自發(fā)空泡對胚胎發(fā)育潛能影響的探究

王明，李麗，張亨德，李博

目前，選擇性單囊胚移植已被各生殖醫(yī)學(xué)中心廣泛應(yīng)用，如何準(zhǔn)確選擇一枚優(yōu)質(zhì)囊胚移植是單囊胚移植的核心，更是影響人類輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)助孕結(jié)局的關(guān)鍵?，F(xiàn)階段胚胎質(zhì)量的評估主要還是依據(jù)形態(tài)學(xué)觀察。檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，關(guān)于胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)空泡及空泡對胚胎發(fā)育潛能的影響研究較少，且其相關(guān)機(jī)制也未明確[1-3]。有研究通過Time-lapse技術(shù)觀測發(fā)現(xiàn)，空泡在8細(xì)胞胚胎期到桑葚胚期階段發(fā)生更為頻繁且對后續(xù)發(fā)育潛能影響更深[4]。因此，本研究對4 355枚胚胎的囊胚培養(yǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行了回顧性分析，探討授精后第4天(D4)出現(xiàn)空泡對胚胎發(fā)育潛能的影響，以期發(fā)現(xiàn)空泡化對胚胎發(fā)育潛能的預(yù)測價(jià)值，為臨床選擇移植優(yōu)質(zhì)胚胎提供一定的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2021年1～6月唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心行新鮮周期單囊胚移植患者的臨床資料，共計(jì)658例患者，709個(gè)周期納入本研究。選擇D4胚胎作為研究材料，出現(xiàn)空泡的1 391枚胚胎作為空泡組，同期形態(tài)正常無空泡的2 964枚胚胎作為對照組。進(jìn)一步根據(jù)空泡化程度將胚胎分為一般空泡組(1 016枚胚胎)和嚴(yán)重空泡組(375枚胚胎)。比較組間的囊胚形成率、可利用囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率。

1.2 研究方法

1.2.1 治療方案 體外受精周期中使用GnRH長方案或GnRH拮抗劑方案進(jìn)行促排卵治療。B超監(jiān)測，當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm時(shí)，或至少有3枚卵泡直徑≥17 mm時(shí)，根據(jù)激素水平肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(hCG，珠海麗珠)5 000～10 000 IU/艾澤(默克雪蘭諾，意大利)250 μg。在注射34～36 h后，B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵。授精方式根據(jù)患者病史及取卵日精子質(zhì)量選擇采用常規(guī)體外受精(in vitro fertilization，IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)操作。

1.2.2 胚胎評估 受精后16～18 h評估受精結(jié)果，將受精正常的合子放入COOK培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3～7 d。卵裂胎質(zhì)量的評估和分類按照下列原則：1級(卵裂球大小均一，沒有或者僅有少許碎片≤5%，無空泡)，2級(卵裂球大小不均勻，碎片10%～20%，有空泡)，3級(卵裂球大小嚴(yán)重不均勻，碎片25%，有大量空泡)和4級(卵裂球大小嚴(yán)重不均勻，碎片>50%)。1級和2級被認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)胚胎，3級為可利用胚胎。第3天對擬進(jìn)行囊胚培養(yǎng)的胚胎換液處理。

胚胎評估時(shí)觀察到卵裂球或胚胎面存在空泡則定義為一般空泡組。當(dāng)大于或等于1/3卵裂球數(shù)出現(xiàn)空泡；或空泡面積占比達(dá)到胚胎面的1/3則定義為嚴(yán)重空泡組。

囊胚質(zhì)量評估：采用 Gardner囊胚評分系統(tǒng)進(jìn)行囊胚質(zhì)量評估。根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和外滋養(yǎng)層細(xì)胞的發(fā)育對囊胚進(jìn)行分級，評級標(biāo)準(zhǔn)如下：① 內(nèi)細(xì)胞(ICM)的發(fā)育分為3級：A級為細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密；B級為細(xì)胞數(shù)目少、排列松散；C級為細(xì)胞數(shù)目很少。② 外滋養(yǎng)層細(xì)胞(TE)的發(fā)育分為3級：A級為細(xì)胞數(shù)目較多，結(jié)構(gòu)致密；B級為細(xì)胞數(shù)目少、結(jié)構(gòu)松散；C級為細(xì)胞稀疏。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或外滋養(yǎng)層的評分至少有一項(xiàng)達(dá)到C級以上為可利用囊胚，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和外滋養(yǎng)層的評分均在B級及以上的囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚。

1.2.3 主要觀察指標(biāo) 分別計(jì)算以下指標(biāo)：囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/囊胚培養(yǎng)數(shù)×100%；可利用囊胚率=可利用囊胚數(shù)/囊胚形成數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)囊胚率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/囊胚形成數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較

空泡組和對照組在患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)FSH值、AMH值、Gn用量和獲卵數(shù)方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 空泡化對胚胎發(fā)育潛能的影響

空泡組胚胎的囊胚形成率高于對照組，但優(yōu)質(zhì)囊胚率低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組的可利用囊胚率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 空泡化對胚胎發(fā)育潛能的影響[例(%)]

2.3 不同程度空泡化對胚胎發(fā)育潛能的影響

一般空泡組胚胎的囊胚形成率高于對照組(P<0.001)，但可利用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。嚴(yán)重空泡組胚胎的囊胚形成率與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，低于一般空泡組(P<0.05)。且嚴(yán)重空泡組的可利用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率均低于對照組及一般空泡組(P<0.001)。詳見表3。

表3 不同程度空泡化對胚胎發(fā)育潛能的影響[例(%)]

3 討論

形態(tài)學(xué)評分因其具有快捷、經(jīng)濟(jì)和無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)驗(yàn)室最常用的胚胎篩選方式。已有大量關(guān)于卵裂數(shù)目、卵裂球均一度、碎片化程度及碎片分布對胚胎發(fā)育潛能影響的研究報(bào)道[5-7]。而空泡是一種充滿水液的球形膜狀胞質(zhì)內(nèi)含物，作為一種較為常見的胚胎異常形態(tài)，在胚胎的各個(gè)發(fā)育時(shí)間均有可能出現(xiàn)。Ebner T等[8]曾報(bào)道，空泡可能是滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體的小空泡融合形成，但目前關(guān)于胚胎中空泡的形成原因和機(jī)制還未明確。

魏玉蘭等[9]研究發(fā)現(xiàn)，空泡組患者的Gn用量顯著高于對照組。Fancsovits P等[10]和Balaban B等[11]研究發(fā)現(xiàn)，患者年齡、用藥方案及培養(yǎng)環(huán)境都會(huì)造成胚胎胞質(zhì)異常，導(dǎo)致空泡形成。但Zhang JY等[4]選擇D3和D4胚胎作為研究對象，發(fā)現(xiàn)空泡組與對照組患者年齡、基礎(chǔ)FSH值及獲卵數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ebner T等[8]也發(fā)現(xiàn)兩組間年齡、基礎(chǔ)FSH值、Gn用量、E2水平、LH水平和P水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果顯示，空泡組與對照組患者年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH值、AMH值、Gn用量和獲卵數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Zhang JY等結(jié)果一致。

目前，關(guān)于空泡的研究大多都集中在卵母細(xì)胞和卵裂期胚胎階段，對于桑椹胚空泡化的研究較少。卵母細(xì)胞內(nèi)空泡可能會(huì)影響細(xì)胞骨架功能的發(fā)揮，從而顯著影響受精和正常的細(xì)胞卵裂過程，甚至導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯[12-13]。Balaban B等[11]報(bào)道，解凍復(fù)蘇后卵裂期胚胎的胞質(zhì)空泡會(huì)嚴(yán)重影響囊胚形成，且優(yōu)質(zhì)囊胚占比明顯下降。Zhang JY等[4]借助time-lapse技術(shù)發(fā)現(xiàn)，卵裂期胚胎空泡組的囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚率均顯著低于正常組，可利用囊胚率高于正常組；進(jìn)一步分析顯示兩組間種植率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但空泡組的流產(chǎn)率顯著升高。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，空泡組的優(yōu)質(zhì)囊胚率低于對照組，與前期研究一致，證實(shí)了空泡會(huì)降低胚胎發(fā)育潛能，導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)囊胚率下降。這可能是因?yàn)槌霈F(xiàn)空泡會(huì)導(dǎo)致胚胎胞質(zhì)體積縮小，進(jìn)而造成形成囊胚的細(xì)胞數(shù)目減少，影響囊胚質(zhì)量[13]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)與對照組相比，空泡組有更高的囊胚形成率，這與前期研究結(jié)果相悖。分析原因可能是，桑葚胚作為囊胚形成前期的獨(dú)特形態(tài)，其致密化階段又是空泡形成的高峰期，而空泡的形成可能是胚胎致密化后促進(jìn)融合形成囊胚的一種方式，因而在空泡組反而有更高的囊胚形成率[14]。

關(guān)于空泡的研究只分析了其對于胚胎發(fā)育有無影響，僅少量文獻(xiàn)對空泡化程度進(jìn)行區(qū)分報(bào)道。魏玉蘭等[9]回顧分析了D5出現(xiàn)嚴(yán)重空泡化胚胎與正常形態(tài)胚胎的可利用囊胚率、優(yōu)質(zhì)囊胚率及臨床結(jié)局，發(fā)現(xiàn)空泡組的可利用囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率均低于對照組，但兩組間的妊娠率、活產(chǎn)率和流產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Zhang JY等[4]發(fā)現(xiàn)，在一個(gè)卵裂球上有空泡對胚胎發(fā)育的影響遠(yuǎn)低于在多個(gè)卵裂球上都出現(xiàn)空泡。本研究結(jié)果顯示，D4胚胎嚴(yán)重空泡組的可利用囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率均低于對照組和一般空泡組。該結(jié)果與前期報(bào)道一致，提示可將嚴(yán)重空泡化視為影響胚胎后續(xù)發(fā)育潛能的不良指標(biāo)。在胚胎發(fā)育的各個(gè)階段，發(fā)生嚴(yán)重空泡化的胚胎，可能由于細(xì)胞胞質(zhì)的較大部分會(huì)受空泡影響而不能發(fā)揮作用，干擾胚胎的正常生長發(fā)育，甚至?xí)T發(fā)細(xì)胞凋亡，對后續(xù)的發(fā)育潛能造成極大的損傷[8]。本研究還發(fā)現(xiàn)，一般空泡組的可利用囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，囊胚形成率卻增高，推測D4胚胎出現(xiàn)輕度空泡對后續(xù)發(fā)育潛能可能并無影響，反而可以一定程度促進(jìn)囊胚的形成。

挑選高發(fā)育潛能的優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植是ART助孕成功的重要環(huán)節(jié)[15]，在ART周期中，大部分移植的是卵裂期胚胎或囊胚，很少嘗試選擇D4的桑葚胚進(jìn)行移植。但隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)造革新及培養(yǎng)液的研發(fā)完善，桑葚胚移植逐漸進(jìn)入人們視野。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，D4和D5單胚胎移植的臨床妊娠率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[16-17]，選擇D4胚胎移植不僅可以降低因胚胎發(fā)育遲緩或停滯而取消移植的風(fēng)險(xiǎn)，還可以一定程度減少體外培養(yǎng)對胚胎帶來的表觀遺傳學(xué)改變。鑒于桑葚胚移植的諸多積極方面，如何評估D4胚胎已成為生殖醫(yī)學(xué)熱議的話題[14,18-20]。目前，D4胚胎的評估尚無共識，需要從多個(gè)方面去論證優(yōu)質(zhì)胚胎的評定標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)D4一般空泡組胚胎的囊胚形成率高于對照組，嚴(yán)重空泡化D4胚胎的可利用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率均低于對照組和一般空泡組胚胎。推測嚴(yán)重空泡化可作為影響胚胎發(fā)育潛能的負(fù)向指標(biāo)，在進(jìn)行胚胎評估時(shí)應(yīng)慎重對待。本研究對預(yù)判空泡化D4胚胎的發(fā)育潛能，挑選最優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植有一定參考價(jià)值。另外，本研究尚未涉及到空泡化胚胎的臨床結(jié)局，還需要繼續(xù)跟蹤研究。