超聲波輔助大孔樹脂提取淺色葵花籽蛋白工藝的研究

秦那日蘇，李泓頡，李雪馨，聶記記，包小蘭

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018)

葵花籽是我國重要的油料作物之一，目前主要用于提取油脂，提取油脂后的副產(chǎn)品即為葵花籽餅(粕)?？ㄗ扬灨缓鞍踪|(zhì)，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為29%～43%[1]?？ㄗ训鞍椎陌被峤M成較為均衡，抗?fàn)I養(yǎng)成分和有毒物質(zhì)也較少[2,3]，是優(yōu)質(zhì)植物蛋白。由于葵花籽餅中所含的多酚類物質(zhì)(主要為綠原酸)在蛋白質(zhì)提取過程中在堿性條件下容易氧化，發(fā)生褐變，導(dǎo)致提取的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)深綠色或深灰色[4]，其顏色難以被大眾所接受。此外，天然葵花籽餅蛋白的功能特性也相對(duì)較差，這也導(dǎo)致其在食品加工領(lǐng)域中受到了很大的限制。因此，從葵花籽餅中去除多酚提取淺色葵花籽蛋白的同時(shí)改善其功能特性，是目前急需解決的問題。

大孔吸附樹脂是一種有機(jī)高聚物吸附劑，具有吸附速度快、樹脂再生簡(jiǎn)便和純化能力高效等優(yōu)點(diǎn)[5]。有研究曾報(bào)道，在弱酸性條件下，采用AB-8型大孔樹脂吸附處理可以吸附脫除多酚從而提取出淺色的葵花籽蛋白，其L*值和色澤均顯著改善[6]。但是，大孔樹脂吸附處理對(duì)葵花籽蛋白功能特性的改善效果不明顯。因此，需要通過改性的手段來改善蛋白的功能性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)限制性酶解結(jié)合大孔樹脂處理會(huì)顯著改善葵花籽蛋白的色澤和功能特性[7]，但酶解改性往往會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和完整性。而超聲改性具有易控制、安全性好、營養(yǎng)價(jià)值損害小等優(yōu)點(diǎn)，且不會(huì)破壞蛋白的初級(jí)結(jié)構(gòu)[8]，很大程度上可以保持蛋白的完整性。因此，在前期研究工作的基礎(chǔ)和思路上，以低溫脫脂葵花籽餅為原料，研究了超聲波輔助大孔樹脂處理對(duì)葵花籽蛋白色澤和功能特性的影響。以期為葵花籽餅蛋白的脫色和改性方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂葵花籽餅，大孔吸附樹脂，所用的試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CR-10型色度計(jì)，UV-2300紫外可見分光光度計(jì)，F(xiàn)DU-2200型冷凍干燥機(jī)，超聲波細(xì)胞破碎儀。

1.3 方法

1.3.1 葵花籽餅蛋白的制備

將低溫脫脂葵花籽餅?zāi)ニ槌煞塾?0 mm篩子過篩，根據(jù)秦那日蘇等[6]的堿溶酸沉法制備葵花籽餅蛋白。將獲得的葵花籽蛋白儲(chǔ)存在4 ℃冰箱?？ㄗ训鞍状值鞍踪|(zhì)量分?jǐn)?shù)(N×6.25)為85.62%，采用凱氏定氮法測(cè)定。

1.3.2 大孔樹脂吸附處理的葵花籽蛋白的制備

根據(jù)秦那日蘇等[6]的方法制備大孔樹脂吸附處理的低多酚淺色的葵花籽餅蛋白。將獲得的蛋白儲(chǔ)存在4 ℃冰箱，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91.77%。

1.3.3 超聲波輔助大孔樹脂吸附處理的葵花籽蛋白的制備

稱取50 g脫脂葵花籽粉，按設(shè)定料液比例加入1.3 mol/L的氯化鈉溶液混合均勻后在25 ℃恒溫水浴鍋中攪拌1 h，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至6.0，然后在恒溫水浴鍋中攪拌1 h，4 000 r/min離心15 min收集上清液，調(diào)節(jié)溶液pH至7.0，按設(shè)定的超聲功率下超聲，用不同類型大孔樹脂進(jìn)行吸附(10%大孔樹脂，120 min)收集上清液，調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)3.8，用30 mL蒸餾水將沉淀水洗3次，4 000 r/min離心15 min收集沉淀，用少量蒸餾水將沉淀溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0，冷凍干燥保存?zhèn)溆?，其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.59%。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以L*值作為指標(biāo)，分別考察對(duì)料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)、超聲功率(100、150、200、250、300 W)、超聲時(shí)間(10、15、20、25、30 min)和樹脂添加量(6%、8%、10%、12%、14%)4個(gè)因素對(duì)葵花籽蛋白L*值的影響。

1.3.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用正交軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)條件，以L*值作為指標(biāo)，料液比(A)、超聲功率(B)、超聲時(shí)間(C)、樹脂添加量(D) 為自變量，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 色度

使用 CR-10 色度計(jì)在 CIE-L*值顏色系統(tǒng)中測(cè)量葵花籽蛋白蛋白的色度，取3次測(cè)量的平均值，色度值包括L*、a*、b*值，L*的值表示亮度，L*值越高表明顏色越白，a*值與b*值表示色度，a*值為正時(shí)表示紅色，b*值為正時(shí)表示黃色。

1.3.7 蛋白質(zhì)得率

蛋白質(zhì)得率=上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量×100%/脫脂葵花籽餅質(zhì)量

1.3.8 溶解度

根據(jù)Bera等[9]的方法測(cè)定并稍作修改，配制50 mL 1 g/100 mL的蛋白溶液，在25 ℃下攪拌1 h，然后用0.1 mol/L HCl或NaOH調(diào)pH至7.0，再攪拌30 min后，4 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)使用凱式定氮儀進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定。通過式(1)計(jì)算溶解度。

(1)

1.3.9 乳化性(EAI)及乳化穩(wěn)定性(ESI)

根據(jù)Yust等[10]的方法來測(cè)定并稍作修改，用蒸餾水配制質(zhì)量濃度為1%的蛋白樣品溶液，將15 mL蛋白質(zhì)溶液與5 mL葵花籽油攪拌混合，在12 000 r/min的條件下均質(zhì)2 min。分別在0 min和靜置10 min時(shí)從容器底部取50 μL乳濁液，與5 mL(0.1%)的SDS溶液混合均勻，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)500 nm處0 min(A0)和10 min(A10)時(shí)測(cè)定吸光度值。按公式計(jì)算乳化性和乳化穩(wěn)定性。

(2)

(3)

式中：DF為樣品稀釋倍數(shù)，100；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量/g/mL；Φ為光程，設(shè)定為0.01；θ為乳狀液的油體積分?jǐn)?shù)，0.25。

1.3.10 起泡性(FC)及泡沫穩(wěn)定性(FS)

根據(jù)Motoi等[11]的方法測(cè)定并稍作修改，用蒸餾水配制質(zhì)量濃度為1%的蛋白質(zhì)樣品溶液。取50 mL樣品溶液置于高速均質(zhì)機(jī)內(nèi)，以 12 000 r/min的轉(zhuǎn)速攪打2 min。然后快速轉(zhuǎn)移到100 mL 的量筒中。分別在0 min 和30 min 時(shí)記錄起泡體積V0及V30。按公式計(jì)算起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

(4)

(5)

1.3.11 持水性

根據(jù)Wani等[12]的方法并稍作修改。稱0.5g蛋白樣品記錄為m0，將樣品稱入離心管中，記錄質(zhì)量為m1，加入蒸餾水，然后漩渦混合5 min，直到樣品被水飽和，室溫靜置30 min，4 500 r/min離心15 min后，將上清液的水去掉，稱離心管質(zhì)量記為m2。

(6)

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用 Origin 2017作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

由表1可知，與未處理的葵花籽蛋白相比，經(jīng)不同類型的大孔樹脂吸附處理后其L*值顯著提高，色澤也明顯改善。其中通過AB-8型大孔樹脂吸附處理的脫色效果最好，其L*值達(dá)到最大值，為72.2。與單一的大孔樹脂吸附處理的葵花籽蛋白相比，超聲波輔助大孔樹脂吸附處理的葵花籽蛋白的脫色效果更佳，其色度改善更加明顯。其中超聲波輔助AB-8型大孔樹脂吸附處理的脫色效果最好，其L*值達(dá)到最大值為80.5，因此，選擇超聲波輔助AB-8型大孔樹脂吸附處理進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

表1 不同類型大孔樹脂吸附處理對(duì)葵花籽蛋白L*值的影響

2.2 單因素條件對(duì)葵花籽蛋白L*值的影響

2.2.1 料液比對(duì)葵花籽蛋白L*值的影響

由圖1可知，隨著料液比的增加，葵花籽蛋白的L*值逐漸提高。在料液比為1∶15 g/mL時(shí)，葵花籽蛋白的L*值達(dá)到最大值為80.53，但是隨著料液比的進(jìn)一步增加，葵花籽蛋白的L*值呈現(xiàn)先顯著下降后平衡趨勢(shì)。從L*值和成本角度考慮，正交實(shí)驗(yàn)分析時(shí)選擇料液比為1∶10、1∶15、1∶20 g/mL。

圖1 不同處理對(duì)葵花籽蛋白L*值的影響

2.2.2 超聲功率對(duì)葵花籽蛋白L*值的影響

由圖1可知，隨著超聲功率的增加，葵花籽蛋白的L*值呈先平緩后顯著上升的趨勢(shì)。在超聲功率為200 W時(shí)，葵花籽蛋白的L*值達(dá)到最大值，但是隨著超聲功率的進(jìn)一步增加，葵花籽蛋白的L*值呈現(xiàn)先顯著下降后平緩上升趨勢(shì)。在超聲功率為250 W時(shí)葵花籽蛋白L*值達(dá)到最低為74.3。因此，正交實(shí)驗(yàn)分析時(shí)選擇超聲功率為100、150、200 W。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)葵花籽蛋白L*值的影響

由圖1可知，隨著超聲時(shí)間的增加，葵花籽蛋白的L*值呈現(xiàn)先平緩后顯著上升的趨勢(shì)的趨勢(shì)，在超聲時(shí)間為20 min時(shí)葵花籽蛋白的L*值達(dá)到最高，但隨著超聲時(shí)間的繼續(xù)增加，葵花籽蛋白的L*值呈顯著下降趨勢(shì)。因此，正交實(shí)驗(yàn)分析時(shí)選擇超聲時(shí)間為20、25、30 min。

2.2.4 樹脂添加量對(duì)葵花籽蛋白L*值的影響

由圖1可知，隨著樹脂添加量的增加，葵花籽蛋白的L*值呈先增加后平衡趨勢(shì)，在樹脂添加量為12%時(shí)葵花籽蛋白的L*值達(dá)到最高，隨著樹脂添加量的繼續(xù)增加，葵花籽蛋白的L*值未有顯著變化，達(dá)到了平衡趨勢(shì)，因此，正交實(shí)驗(yàn)分析時(shí)選擇樹脂添加量為10%、12%、14%。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以料液比(A)、超聲功率(B)、超聲時(shí)間(C)和樹脂添加量(D) 為自變量，以L*值為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表2，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表3 正交實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果分析表

從表3中比較極差R值大小可知，影響葵花籽蛋白脫色效果的各因素主次順序分別為A(料液比)>D(樹脂添加量)>C(超聲時(shí)間)>B(超聲功率)。通過正交實(shí)驗(yàn)得到最佳脫色工藝條件為：料液比1∶20 g/mL、超聲功率200 W、超聲時(shí)間25 min、和樹脂添加量10 %，在此條件下葵花籽蛋白的L*值為82.87、a*值為4.23、b*值為13.23。最優(yōu)水平組合為A3B1C2D1，即料液比1∶20 g/mL、超聲時(shí)間25 min、超聲功率100 W 和樹脂添加量10 %，在此條件下葵花籽蛋白的L*值為81.52、a*值為4.3、b*值為13.30。因此，選擇正交實(shí)驗(yàn)的參數(shù)為最佳脫色工藝條件。超聲波輔助大孔樹脂處理對(duì)葵花籽蛋白色澤的影響如圖2所示。

圖2 超聲波輔助大孔樹脂處理對(duì)葵花籽蛋白色澤的影響

2.4 功能特性分析

由表4可知，未處理葵花籽蛋白的得率較低為33.6%，大孔樹脂吸附處理后葵花籽蛋白的得率降低至31.2%。這可能是由于大孔樹脂吸附脫除多酚的同時(shí)部分蛋白質(zhì)也被吸附脫除，導(dǎo)致蛋白得率下降。經(jīng)超聲波協(xié)同大孔樹脂吸附處理后葵花籽蛋白的得率提高至50.35%。這是由于超聲波探針?biāo)a(chǎn)生的空化效應(yīng)在介質(zhì)中產(chǎn)生較高的湍流和剪切力，促使細(xì)胞壁破裂，所以蛋白溶出物就越多[13]。

未處理葵花籽蛋白的功能特性較差，這可能由于蛋白質(zhì)會(huì)與多酚類化合物相互作用后的發(fā)生褐變變成苯酚，苯酚很容易暴露在空氣中被氧化成醌類物質(zhì)，從而影響其功能特性[1]。經(jīng)大孔樹脂吸附處理和超聲波輔助大孔樹脂吸附處理后葵花籽蛋白的功能特性都顯著改善(P<0.05)。有研究報(bào)道，多酚物質(zhì)被脫除后葵花籽蛋白的溶解性、起泡性、乳化性和持水性均顯著提升[1,14,15]。超聲波探針?biāo)a(chǎn)生的空化效應(yīng)在介質(zhì)中產(chǎn)生較高的湍流和剪切力會(huì)破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)與水的相互作用增強(qiáng)，可溶性蛋白含量增加，從而使蛋白質(zhì)溶解度增強(qiáng)[16,17]。蛋白結(jié)構(gòu)被破壞之后，埋藏在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)數(shù)量發(fā)生變化，使蛋白質(zhì)更易在空氣和水的界面上展開，從而使乳化性、起泡性和持水性增強(qiáng)[18-20]。泡沫穩(wěn)定性的降低可能與超聲波的空化效應(yīng)產(chǎn)生的小分子蛋白沒有足夠的強(qiáng)度來維持泡沫的穩(wěn)定有關(guān)。

表4 超聲波協(xié)同大孔樹脂吸附處理對(duì)葵花籽蛋白功能特性的影響

3 結(jié)論

大孔樹脂篩選結(jié)果表明，超聲波輔助AB-8大孔樹脂吸附處理后葵花籽蛋白的脫色效果最佳，其L*值為80.10、a*值為3.9、b*值為13.1。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，得到制備淺色葵花籽蛋白的最佳工藝條件為：料液比1∶20 g/mL、超聲時(shí)間25 min、超聲功率200 W 和樹脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，在此條件下制備的葵花籽蛋白的L*值高達(dá)82.87，與未處理的葵花籽蛋白相比提高了32.79%。超聲波輔助大孔樹脂吸附處理后葵花籽蛋白的得率、溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和持水性均顯著改善(P<0.05)，分別提高了33.27%、19.04%、0.95 m2/g、0.73 min、6.04%、0.65 g/g。超聲波輔助AB-8型大孔樹脂吸附處理的方法不僅可以改善葵花籽蛋白的色澤，還能顯著提高得率和功能特性(P<0.05)。