米黑根毛霉α-淀粉酶的定向進(jìn)化、高效表達(dá)及在面包中的應(yīng)用

王玉川，馬俊文，李延嘯，劉海杰，閆巧娟，江正強(qiáng),3

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院；中國(guó)輕工業(yè)食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，北京 100083) (中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院2，北京 100083) (南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心3，南京 210023)

α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)能夠隨機(jī)水解淀粉內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生葡萄糖、麥芽寡糖和糊精等產(chǎn)物[1]。面包在儲(chǔ)存過程中會(huì)發(fā)生老化導(dǎo)致面包硬化和新鮮風(fēng)味喪失，通常需要加入一些添加劑來改良面包品質(zhì)和延緩面包老化[2]。細(xì)菌α-淀粉酶較為耐熱，在面包加工過程中易過度水解淀粉導(dǎo)致面包瓤發(fā)黏。一般真菌α-淀粉酶在中溫弱酸條件(30～50 ℃，pH 4.5～5.5)具有高酶活力，適合應(yīng)用于面包加工中，具有一定耐熱性的真菌α-淀粉酶更適合用于面包加工[2]。目前已有許多真菌α-淀粉酶的報(bào)道，但產(chǎn)酶水平低和應(yīng)用效果差仍是限制其在面包中應(yīng)用的主要問題。如蚜蟲假酵母菌(Pseudozymaaphidis)的α-淀粉酶應(yīng)用于面包加工中，添加量最高達(dá)25 000 U/kg，面包的體積沒有明顯的變化[3]；米根霉(Rhizopusoryzae)的α-淀粉酶，高效表達(dá)后酶活僅為429 U/mL[4]，產(chǎn)酶水平低。

基于定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)現(xiàn)有α-淀粉酶進(jìn)行分子改造可有效改善它們的酶學(xué)特性。Huang等[5]通過易錯(cuò)PCR對(duì)地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的α-淀粉酶(BLA)進(jìn)行定向進(jìn)化提升酶的耐酸性，突變體G81R在酸性pH 4.5下催化效率是野生型的1.4倍。Liu等[6]通過易錯(cuò)PCR對(duì)地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶(BLA)進(jìn)行定向進(jìn)化提升酶的耐酸性，突變體T353I/H400R在酸性pH 4.5下催化效率提高11.3倍。畢赤酵母(Pichiapastoris)作為一種外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具有分泌效率高、產(chǎn)量大和蛋白分離純化簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[7]。目前已有許多α-淀粉酶表達(dá)至畢赤酵母中。嗜堿單胞菌(Alkalimonasamylolytica)α-淀粉酶基因表達(dá)至畢赤酵母中，3-L發(fā)酵罐培養(yǎng)，畢赤酵母重組酶活力最高為600 U/mL[8]。嗜熱杜邦菌(Thermomycesdupontii)的α-淀粉酶成功在畢赤酵母中表達(dá)，5 L發(fā)酵罐甲醇誘導(dǎo)168 h，酶活高達(dá)38 314 U/mL[9]。

米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)α-淀粉酶(RmAmy)是一個(gè)非Ca2+依賴性α-淀粉酶，最適溫度為75 ℃，最適pH為6.0，但在酸性下的酶活力和耐酸性相對(duì)較低[10]。本研究利用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)RmAmy進(jìn)行分子改造，以提高該酶在面包中的應(yīng)用潛力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

葡萄糖至麥芽五糖標(biāo)準(zhǔn)品純度≥98%，其余試劑均為分析純。米黑根毛霉CAU432由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

臺(tái)盼藍(lán)初篩固體培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉10，無(wú)氨基酵母氮源13.4，甲醇5，臺(tái)盼藍(lán)0.1，生物素4×10-4，瓊脂15。

酸性臺(tái)盼藍(lán)初篩固體培養(yǎng)基：臺(tái)盼藍(lán)初篩固體培養(yǎng)基+100 mmol/L pH 5.0檸檬酸鹽緩沖液。

其余培養(yǎng)基參考PichiaFermentation Process Guidelines(Version B，053002，Invitrogen)。

1.2 α-淀粉酶基因隨機(jī)突變文庫(kù)的構(gòu)建

以米黑根毛霉CAU432基因組為模板，設(shè)計(jì)引物RmAmy-F (GCACAATCGAATTCAAGCCATTGCCACTCGC,EcoRⅠ)和RmAmy-R (GATATGATGCGGCCGCTTAAGCTCTCTGGAAAATAGCG,NotⅠ)，將RmAmy編碼序列進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增，構(gòu)建至載體pPIC9K上。易錯(cuò)PCR(50 μL)體系組成如下：0.2 mmol/L Mn2+、5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dGTP和dATP、1.0 mmol/LdCTP和dTTP、0.2 μmol/LRmAmy-F和RmAmy-R、1.25 U Taq DNA polymerase、5 ng重組質(zhì)粒pPIC9K-RmAmy(實(shí)驗(yàn)室保存)[10]。易錯(cuò)PCR條件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，反應(yīng)循環(huán)30次；72 ℃ 10 min。利用瓊脂糖凝膠純化回收易錯(cuò)PCR產(chǎn)物，得到擴(kuò)增產(chǎn)物mRmAmy。DNA改組參考李一男等[11]的方法進(jìn)行。

利用限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ和NotⅠ)酶切隨機(jī)突變基因，回收酶切產(chǎn)物。EcoRⅠ和NotⅠ酶切pPIC9K載體，回收載體骨架。將酶切產(chǎn)物與載體骨架相連接，利用酚/氯仿/異戊醇純化，乙醇沉淀得到連接產(chǎn)物，電轉(zhuǎn)法(參考MicroPulserTMElectroporation Apparatus說明)轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH 5α中，即為隨機(jī)突變體表達(dá)文庫(kù)。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證，選取10個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，隨機(jī)突變文庫(kù)中堿基突變率約為0.21%，氨基酸突變率約為0.39%。收集隨機(jī)突變文庫(kù)所有轉(zhuǎn)化子接入LB培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床培養(yǎng)4～5 h，提取質(zhì)粒和線性化，經(jīng)乙醇沉淀回收后，電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115中，并均勻涂布在MD平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)72 h。

1.3 RmAmy突變文庫(kù)篩選和高密度發(fā)酵

利用酸性臺(tái)盼藍(lán)初篩固體培養(yǎng)基(pH 5.0)初篩，具有酶活的菌株在菌落附近呈現(xiàn)清晰透明圈，根據(jù)透明圈大小篩選菌株。將初篩產(chǎn)生明顯透明圈的畢赤酵母菌株復(fù)篩，畢赤酵母菌株培養(yǎng)方法參考趙寧等[12]的方法。初步測(cè)定最適pH向酸性方向的突變體為正向突變體。選取正向突變體mRmAmy進(jìn)行5 L發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵步驟及相關(guān)培養(yǎng)基的配置參考PichiaFermentation Process Guidelines(Version B，053002，Invitrogen)。具體操作步驟參考趙寧等[12]的方法，主要分為分批培養(yǎng)，甘油流加培養(yǎng)和甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)3個(gè)階段。分批培養(yǎng)為接種后以30 ℃，pH 4.0和轉(zhuǎn)速600 r/min的條件發(fā)酵18～24 h；甘油流加培養(yǎng)是以50%甘油流加，當(dāng)菌體細(xì)胞濕重達(dá)到180～220 g/L范圍內(nèi)，停止補(bǔ)料；甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)是以100%甲醇流加進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間為168 h(30 ℃，pH 6.0，轉(zhuǎn)速800 r/min)。

1.4 突變體mRmAmy純化

高密度發(fā)酵后的發(fā)酵液經(jīng)離心(4 ℃、10 000 r/min和10 min)，取20 mL上清液(粗酶液)于磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)下4 ℃透析12 h后，離心(4 ℃、10 000 r/min和10 min)收集上清液。透析的上清液以0.5 mL/min的流速上樣于QSFF柱(20 mmol/L pH 8.0 磷酸鹽緩沖液平衡)，以20 mmol/L pH 8.0 磷酸鹽緩沖液沖洗QSFF柱至OD280小于0.1，將20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(150 mmol/L NaCl，pH 8.0)以1.0 mL/min的流速洗脫至OD280<0.1。20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(250 mmol/L NaCl，pH 8.0)以1.0 mL/min的流速在KTA蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，收集具有酶活力的組分，利用SDS-PAGE檢測(cè)分析。

1.5 α-淀粉酶酶活力和蛋白濃度測(cè)定

α-淀粉酶酶活力的測(cè)定采用DNS法[13]：將100 μL適當(dāng)稀釋后的酶液(50 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液，pH 5.0)加入900 μL可溶性淀粉溶液(1.0%，w/v，50 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液，pH 5.0)中，混勻后，65 ℃下反應(yīng)10 min。加入1 mL DNS溶液(1.0%)終止反應(yīng)，沸水浴10 min，測(cè)定OD540下的吸光度值，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)。α-淀粉酶的酶活力定義為：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量定義為1 U。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定參考Lowry等[14]的方法，以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6 突變體mRmAmy的酶學(xué)性質(zhì)

mRmAmy的最適pH測(cè)定按照DNS法在60 ℃下采用6種緩沖體系(50 mmol/L)配制成不同的可溶性淀粉溶液(1%)，以酶活力最高點(diǎn)為100%，比較不同緩沖體系中酶活力的差異。緩沖體系分別為：檸檬酸鹽緩沖液(pH 3.0～6.0)、醋酸鹽緩沖液(pH 4.0～6.0)、磷酸鹽緩沖液(pH 6.0～8.0)、MOPS緩沖液(pH 6.5～8.0)、Tris-HCl緩沖液(pH 7.0～9.0)和甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 9.0～10.5)。pH穩(wěn)定性的測(cè)定：分別采用不同緩沖體系(50 mmol/L)適當(dāng)稀釋純酶(蛋白終濃度>1 mg/mL)，在50 ℃下水浴30 min后，立即冰水浴30 min，測(cè)定酶活，以未處理的純酶酶活為100%，計(jì)算不同pH處理后酶活的差異。

mRmAmy最適溫度在pH 5.0(檸檬酸鹽緩沖液，50 mmol/L)、30～80 ℃范圍內(nèi)按照DNS法測(cè)定，以酶活力最高點(diǎn)為100%，比較不同溫度下酶活力的差異。mRmAmy溫度穩(wěn)定性的測(cè)定：采用檸檬酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 5.0)適當(dāng)稀釋純酶(蛋白終質(zhì)量濃度>1 mg/mL)，在不同溫度下保溫30 min后，立即冰水浴30 min，測(cè)定酶活，以未處理的純酶酶活為100%，計(jì)算不同溫度處理后酶活的差異。

采用檸檬酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 5.0)配制可溶性淀粉溶液(1%)，加入5 U/mL的mRmAmy，在50 ℃下反應(yīng)12 h，間隔取樣(15、30 min，1、2、4、8、12 h)，沸水浴5 min滅活。薄層層析TLC以及產(chǎn)物HPLC定量方法參考Wang等[10]的方法。薄層層析TLC條件：吸取適量樣品，點(diǎn)樣于硅膠板上，在展層劑(正丁醇∶乙酸∶水，2∶1∶1)中展層2次，使用顯色劑(甲醇/硫酸，95∶5)完全浸潤(rùn)硅膠板，吹干后在130 ℃烤箱內(nèi)顯色。HPLC條件：氨基色譜柱(5 μm, 4.6×250 mm)，柱溫45 ℃，流動(dòng)相為60%乙腈。

1.7 RmAmy三維結(jié)構(gòu)模擬

RmAmy三維結(jié)構(gòu)模擬采用Swiss-Model進(jìn)行，以米曲霉(Aspergillusoryzae)的Taka α-淀粉酶(PDB code：3kwx.1，序列相似性為47.61%)結(jié)構(gòu)為模板。

1.8 mRmAmy在面包中的應(yīng)用

700 g高筋小麥粉中加入7 g酵母、378 g水、56 g糖和7 g鹽，于攪拌器中低速攪拌和高速攪拌各3 min，加入28 g黃油，再低速攪拌2 min和高速攪拌3 min后。靜置10 min，隨后分割(150 g/個(gè))室溫成型10 min，在38 ℃，80%相對(duì)濕度下發(fā)酵60 min，最后焙烤20 min(面火180 ℃，底火200 ℃)，待面包冷卻2 h后測(cè)定面包的比容和硬度。分別在水中添加RmAmy和mRmAmy，并攪拌均勻，添加量為1～3 mg/kg(以小麥粉質(zhì)量計(jì))。

比容測(cè)定：采用油菜籽置換法測(cè)定面包體積V(mL)，天平測(cè)定面包質(zhì)量m(g)，比容P=V/m。

硬度測(cè)定：將面包中部切成厚度為20 mm的均勻薄片，采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定面包芯的硬度(N)。

面包老化測(cè)定：將面包置于4 ℃下儲(chǔ)藏，測(cè)定2 d和4 d的硬度變化。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析，利用Origin 2019進(jìn)行繪圖。三維結(jié)構(gòu)中相關(guān)氨基酸突變構(gòu)象變化以及表面電荷分布由Pymol軟件進(jìn)行分析觀察，疏水鍵和氫鍵由LigPlot+軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 RmAmy隨機(jī)突變體文庫(kù)篩選和高密度發(fā)酵

經(jīng)酸性臺(tái)盼藍(lán)初篩固體培養(yǎng)基(pH 5.0)初步篩選(約為5 000個(gè))，大約有25%的突變體在酸性初篩平板中呈現(xiàn)清晰透明圈。選擇透明圈較大的菌株接種于50 mL三角瓶中發(fā)酵產(chǎn)酶(450個(gè))，復(fù)篩后發(fā)現(xiàn)一株在pH 5.0下具有較高催化活力的突變株，命名為mRmAmy。5-L發(fā)酵罐中mRmAmy高密度發(fā)酵(搖瓶初始酶活為200 U/mL)如圖1所示。隨誘導(dǎo)時(shí)間增加，α-淀粉酶酶活、蛋白濃度以及菌體濕重呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，SDS-PAGE表明目的條帶也逐漸增加。當(dāng)發(fā)酵168 h時(shí)，發(fā)酵上清液中α-淀粉酶酶活達(dá)到最高為11 900 U/mL，蛋白濃度為4.07 mg/mL，菌體濕重最大為408 g/L。mRmAmy在SDS-PAGE上的分子質(zhì)量與RmAmy一致。高密度發(fā)酵的粗酶液經(jīng)QSFF強(qiáng)陰離子柱一步純化得到電泳級(jí)純酶，比酶活為3 600 U/mg，純化倍數(shù)為1.23倍，酶活回收率為90.8%。mRmAmy經(jīng)Endo H去糖基化處理后，mRmAmy呈現(xiàn)單一條帶(圖2)，表明mRmAmy存在糖基化。

α-淀粉酶作為一種重要的工業(yè)用酶，產(chǎn)酶水平是其應(yīng)用的重要指標(biāo)。mRmAmy高密度產(chǎn)酶水平比RmAmy產(chǎn)酶水平(29 794 U/mL)低，但仍高于大多數(shù)α-淀粉酶在畢赤酵母中的表達(dá)水平。如嗜堿單胞菌α-淀粉酶基因表達(dá)于畢赤酵母中，經(jīng)3-L發(fā)酵罐發(fā)酵96 h，酶活僅為600 U/mL[8]。地衣芽胞桿菌α-淀粉酶(BLA)在畢赤酵母中表達(dá)，經(jīng)168 h發(fā)酵，酶活最高達(dá)900 U/mL[15]。米曲霉(Aspergillusoryzae)α-淀粉酶(AmyA)表達(dá)至畢赤酵母中，經(jīng)72 h發(fā)酵后，酶活僅72 U/mL[16]。地衣芽胞桿菌α-淀粉酶(BlAmy)在畢赤酵母中表達(dá)，經(jīng)碳源優(yōu)化在50-L發(fā)酵罐中誘導(dǎo)168 h，酶活最高為11 000 U/mL[17]。mRmAmy經(jīng)純化后比酶活(3 600 U/mg)比RmAmy比酶活(3 502 U/mg)略高。mRmAmy比酶活要高于已報(bào)道的來源于嗜堿單胞菌(16.6 U/mg)[8]、樟絨枝霉(Malbrancheacinnamomea，1 230 U/mg)[12]和嗜熱杜邦菌(2 814 U/mg)[9]的α-淀粉酶。但是低于來源于米曲霉(5 150 U/mg)[16]和氈狀地絲霉(Geomycespannorum，9 780 U/mg)[18]的α-淀粉酶。mRmAmy存在糖基化，糖基化現(xiàn)象廣泛存在于真核表達(dá)系統(tǒng)中，對(duì)α-淀粉酶的催化活力、結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性具有重要作用[19]。

注：1～3分別為粗酶液、純酶液和純酶經(jīng)去糖基化酶處理。圖2 α-淀粉酶突變體mRmAmy的SDS-PAGE

2.2 mRmAmy的酶學(xué)特性

mRmAmy的最適pH和pH穩(wěn)定性如圖3a和圖3b所示。mRmAmy的最適pH為5.0，在pH 4.0～10.0的條件下保溫30 min后，能夠保持80%以上的酶活力。mRmAmy的最適溫度和溫度穩(wěn)定性如圖3c所示，mRmAmy的最適溫度為65 ℃，在60 ℃下保溫30 min，能夠保持80%以上的酶活力。

mRmAmy的最適pH相比于RmAmy(pH 6.0)降低1個(gè)pH單位，pH穩(wěn)定性與RmAmy(在pH 4.5～8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定)比，穩(wěn)定性范圍更加廣泛，更加耐酸和耐堿。mRmAmy與RmAmy(最適溫度75 ℃，在65 ℃以下保持穩(wěn)定)比，最適溫度由75 ℃降低為65 ℃，降低10 ℃，穩(wěn)定性范圍降低了5 ℃。真菌α-淀粉酶的最適pH一般處于弱酸性至中性范圍內(nèi)。mRmAmy最適pH為5.0，與黃曲霉(Aspergillusflavus，pH 5.0)[20]和小孢根霉(Rhizopusmicrosporus，pH 5.0)[21]α-淀粉酶相同。低于來源于米曲霉(pH 5.6)[16]和嗜熱杜邦菌(pH 6.5)[9]的α-淀粉酶，高于來源于多變擬青霉(Paecilomycesvariotii，pH 4.0)[22]的α-淀粉酶。mRmAmy的pH穩(wěn)定范圍比大多數(shù)真菌來源的α-淀粉酶更為寬泛。如米曲霉α-淀粉酶僅在pH 4.5～6.5之間保持穩(wěn)定[4]，氈狀地絲霉α-淀粉酶在pH 5.0～9.0之間保持穩(wěn)定[23]，而嗜熱杜邦菌α-淀粉酶在pH 4.5～10.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定[9]。與真菌來源的α-淀粉酶相比，mRmAmy具有較高的最適溫度和良好的熱穩(wěn)定性，其最適溫度高于來源于嗜熱杜邦菌(60 ℃)[9]和米曲霉(60 ℃)[4]的α-淀粉酶，但低于來源于氈狀地絲霉(70 ℃)[18]和帚狀曲霉(Aspergilluspenicillioide，80 ℃)[24]的α-淀粉酶。mRmAmy在60 ℃以下保持穩(wěn)定，最適溫度為65 ℃。此外，mRmAmy在較低溫度下的酶活高于RmAmy，尤其是在30～50 ℃之間具有更高的酶活力，有利于在烘焙食品加工中的應(yīng)用。

圖3 mRmAmy的最適pH、pH穩(wěn)定性、最適溫度和溫度穩(wěn)定性

mRmAmy在pH 5.0和50 ℃下水解可溶性淀粉的產(chǎn)物經(jīng)薄層層析(TLC)分析，結(jié)果如圖4所示，mRmAmy保留了野生型RmAmy的優(yōu)良的水解特性(較高的產(chǎn)麥芽糖能力)[10]。12 h水解產(chǎn)物進(jìn)行定量分析(表1)，mRmAmy水解可溶性淀粉產(chǎn)生的葡萄糖和麥芽糖含量，均高于RmAmy水解的產(chǎn)量，原因可能在于mRmAmy在pH 5.0、50 ℃具有更高的酶活力(圖3)。

注：G、M2、M3、M4和M5分別為葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖。圖4 α-淀粉酶突變體mRmAmy水解特性

表1 RmAmy及mRmAmy水解可溶性淀粉的產(chǎn)物定量分析

2.3 RmAmy序列以及三維結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)測(cè)序，mRmAmy中有3處氨基酸與RmAmy不同，分別為Ser213Phe、Gly226Asp和Ile382Thr。與同源性較高的α-淀粉酶進(jìn)行多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Ser213和Ile382為非保守氨基酸，而Gly226為保守氨基酸。

以米曲霉Taka α-淀粉酶(PDB code：3kwx.1，氨基酸同源性為47.61%)結(jié)構(gòu)為模板，經(jīng)Swiss-Model進(jìn)行同源結(jié)構(gòu)模擬，得到RmAmy三維模擬結(jié)構(gòu)如圖5所示。與GH13家族α-淀粉酶三維結(jié)構(gòu)相似，RmAmy呈現(xiàn)典型的(β/α)8桶結(jié)構(gòu)(TIM桶結(jié)構(gòu))，其中Asp198、Glu222和Asp288為關(guān)鍵催化氨基酸(圖5)。標(biāo)記出3個(gè)突變氨基酸(Ser213Phe，Gly226Asp和Ile382Thr)后可以發(fā)現(xiàn)突變氨基酸均位于酶分子表面。經(jīng)過Pymol進(jìn)行野生型RmAmy與突變體mRmAmy的表面靜電分布進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)突變后，酶分子凹槽右側(cè)的電勢(shì)由弱正電轉(zhuǎn)化為強(qiáng)負(fù)電，而這一變化是由Gly226Asp引起的。

圖5 α-淀粉酶RmAmy和mRmAmy結(jié)構(gòu)、表面電荷分布及氫鍵變化

酶分子穩(wěn)定性主要受二硫鍵、氫鍵、離子鍵和疏水作用等相互作用力影響。通常，親水性殘基位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部不利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，而疏水性氨基酸在內(nèi)部取代親水性殘基可能增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[6]。與蛋白質(zhì)內(nèi)部相反，親水氨基酸取代蛋白質(zhì)表面的疏水性氨基酸則可能增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[25]。地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶經(jīng)定向進(jìn)化改變性質(zhì)，結(jié)果表明Thr353Ile突變體在pH 4.5的催化效率提升3.5倍，原因在于位于分子內(nèi)部的突變中，Ile具有更高α螺旋傾向性，且為疏水性氨基酸，增強(qiáng)了酶在酸性條件下的穩(wěn)定性[6]。地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶利用定點(diǎn)突變改變酸性穩(wěn)定性，突變位點(diǎn)Leu134Arg位于酶分子表面，突變之后，由疏水性氨基酸(Leu)轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性氨基酸(Arg)，表面親水性增強(qiáng)，同時(shí)形成新的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)酶蛋白的酸性條件的穩(wěn)定性[25]。本研究中3個(gè)突變氨基酸均位于蛋白表面，觀察酶分子表面疏水性變化，其中Gly226Asp和Ile382Thr氨基酸的突變使得酶分子表面親水性增強(qiáng)，這可能是mRmAmy在酸性條件下穩(wěn)定性上升的原因，而Ser213Phe使得表面親水性減弱，可能是mRmAmy熱穩(wěn)定性降低的原因。酶分子催化凹槽附近帶電氨基酸的變化可能會(huì)影響該酶的最適pH[26]，突變體mRmAmy中，226位的Gly突變?yōu)锳sp，由不帶電氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)閹щ姲被?，改變酶分子凹槽附近的電?shì)平衡，從而改變mRmAmy的最適催化條件。催化區(qū)域附近的氫鍵網(wǎng)絡(luò)和鹽橋?qū)Φ蚿H下α-淀粉酶的穩(wěn)定性有著重要影響[27]，由LigPlot+觀察突變前后相關(guān)氨基酸位點(diǎn)附近氫鍵作用力的變化(圖5c，虛線表示氫鍵作用力及其距離)。213位氨基酸由Ser突變?yōu)镻he后，Ser213-Pro209之間的氫鍵由2個(gè)減少為1個(gè)，導(dǎo)致酶分子穩(wěn)定性改變，這可能是mRmAmy熱穩(wěn)定性降低的原因，而226位與382位氨基酸的變化并未引起氫鍵數(shù)目的變化。

2.4 mRmAmy在面包中的應(yīng)用

如表2所示，添加1 mg/kg α-淀粉酶，與對(duì)照相比，野生型RmAmy并沒有明顯變化，而突變體mRmAmy比容增加11.9%，硬度減小18.2%。在mRmAmy添加量為3 mg/kg時(shí)，面包比容達(dá)到最大，比對(duì)照增加14.4%，硬度減小25.8%。隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加，面包的硬度也呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。在mRmAmy添加量為3 mg/kg時(shí)，面包延緩老化效果最好，儲(chǔ)存第4天時(shí)，相比于對(duì)照硬度減小30.5%。

真菌α-淀粉酶在面包應(yīng)用已有許多研究報(bào)道。如蚜蟲假酵母菌(Pseudozymaaphidis)的α-淀粉酶應(yīng)用于面包中，添加量最高達(dá)25 000 U/kg，感官評(píng)價(jià)隨著添加量增而增加，但面包的體積和柔軟性沒有明顯的變化[3]。Shea等[28]研究真菌α-淀粉酶(Grindamyl A 5 000)改善面包品質(zhì)，添加量為10 mg/kg時(shí)，面包比容比對(duì)照增大4.5%，硬度降低15.7%。因此，結(jié)果表明mRmAmy在烘焙食品加工中具有應(yīng)用潛力。

表2 RmAmy及mRmAmy在面包中的應(yīng)用效果

3 結(jié)論

米黑根毛霉的α-淀粉酶經(jīng)定向進(jìn)化得到一個(gè)最適pH降低的突變酶mRmAmy，高密度發(fā)酵后酶活最高達(dá)11 900 U/mL。相比于野生型α-淀粉酶，mRmAmy最適pH和溫度得到降低，pH穩(wěn)定范圍更廣。突變酶應(yīng)用于面包制作中，能夠增加面包比容，減小面包硬度，延緩面包老化。因此，mRmAmy在烘焙領(lǐng)域中具有應(yīng)用前景。