落結(jié)構(gòu)特征[6]、繁殖技術(shù)[7-9]、遷地保護(hù)[10]和回歸研究[11]等方面。雖然組織培養(yǎng)技術(shù)使白花兜蘭移栽成活率達(dá)到95%以上，但是種群數(shù)量少、結(jié)實(shí)困難、優(yōu)良種質(zhì)資源匱乏仍是限制白花兜蘭快繁的重要因素。可見(jiàn)要從根本上緩解白花兜蘭的瀕?，F(xiàn)狀，重建白花兜蘭種群，還需進(jìn)一步研究白花兜蘭現(xiàn)有野生種群的遺傳多樣性，對(duì)遺傳多樣性較高的種群進(jìn)行遷地保護(hù)或就地保護(hù)，以及優(yōu)良種質(zhì)資源培育等。因此，研究白花兜蘭的遺傳多樣性對(duì)白花兜蘭的種質(zhì)資源保護(hù)及分子輔助育種具有重要意義。

ISSR等DNA分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物的優(yōu)良種質(zhì)資源選育、新品種鑒定和遺傳多樣性研究等領(lǐng)域。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有成本低、多態(tài)性高、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[12]，在蘭科植物的種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系分析和遺傳多樣性研究等方面已得到廣泛應(yīng)用[13]。本研究擬采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)白花兜蘭8個(gè)野生種群的122份樣品進(jìn)行遺傳多樣性及種群間親緣關(guān)系分析，以期為白花兜蘭的種質(zhì)資源保護(hù)、優(yōu)良種質(zhì)資源培育等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

于2020年8-9月采集白花兜蘭野生種群樣品，每個(gè)種群根據(jù)現(xiàn)存數(shù)量采集樣品，剪取無(wú)病蟲(chóng)害的新鮮葉片，用變色硅膠快速干燥，用密封袋密封帶回實(shí)驗(yàn)室存放于干燥處，并盡快提取其基因組DNA，樣品采集信息詳見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 基因組總DNA的提取

白花兜蘭總DNA用植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取，分別用1%瓊脂糖凝膠和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所得總DNA的濃度和純度，濃度調(diào)整為40 ng/μL，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ISSR引物的合成與篩選

ISSR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)(University of British Columbia，UBC)公布的100條通用引物序列(http: //www.biotech.ubc.ca/services/naps/primers.html)合成。本試驗(yàn)以24份白花兜蘭(8個(gè)野生種群，每個(gè)種群隨機(jī)選3份)的基因組DNA為模板，用100條ISSR引物進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，從中篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、多態(tài)性效果較好的引物，用于后續(xù)白花兜蘭8個(gè)野生種群的遺傳多樣性分析。

1.2.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系及程序

結(jié)合Taq酶特性，參照蘭科植物ISSR反應(yīng)體系[13]加以改進(jìn)：25 μL PCR體系中含2.5 μL 10×Taq Buffer，1.0 μL引物(10 μmol/L)，0.4 μL dNTP(10 μmol/L)，1.5 μL Mg2+(25 mmol/L)，0.2 μL Taq酶(5 U/μL)，1 μL 模板DNA (40 ng)，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min，40個(gè)循環(huán)(95℃ 20 s,52℃ 20 s,72℃ 2 min)；然后72℃延伸10 min，電泳結(jié)束后采用GONGDS 8000凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)拍照記錄。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按條帶的有無(wú)統(tǒng)計(jì)，有條帶的記為1，無(wú)條帶的記為0；利用POPGene 32軟件計(jì)算遺傳多樣性指數(shù)，利用NTsys 2.10e軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，利用NTSYS-pc軟件計(jì)算遺傳分化系數(shù)；采用非加權(quán)組平均法(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means,UPGMA)進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹(shù)狀聚類圖[14,15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR多態(tài)性分析

用初步篩選出的引物對(duì)24份白花兜蘭樣品進(jìn)行復(fù)篩，最終篩選出6條多態(tài)性較高、擴(kuò)增效果較為理想的引物(表2)。用這6條引物對(duì)122份白花兜蘭樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出總條帶35條，其中多態(tài)性條帶30條。平均每條引物總擴(kuò)增條帶數(shù)為5.83條，多態(tài)性百分?jǐn)?shù)均值為87.70%，說(shuō)明白花兜蘭122份樣品之間遺傳多樣性較為豐富。引物807和引物809的部分樣品擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

表2 6個(gè)ISSR引物的擴(kuò)增結(jié)果

M：DL 2000 DNA:marker

2.2 遺傳多樣性分析

2.2.1 種群內(nèi)的遺傳多樣性分析

6條引物對(duì)8個(gè)野生種群的122份樣品進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng)，共擴(kuò)增出35條譜帶，種群間多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為15-29，種群水平的多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPB)為50%-96.67%，均值為78.33%；等位基因數(shù)(Na)為1.500 0-1.966 7，均值為1.783 3；有效等位基因數(shù)(Ne)為1.316 4-1.622 2，均值為1.481 7；Na與Ne在8個(gè)野生種群中差異不大，說(shuō)明8個(gè)白花兜蘭種群其等位基因在群體中分布均勻；Nei′s基因多樣性指數(shù)(H)為0.187 0-0.352 1，均值為0.280 8；Shannon′s信息指數(shù)(I)為0.278 6-0.517 5，均值為0.419 1；8個(gè)野生種群的多態(tài)性位點(diǎn)百分率為50.00%-96.67%，均值為78.33%(表3)。說(shuō)明8個(gè)白花兜蘭種群的遺傳多樣性屬于中等水平。

表3 種群內(nèi)的遺傳多樣性

2.2.2 種群間遺傳變異分析

對(duì)白花兜蘭的8個(gè)野生種群的種群間遺傳分化水平進(jìn)行分析，種群內(nèi)的遺傳多樣性(Hs)為0.280 8，種群間的遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.124 7，即總的遺傳變異中有12.47%的變異來(lái)自種群間，87.53%的變異來(lái)自種群內(nèi)，表明種群內(nèi)遺傳分化非常大。種群間每代個(gè)體的基因流(Nm)為3.509 3，表明種群間基因交流非常頻繁。

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 遺傳距離與遺傳一致度分析

白花兜蘭8個(gè)野生種群的遺傳相似度為0.866 1-0.978 6，種群LH與種群HMD的種群遺傳相似度最小，為0.866 1，種群LLG與種群LYZ的種群遺傳相似度最大，為0.978 6，表明種群LH與種群HMD的遺傳差異最大，遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)；種群LLG與種群LYZ差異最小，親緣關(guān)系最近。8個(gè)野生種群的遺傳距離為0.021 6-0.143 8，其中LLG與種群LYZ遺傳距離最近，為0.021 6，種群LH與種群HMD遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.143 8 (表4)。

表4 遺傳相似度(右上)與遺傳距離(左下)

2.3.2 聚類分析

基于遺傳一致性，采用UPGMA法將白花兜蘭8個(gè)野生種群樣本作聚類分析，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，8個(gè)白花兜蘭野生種群分為兩大類，第一大類包括HML和HMD兩個(gè)種群(38份樣品)，第二大類包括LYZ、LLG、LH、YLD、YLY、LLJ 6個(gè)種群(84份樣品)。第二大類再劃分成3個(gè)亞類，第Ⅰ類包括YLD 1個(gè)種群(6份樣品)，第Ⅱ類包括YLY和LLJ 兩個(gè)種群(38份樣品)，第Ⅲ類包括LYZ、LLG、LH 3個(gè)種群(40份樣品)。

圖2 白花兜蘭8個(gè)野生種群的UPGMA樹(shù)狀聚類圖

3 討論

遺傳多樣性高低是評(píng)價(jià)種質(zhì)資源優(yōu)劣的重要內(nèi)在因素之一，同時(shí)反映物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力[16,17]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在植物的遺傳多樣性分析、優(yōu)良種質(zhì)資源鑒定及種群親緣關(guān)系分析方面具有廣泛應(yīng)用。目前ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已應(yīng)用于蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis)、石斛屬(Dendrobium)、蘭屬(Cymbidium)、開(kāi)唇蘭屬(Anoectochilus)等蘭科植物的遺傳多樣性、品種鑒定與親緣關(guān)系分析研究[18-20]。李敏等[21]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析16個(gè)蝴蝶蘭品種的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于日本和臺(tái)灣的品種聚為一類，其他品種聚為另一類。李永清等[22]和鹿炎等[23]利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)的種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，從100條ISSR引物中篩選出9條多態(tài)性引物，多態(tài)性比率為99.36%，Na均值為1.913 0，Ne均值為1.528 3，H均值為0.310 0，I均值為0.465 0。葉煒等[24]對(duì)金線蘭(Anoectochilusroxburghii)及其近緣種植物進(jìn)行ISSR遺傳多樣性研究，從100條ISSR引物中篩選出12條多態(tài)性引物，多態(tài)性比率為99.36%，Na均值為2.000 0，Ne均值為1.555 0，H均值為0.322 0，I均值為0.484 0。本研究首次采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)8個(gè)白花兜蘭野生種群的遺傳多樣性進(jìn)行研究，從100條ISSR引物中篩選出6條具有多態(tài)性且條帶清晰的引物，PPB均值為78.33%，Na均值為1.783 3，Ne均值為1.481 7，H均值為0.280 8，I均值為0.419 1，表明白花兜蘭的遺傳多樣性水平低于鐵皮石斛和金線蘭。

遺傳相似度是判斷種內(nèi)及種間親緣關(guān)系及遺傳基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)之一[25]，遺傳相似度越大，親緣關(guān)系越近。目前ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在蘭科植物中已廣泛應(yīng)用于金線蓮(A.formosanus)、春蘭(C.goeringii)和蝴蝶蘭屬等植物的遺傳多樣性、品種鑒定與親緣關(guān)系分析[23,24]。本研究中8個(gè)白花兜蘭野生種群的遺傳相似度為0.866 1-0.978 6，種群間的遺傳相似度均值為0.937 0，且種群間遺傳相似度均大于0.8，表明白花兜蘭8個(gè)野生種群的親緣關(guān)系較近。遺傳距離反映不同種群及不同物種間的親緣關(guān)系，遺傳距離越小親緣關(guān)系越近[26]，8個(gè)白花兜蘭野生種群兩兩間的遺傳距離為0.021 6-0.143 8，遺傳距離集中且較小，表明白花兜蘭野生種群之間遺傳分化程度較小，親緣關(guān)系較近。本研究的聚類分析中，HMD和LYZ兩個(gè)種群的地理距離(5.534 km)最近，但并沒(méi)有嚴(yán)格按地理位置分布聚類，可能是種群間的基因交流較為頻繁所致。

白花兜蘭僅分布于廣西和貴州喀斯特山坡的懸崖或斷巖崖壁上，生存條件惡劣，分布范圍狹窄，種群間地理距離近，導(dǎo)致種群間的基因交流頻繁，但過(guò)大的基因流阻礙了由遺傳漂變導(dǎo)致的遺傳分化，不利于種群的長(zhǎng)期進(jìn)化與發(fā)展。白花兜蘭的遺傳多樣性雖然低于鐵皮石斛和金線蘭等國(guó)家二級(jí)保護(hù)野生植物，但仍具有較高的遺傳多樣性，表明遺傳多樣性并不是白花兜蘭致瀕的根本原因，其可能原因，一是“蘭花熱”使得白花兜蘭遭受毀滅性的采挖，加之采挖過(guò)程中對(duì)其生境的破壞使其不能在短時(shí)間內(nèi)得以恢復(fù)；二是白花兜蘭在自然狀態(tài)下結(jié)實(shí)率非常低。根據(jù)聚類結(jié)果及種群間遺傳多樣性指數(shù)，可知HML和HMD兩個(gè)種群遺傳多樣性最高，可作為良種選育的原材料。此外，要加大對(duì)白花兜蘭野生種質(zhì)資源及其生境的保護(hù)，嚴(yán)禁采挖，同時(shí)還要加強(qiáng)對(duì)白花兜蘭野生種質(zhì)資源的良種選育，通過(guò)組織培養(yǎng)等方式擴(kuò)大人工培育，從而更好地保護(hù)極危植物白花兜蘭的野生資源多樣性。