基于TCGA分析 GALNT14在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及預(yù)后意義*

韋玉琴，吳 帆，2，張勝鋒，譚炎林，臧 寧，晁耐霞，吳群英，周青鳥**

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西高等學(xué)校生物分子醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣西南寧 530021)

腎細(xì)胞癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，最常見的組織學(xué)亞型是腎透明細(xì)胞癌(Kidney Renal Clear Cell Carcinoma,KIRC)，約占腎細(xì)胞癌患者的80%-90%[1]。腎透明細(xì)胞癌易轉(zhuǎn)移，在進(jìn)行部分或根治性腎切除術(shù)后仍有約30%的患者會(huì)復(fù)發(fā)，預(yù)后差[2]。因此，迫切需要新的生物標(biāo)志物來對(duì)腎透明細(xì)胞癌進(jìn)行早期診斷，并對(duì)患者進(jìn)行個(gè)性化治療。

N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶家族(GALNTs)有20個(gè)成員，包括GALNT1-14和GALNTL1-L6[3,4]。GALNTs作為黏液蛋白糖基化的誘導(dǎo)劑，其表達(dá)可以改變腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力和耐藥性[3,4]，對(duì)人類泌尿生殖系統(tǒng)癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有影響[5]。例如，GALNT1突變引起的糖基化異常與膀胱癌的發(fā)生有關(guān)，GALNT3在惡性程度較高的腎細(xì)胞癌和前列腺癌患者中高表達(dá)[3]；GALNT4高表達(dá)的腎透明細(xì)胞癌患者的無病生存率(Disease Free Survival，DFS)明顯升高，GALNT10的高表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的Tumor Node Metastasis (TNM)分期進(jìn)展相關(guān)[6,7]。因此，可推測(cè)GALNTs參與了泌尿生殖系統(tǒng)中大多數(shù)癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。GALNT14不僅能抑制細(xì)胞遷移、改變細(xì)胞形態(tài)，而且會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育過程中增殖不足或過度，從而導(dǎo)致生長(zhǎng)缺陷[6]。GALNT14在人類生長(zhǎng)發(fā)育過程中能引起破壞性的孟德爾突變，從而導(dǎo)致胚胎死亡[8]。另外，GALNT14還可以改變凋亡信號(hào)的組織侵襲性，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的遷移，從而對(duì)乳腺、肺、胃腸道和卵巢惡性腫瘤的預(yù)后產(chǎn)生影響[4,9]。但迄今為止，對(duì)GALNT14的研究大多為其在呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)腫瘤中所起的作用[1,10,11]，尚無全面的生物信息學(xué)分析GALNT14在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義。因此，本研究利用The Cancer Genome Atlas (TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)探討GALNT14對(duì)腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的影響，旨在發(fā)掘與腎透明細(xì)胞癌治療相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)收集

所有與腎透明細(xì)胞癌相關(guān)的數(shù)據(jù)(包括臨床信息和相應(yīng)的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù))均從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載。使用Perl軟件和R軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行排序和提取，并將表達(dá)式數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)合并。無臨床信息、mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的病例，以及非原發(fā)性腎透明細(xì)胞癌的病例被排除在外。最終，共611例具有詳細(xì)GALNT14表達(dá)數(shù)據(jù)的腎透明細(xì)胞癌原發(fā)腫瘤組織樣本和537組從TCGA下載的腎透明細(xì)胞癌患者的臨床數(shù)據(jù)(包括患者的年齡、性別、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、TNM分期及其生存狀況)用于后續(xù)分析。

1.2 GALNT14的表達(dá)

使用帶“l(fā)imma”軟件包的R軟件去除重復(fù)基因，即取重復(fù)基因的平均值，提取單基因表達(dá)量。將R軟件的“beeswarm”軟件包與Perl軟件相結(jié)合，進(jìn)行差異表達(dá)分析及配對(duì)差異表達(dá)分析，比較TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中GALNT14在癌旁樣本和腎透明細(xì)胞癌樣本中的表達(dá)水平。基于TCGA和Genotype-Tissue Expression (GTEx)數(shù)據(jù)庫(kù)中9 736個(gè)腫瘤樣本和8 587個(gè)正常組織樣本，在Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA)數(shù)據(jù)庫(kù)——由北京大學(xué)研制開發(fā)的在線應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)中分析GALNT14在癌癥和正常癌旁組織中RNA的表達(dá)差異，驗(yàn)證GALNT14在腎透明細(xì)胞癌患者中的表達(dá)水平。另外，采用Starbase v3.0 (http://starbase.sysu.edu.cn/)、UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/)等在線分析工具和CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portals.broadinstitute.org/ccle/about)進(jìn)一步驗(yàn)證GALNT14在腎透明細(xì)胞癌的表達(dá)水平。

1.3 臨床相關(guān)性分析

用Perl軟件檢測(cè)GALNT14表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者臨床特征的相關(guān)性，使用Logistic回歸分析GALNT14表達(dá)在腎透明細(xì)胞癌中的臨床意義。以從TCGA下載的539個(gè)腎透明細(xì)胞癌樣本的中位數(shù)為分界點(diǎn)，將樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組兩部分。利用R軟件Logistic回歸分析GALNT14在高/低表達(dá)組中的表達(dá)水平是否存在差異及差異程度。采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)和UALCAN在線分析工具檢測(cè)GALNT14的表達(dá)特征。

1.4 生存分析及COX回歸分析

使用Perl軟件從Extensible Markup Language(XML)中提取臨床樣本數(shù)據(jù)的信息矩陣，將生存分析與Kaplan-Meier生存分析相結(jié)合，并使用R軟件及閾值為P<0.05的“生存”軟件包進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)，計(jì)算P值,分析GALNT14表達(dá)組間的總生存率(Overall Survival,OS)差異。同時(shí)，采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)、Starbase v3.0、UALCAN及Kaplan-Meier Plotter (http://kmplot.com/analysis/)在線分析工具檢測(cè)GALNT14在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及預(yù)后(總生存率或無病生存率)。使用R軟件的Survival和SurvMiner軟件包進(jìn)行COX回歸分析，對(duì)影響患者OS的預(yù)后因素進(jìn)行單因素和多因素分析，以確定GALNT14的預(yù)后價(jià)值。采用單因素COX回歸分析估計(jì)腎透明細(xì)胞癌患者總生存期與GALNT14表達(dá)水平的相關(guān)性，采用多因素COX回歸分析驗(yàn)證GALNT14表達(dá)與生存期、其他臨床特征的相關(guān)性，其中P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 甲基化分析

本研究使用UALCAN在線分析工具來評(píng)估腎透明細(xì)胞癌中GALNT14啟動(dòng)子的甲基化修飾水平及其與臨床特征的關(guān)系。分析步驟為①選擇功能鍵：TCGA；②輸入基因類型：GALNT14；③選擇樣本類型：Kidney renal clear cell carcinoma；④鏈接分析：Methylation；⑤選擇不同腫瘤亞類中啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)：樣本類型、年齡、性別、分級(jí)和轉(zhuǎn)移狀態(tài)等。另外，使用β值表示DNA甲基化程度，范圍從0(未甲基化)到1(完全甲基化)。β值為0.50-0.70時(shí)表示超甲基化，β值為0.25-0.30時(shí)表示低甲基化[12]。

1.6 共表達(dá)基因分析

為探究GALNT14的共表達(dá)基因及其表達(dá)水平，本研究使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)(一個(gè)公開門戶網(wǎng)站，包含來自 TCGA 的32種癌癥的多組數(shù)據(jù)，http://www.linkedomics.org/)和GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genemania.org)分析其基因共表達(dá)情況。從STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.string-db.org/)中獲得與GALNT14相互作用的蛋白質(zhì)，并在LinkedOmics 網(wǎng)站中的 LinkFinder 模塊中分析GALNT14共表達(dá)基因在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)水平。分析步驟為 ①選擇腫瘤類型：腎透明細(xì)胞癌(KIRC)；②選擇數(shù)據(jù)類型：RNAseq、HiSeq RNA；③選擇樣本類型：不輸入；④選擇數(shù)據(jù)屬性：GALNT14；⑤選擇靶數(shù)據(jù)類型：Clinical；⑥選擇統(tǒng)計(jì)方法:非參數(shù)檢驗(yàn)。本研究中輸入“GALNT14”，物種類型選擇“人類”，置信度選擇“Medium 0.400”，相互作用最大數(shù)選擇“20”。

1.7 基因集富集分析(GSEA)

利用京都基因與基因組百科全書(KEGG，http://www.genome.jp/kegg/)對(duì)腎透明細(xì)胞癌中與GALNT14相關(guān)的潛在生物信號(hào)通路進(jìn)行研究。根據(jù)GALNT14mRNA的中位數(shù)，將所有基因按順序排列后分為GALNT14高表達(dá)組(n=269)和GALNT14低表達(dá)組(n=270)。GSEA每次分析均執(zhí)行1 000個(gè)基因組序列。此外，為使多途徑富集結(jié)果更明了，使用R軟件的“ggplot2”軟件包、“plyr”軟件包、“grid”軟件包和“gridExtra”軟件包對(duì)GALNT14進(jìn)行多基因集富集分析。用歸一化富集評(píng)分(NES)對(duì)每個(gè)表型富集的途徑進(jìn)行分類，標(biāo)準(zhǔn)化P值(NOMP值)<0.05的基因集被認(rèn)為顯著富集。

2 結(jié)果與分析

2.1 研究人群的特征

根據(jù)聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織的年齡劃分標(biāo)準(zhǔn)，將各年齡人群按照以下標(biāo)準(zhǔn)劃分：18-65歲為年輕人、66-79歲為中年人和80-99歲為老年人，這3個(gè)年齡組在本研究中的比例分別為65.5%、29.8%和4.7%，平均年齡為61歲。本研究中，腎透明細(xì)胞癌的組織學(xué)分級(jí)包括G1、G2、G3、G4和GX，G1占2.6%，G2占42.8%，G3占38.5%，G4占14.5%，GX占0.9%；病理學(xué)分期中Ⅰ期269例(50.1%)，Ⅱ期57例(10.6%)，Ⅲ期125例(23.3%)，Ⅳ期83例(15.5%)，具體情況如表1所示。

表1 腎透明細(xì)胞癌患者的特征

續(xù)表

2.2 GALNT14在癌及正常癌旁組織中的表達(dá)

差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，與正常癌旁組織相比，GALNT14在腎透明細(xì)胞癌組織中顯著高表達(dá)[P=1.433e-25，圖1(a)]。配對(duì)差異分析結(jié)果表明，腫瘤組織中GALNT14的表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組[P=1.752e-18，圖1(b)]。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，與正常癌旁組織(n=100)相比，GALNT14的表達(dá)水平在腎透明細(xì)胞癌(n=523)中明顯上調(diào)[P<0.05，圖1(c)]。StarBase v3.0數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，與相鄰正常組織(n=72)相比，腎透明細(xì)胞癌組織(n=535)中GALNT14的表達(dá)水平明顯上調(diào)[(P<0.05，圖1(d)]。UALCAN在線工具分析結(jié)果顯示，和正常癌旁組織(n=72)相比，GALNT14在腎透明細(xì)胞癌(n=533)中顯著高表達(dá)[P=1.62e-12，圖1(e)]。此外，為驗(yàn)證上述生物信息學(xué)分析結(jié)果，通過CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)分析證實(shí)，GALNT14在人腎透明細(xì)胞癌ACHN細(xì)胞和腎癌A498細(xì)胞中高表達(dá)。綜上，所有結(jié)果均顯示GALNT14在癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常癌旁組織，表明GALNT14可能是影響腎透明細(xì)胞癌預(yù)后的潛在關(guān)鍵基因。

圖1 GALNT14在腎透明細(xì)胞癌及正常癌旁組織中的表達(dá)情況

2.3 腎透明細(xì)胞癌中 GALNT14表達(dá)與患者臨床特征的相關(guān)性

GALNT14在臨床分期[P=0.009，圖2(a)]、T期[P=4.104e-05，圖2(e)]、M期[P=0.005，圖2(f)]和生存狀態(tài)[P=3.988e-05，圖2(h)]這些不同亞組間的表達(dá)有顯著差異，在組織分級(jí)[P=0.059，圖2(b)]、年齡[P=0.468，圖2(c)]、性別[P=0.084，圖2(d)]和N期[P=0.168，圖2(g)]這些亞組間的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。亞組分析顯示，腎透明細(xì)胞癌中GALNT14的高表達(dá)與分期、分級(jí)和年齡等臨床特征顯著相關(guān)(P<0.05，表2)。同樣，UALCAN在線分析工具檢測(cè)結(jié)果顯示GALNT14在分期[圖3(a)]、分級(jí)[圖3(b)]、年齡[圖3(c)]、性別[圖3(d)]和N期[圖3(e)]表達(dá)上調(diào)，且分級(jí)和分期的等級(jí)越高，GALNT14的表達(dá)越少[圖3：(a)(b)]。此外，單因素Logistic回歸分析顯示，GALNT14與臨床病理特征相關(guān)，且預(yù)后良好，此外，GALNT14在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)具有顯著的性別差異(P=2.21e-02,表2)。

圖2 GALNT14的表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者臨床特征的相關(guān)性

表2 Logistic 回歸和UALCAN中 GALNT14表達(dá)量與臨床病理學(xué)的相關(guān)性分析

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.4 GALNT14對(duì)腎透明細(xì)胞癌患者生存率的預(yù)后價(jià)值

GALNT14在GEPIA、Starbase v3.0、UALCAN、Kaplan-Meier Plotter等分析中的結(jié)果均顯示GALNT14的高表達(dá)與患者的高OS相關(guān)，且結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[圖4:(a)-(d)]。最后，森林圖顯示GALNT14的表達(dá)與OS之間的相關(guān)性(圖5)。由上述可知GALNT14與腎透明細(xì)胞癌患者的OS顯著相關(guān)。此外，GEPIA結(jié)果顯示，GALNT14的高表達(dá)與患者的低DFS相關(guān)[圖6(a)]。Kaplan-Meier >Plotter結(jié)果也顯示，GALNT14高表達(dá)與患者的低DFS相關(guān)[(P=0.009 1，圖6(b)]。由此可知，GALNT14表達(dá)上調(diào)與腎透明細(xì)胞癌患者DFS負(fù)相關(guān)。

圖4 GALNT14表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者總生存率的相關(guān)性

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

圖6 GALNT14的表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者無病生存率的相關(guān)性

2.5 COX回歸分析

單因素COX分析顯示，在腎透明細(xì)胞癌中GALNT14表達(dá)越高，OS越高[風(fēng)險(xiǎn)比HR=0.75，95%置信區(qū)間(CI)為0.66-0.86，P<0.001]。如表3所示，與OS相關(guān)的其他臨床病理變量包括臨床分期(HR=1.86，95% CI為1.54-2.25，P=1.26e-10)、區(qū)域淋巴結(jié)受累情況(HR=2.93，95% CI為1.52-5.67，P=0.001)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(HR=4.07，95% CI為2.63-6.30，P=2.76e-10)。另外，多因素COX分析顯示，GALNT14表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者的OS顯著相關(guān)(HR=0.74，95% CI為0.63-0.86，P=0.000 1)。GALNT14表達(dá)還與腎透明細(xì)胞癌的組織分級(jí)(HR=1.49，95% CI為1.06-2.09，P=0.02)、患者年齡(HR=3.32，95% CI為1.42-7.72，P=0.01)相關(guān)。由此可知，GALNT14可作為腎透明細(xì)胞癌的獨(dú)立預(yù)后因子。

表3 GALNT14與OS相關(guān)性的單因素和多因素分析

2.6 GALNT14啟動(dòng)子的甲基化結(jié)果

與正常癌旁組織相比，腎透明細(xì)胞癌中GALNT14啟動(dòng)子的甲基化水平較低[P<0.001，圖7(a)、表4]。此外，根據(jù)不同的臨床特征對(duì)GALNT14啟動(dòng)子的甲基化水平進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA甲基化在腫瘤分級(jí)和臨床分期等指標(biāo)上也有所不同[圖7:(b)-(f)]，其與GALNT14轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的翻譯水平呈相反趨勢(shì)。從上述結(jié)果可以推斷，提高GALNT14啟動(dòng)子的甲基化水平可能會(huì)下調(diào)腎透明細(xì)胞癌中的GALNT14表達(dá)。

*P<0.05,**P<0.01,***P < 0.001

表4 GALNT14甲基化水平與腎透明細(xì)胞癌臨床特征的關(guān)系分析

2.7 GALNT14作為腎透明細(xì)胞癌的獨(dú)立預(yù)后因子

由于GALNT14在腎透明細(xì)胞癌的表達(dá)中顯著上調(diào)(圖1)，并與患者預(yù)后(包括OS和DFS，圖4-6)密切相關(guān)，推測(cè)GALNT14在腎透明細(xì)胞癌中作為獨(dú)立預(yù)后因子存在?？紤]到基因間高度相關(guān)性[13]，利用LinkedOmics和GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GALNT14進(jìn)行基因共表達(dá)分析。GALNT14在腎透明細(xì)胞癌中的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析顯示，與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的互作關(guān)鍵基因的核心基因?yàn)镚ALNT14，其中與GALNT14相互作用關(guān)系較為顯著的基因是MUC13、MUC2及MUC5AC，意味著GALNT14可能會(huì)與hub基因相互作用而影響腎透明細(xì)胞癌的進(jìn)展[圖8(a)]。在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得GALNT14的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(Protein-Protein Interaction，PPI)[圖8(b)]，從圖中可以看出GALNT14表達(dá)產(chǎn)物與其他蛋白質(zhì)在腎透明細(xì)胞癌中的相互作用及功能聯(lián)系，對(duì)臨床上了解腎透明細(xì)胞癌生物信號(hào)和能量物質(zhì)代謝的反應(yīng)機(jī)制有一定幫助。GALNT14在腎透明細(xì)胞癌中共表達(dá)的基因以火山圖顯示[圖8(c)]，陽(yáng)性和陰性共表達(dá)基因的前50名分別以熱圖展示[圖8：(d)(e)]，這些熱圖全面展示了腎透明細(xì)胞癌中與GALNT14相關(guān)的差異表達(dá)基因及其在不同樣本中的表達(dá)。

圖8 GALNT14的共表達(dá)基因及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.8 基于GSEA的GALNT14相關(guān)生物信號(hào)通路

利用從TCGA下載的數(shù)據(jù)對(duì)GALNT14高表達(dá)組和低表達(dá)組進(jìn)行基因集富集分析，以探索共調(diào)控基因介導(dǎo)的生物信號(hào)通路。GSEA顯示GALNT14在分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)(MSigDB)集合的豐富度方面存在顯著差異，依其歸一化富集評(píng)分選擇與腎透明細(xì)胞癌相關(guān)的富集信號(hào)通路或生物學(xué)相關(guān)過程。結(jié)果表明，GALNT14的高表達(dá)與以下富集通路顯著相關(guān)：組氨酸代謝[圖9(a)]、過氧物酶體[圖9(b)]，腎素-血管緊張素系統(tǒng)[圖9(c)]、果糖和甘露糖代謝[圖9(d)]、色氨酸代謝[圖9(e)]、β-丙氨酸代謝[圖9(f)]、精氨酸和脯氨酸代謝[圖9(g)]、糖酵解糖異生[圖9(h)]、脂肪酸代謝[圖9(i)]。此外，為使基因富集分析的結(jié)果顯示更清晰，將GALNT14的高表達(dá)組與低表達(dá)組相結(jié)合，結(jié)果提示GALNT14在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[圖9(j)]。

3 討論

本研究首次分析并發(fā)現(xiàn)GALNT14在腎透明細(xì)胞癌中過表達(dá)，且可能是腎透明細(xì)胞癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。差異表達(dá)分析和COX回歸分析結(jié)果顯示，GALNT14的表達(dá)在腎透明細(xì)胞癌的組織分級(jí)、T分期和生存狀態(tài)中存在顯著性差異。已有研究表明GALNT14在包括卵巢癌在內(nèi)的多種癌癥中表達(dá)，其上調(diào)加快高級(jí)別卵巢癌的進(jìn)展[1]，其高表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲和增殖[1,14]，提高乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[9]。因此，GALNT14過表達(dá)可能促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和進(jìn)展，繼而影響腎透明細(xì)胞癌的分級(jí)、T分期和轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示，GALNT14的表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者的總體生存期OS顯著正相關(guān)，與無病生存期DFS顯著負(fù)相關(guān)。值得注意的是，GALNT14表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者OS從初期至末期一直為正相關(guān)，但是與患者的DFS在初期為正相關(guān)，至中末期為負(fù)相關(guān)。結(jié)合兩者定義(OS是指診斷日期到最后一次隨訪或死亡日期之間的時(shí)間，任何引起死亡的原因均包括在內(nèi)；DFS指從診斷日期到第一次復(fù)發(fā)或最后一次隨訪或死亡日期之間的時(shí)間，以先發(fā)生者為準(zhǔn)[15])可知，DFS比OS多納入因該疾病第一次復(fù)發(fā)的患者死亡數(shù)據(jù)，而OS將一些不明原因?qū)е碌乃劳鰯?shù)據(jù)也納入；加之腎透明細(xì)胞癌極易轉(zhuǎn)移，在進(jìn)行部分或根治性腎切除術(shù)后仍有約30%的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)的情況[2]，這部分患者的生存率數(shù)據(jù)也是DFS和OS出現(xiàn)差異的原因之一。因此，DFS對(duì)分析腎透明細(xì)胞癌的生存率數(shù)據(jù)更具針對(duì)性。GALNT14表達(dá)與患者的DFS在初期為正相關(guān)，至中、末期為負(fù)相關(guān)，可見GALNT14高表達(dá)在腎透明細(xì)胞癌的中、末期是影響患者生存的關(guān)鍵。另外，癌癥分級(jí)、轉(zhuǎn)移與患者患病時(shí)間關(guān)系密切，這也與結(jié)果中GALNT14的高表達(dá)影響腎透明細(xì)胞癌的分級(jí)、轉(zhuǎn)移相符。已有研究表明具有較低級(jí)別、低分期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腎透明細(xì)胞癌患者，比具有其他臨床特征的患者可能有更長(zhǎng)的生存期[16]。因此，GALNT14高表達(dá)可能與中、末期腎透明細(xì)胞癌患者生存率下降相關(guān)。

單因素和多因素COX分析結(jié)果提示，GALNT14在腎透明細(xì)胞癌中是一種新的生物標(biāo)志物，且可能是腎透明細(xì)胞癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子。在其他癌癥研究方面，已有研究表明GALNT14可能是肺癌轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)因素，導(dǎo)致肺癌患者生存期較低[17]。GALNT14-rs9679162的TT基因型與肝細(xì)胞癌的良好預(yù)后有關(guān)[18]。GALNT14與胰腺導(dǎo)管腺癌病人胰腺導(dǎo)管腺切除后的進(jìn)展、生存期，特別是OS相關(guān)，且可作為胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后指標(biāo)[19]。GALNT14基因型與切除后膽管癌的神經(jīng)浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和OS相關(guān)[20]。此外，GALNT14的表達(dá)影響乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力，且與乳腺癌病人生存期有關(guān)[21]。由此可知，GALNT14與多種癌癥的轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。因此，GALNT14可能通過促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移影響腎透明細(xì)胞癌的進(jìn)展，且可作為腎透明細(xì)胞癌的獨(dú)立預(yù)后因子。

本研究發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌中GALNT14啟動(dòng)子的甲基化水平較低。不同的DNA甲基化模式在病理分級(jí)、臨床分期及其他臨床指標(biāo)上存在差異。癌基因的低甲基化在細(xì)胞癌變過程中起著不可或缺的作用，其通常與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[22]。基因異常甲基化導(dǎo)致的癌變?cè)谒心[瘤中都很常見，高甲基化通常伴隨著腫瘤抑制基因的表觀遺傳沉默和隨之產(chǎn)生的腎組織功能改變，異常增強(qiáng)子高甲基化已被證明是腎透明細(xì)胞癌患者生存不良的預(yù)測(cè)因子[23,24]。另有研究表明，甲基化的高修飾與腎透明細(xì)胞癌的高分期和分級(jí)相關(guān)[25,26]，這與本研究的結(jié)果一致。本研究首次發(fā)現(xiàn)GALNT14甲基化與腎透明細(xì)胞癌臨床特征具有相關(guān)性，為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

通過基因富集分析發(fā)現(xiàn)，GALNT14顯著富集在氨基酸代謝、脂肪酸代謝和糖代謝等通路上。已有研究表明，糖代謝、氨基酸代謝和脂肪酸降解等過程影響腎透明細(xì)胞癌的組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后[27,28]。在氨基酸代謝方面，已有研究發(fā)現(xiàn)賴氨酸代謝增強(qiáng)與腎透明細(xì)胞癌較高的病理分期、較差的生存期及腫瘤級(jí)別顯著相關(guān)[29]。此外，絲氨酸/蘇氨酸的活性增強(qiáng)能夠?qū)е履I透明細(xì)胞癌病人預(yù)后不良[30]。在脂肪酸代謝方面，腎透明細(xì)胞癌是一種以脂質(zhì)積聚和儲(chǔ)存為組織學(xué)特征的代謝性疾病，與腫瘤進(jìn)展有關(guān)[31]；癌細(xì)胞中的脂肪酸代謝紊亂可能是腎透明細(xì)胞癌患者腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后的重要機(jī)制[32]；此外，已有研究發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌中脂肪酸減少與腫瘤高T分期、分級(jí)和預(yù)后不良相關(guān)[31,33]。在糖代謝方面，腎透明細(xì)胞癌患者通常會(huì)出現(xiàn)糖代謝能力失調(diào)的現(xiàn)象[34]。腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞攝取葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體數(shù)量增多，導(dǎo)致葡萄糖積累繼而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[35]，這與本研究發(fā)現(xiàn)GALNT14過表達(dá)影響糖代謝的結(jié)果基本一致。另有研究指出，腎透明細(xì)胞癌中糖酵解的加速誘導(dǎo)癌細(xì)胞代謝重組，為其快速提供能量和營(yíng)養(yǎng)，維持腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的高速增殖，這往往預(yù)示著患者預(yù)后不良[36]。同時(shí)，氨基酸代謝、脂肪酸代謝和糖代謝在腎透明細(xì)胞癌的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。因此，本研究推測(cè)GALNT14通過上述代謝相關(guān)通路調(diào)控腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。然而，GALNT14高表達(dá)的預(yù)后僅限于Ⅰ期和Ⅳ期腎透明細(xì)胞癌，更多有力的證據(jù)還需要進(jìn)一步試驗(yàn)。

4 結(jié)論

GALNT14在調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常癌旁組織樣本相比，GALNT14在腎透明細(xì)胞癌患者中過表達(dá)，且其過表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，說明GALNT14可能是影響腎透明細(xì)胞癌預(yù)后的潛在關(guān)鍵基因。從GALNT14的基因富集通路來看，GALNT14主要參與調(diào)控氨基酸代謝、脂肪酸代謝、糖代謝等與腫瘤代謝密切相關(guān)的通路。因此，GALNT14可作為腎透明細(xì)胞癌的獨(dú)立預(yù)后因子，并可作為臨床診斷和治療腎透明細(xì)胞癌的潛在靶標(biāo)，對(duì)揭示腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制和后續(xù)的靶向治療有著積極的作用。