核受體因子FTZ-F1在斜紋夜蛾響應(yīng)蟲螨腈及辛硫磷脅迫中的作用機(jī)制

宋 妍,劉志翔,譚安江,2,盛 晟,2,*

(1.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212100;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江 212100)

核受體型轉(zhuǎn)錄因子是昆蟲蛻皮激素信號(hào)通路中一類十分重要的轉(zhuǎn)錄因子，在昆蟲的發(fā)育、變態(tài)、生殖等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用(Mangelsdorfetal.,1995)。Fushitarazu factor 1(FTZ-F1)是一種核受體型轉(zhuǎn)錄因子，最初從果蠅Drosophila中被鑒定發(fā)現(xiàn)(Yuetal.,1997)。FTZ-F1可在昆蟲多個(gè)組織中作為一個(gè)功能因子響應(yīng)蛻皮激素信號(hào)，同時(shí)調(diào)控下游基因的表達(dá)(Choetal.,2014)，進(jìn)而影響昆蟲的生長發(fā)育。例如，在黑腹果蠅D.melanogaster中沉默DmFTZ-F1會(huì)引起果蠅幼蟲死亡，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致果蠅幼蟲發(fā)生嚴(yán)重的蛻皮缺陷(Sultanetal.,2014)。沉默德國小蠊BlattellagermanicaBgFTZ-F1會(huì)導(dǎo)致其發(fā)育受阻及蛻皮失敗(Cruzetal.,2008)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，BgFTZ-F1參與了德國小蠊保幼激素的合成(Borras-Castellsetal.,2017)。在家蠶Bombyxmori中，BmFTZ-F1通過結(jié)合于表皮蛋白基因BmWCP5特定位點(diǎn)，調(diào)控其正常表達(dá)，從而參與調(diào)控家蠶蛻皮和羽化(Alietal.,2012)。因此，F(xiàn)TZ-F1基因在昆蟲的發(fā)育過程中發(fā)揮極其重要的作用。

有關(guān)解毒酶基因在害蟲抗藥性中的作用機(jī)制已有深入研究，但昆蟲發(fā)育相關(guān)基因在害蟲耐藥性中的作用機(jī)制仍較少報(bào)道。蛻皮激素信號(hào)通路在昆蟲生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，但近年來的研究也發(fā)現(xiàn)，該通路中的一些關(guān)鍵基因介導(dǎo)了昆蟲耐藥性的形成。例如，沉默核受體基因BmHR96后，家蠶幼蟲對(duì)辛硫磷的敏感性顯著上升(Liuetal.,2022)；氟啶蟲酰胺處理褐飛虱Nilaparvatalugens后，NlUSP,NlE78和NlTLL等7個(gè)核受體基因顯著上調(diào)表達(dá)，沉默NlHR3,NlUSP,NlTLL,NlHR83,NlPNR,NlFTZ-F1及NlHR4均能使褐飛虱若蟲死亡率升高，表明上述基因在褐飛虱耐受氟啶蟲酰胺中可能發(fā)揮重要作用(Xuetal.,2017)。

近年研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TZ-F1在害蟲抗藥性形成中發(fā)揮重要作用。例如，在小菜蛾P(guān)lutellaxylostella中，F(xiàn)TZ-F1通過調(diào)控細(xì)胞色素P450基因CYP6BG1的表達(dá)，使其對(duì)氯蟲苯甲酰胺產(chǎn)生抗性(Lietal.,2019)；FTZ-F1通過調(diào)控淡色庫蚊Culexpipienspallens表皮蛋白CPLCG5，使其對(duì)溴氰菊酯的敏感性上升(Xuetal.,2020)。然而，有關(guān)FTZ-F1是否參與昆蟲響應(yīng)農(nóng)藥脅迫的報(bào)道仍僅限于個(gè)案，亟需在更多物種中加以驗(yàn)證。FTZ-F1如何與昆蟲解毒酶基因互作，繼而影響昆蟲對(duì)農(nóng)藥的耐受性也缺乏深入了解。

斜紋夜蛾Spodopteralitura屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，是一種重要的多食性害蟲，近年來對(duì)桑樹的為害也呈逐漸加重的趨勢。盡管目前已在斜紋夜蛾中克隆出FTZ-F1基因(Tangetal.,2011)，但針對(duì)其功能研究尚未系統(tǒng)開展。另一方面，化學(xué)防治目前仍然是防治桑樹斜紋夜蛾的最主要手段。由于桑園害蟲防治獨(dú)特的用藥要求，蟲螨腈、辛硫磷等傳統(tǒng)藥劑仍然是防治桑樹斜紋夜蛾的常用藥劑，導(dǎo)致斜紋夜蛾對(duì)這兩種農(nóng)藥的耐受性不斷升高(Ahmadetal.,2007;Ahmadetal.,2015)，這兩種農(nóng)藥對(duì)桑樹斜紋夜蛾的防治效果越來越差。雖然斜紋夜蛾的抗藥性機(jī)制研究已十分深入(Lietal.,2021)，但FTZ-F1是否在斜紋夜蛾耐受殺蟲劑中發(fā)揮作用仍不明確。本研究以斜紋夜蛾FTZ-F1為研究對(duì)象，旨在探究其是否參與了斜紋夜蛾對(duì)桑園常用殺蟲劑辛硫磷和蟲螨腈的耐受性形成。研究結(jié)果有助于深入揭示FTZ-F1在害蟲化學(xué)農(nóng)藥耐受性中的作用，拓展對(duì)害蟲耐受化學(xué)農(nóng)藥的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試斜紋夜蛾幼蟲已在江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院桑樹保護(hù)研究室連續(xù)人工飼養(yǎng)40代以上，期間未暴露任何農(nóng)藥處理。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度25℃±1℃，相對(duì)濕度50%～70%，光周期14L∶10D。幼蟲飼養(yǎng)于透明塑料方盒(長×寬×高=13 cm×13 cm×6 cm)中，喂食人工飼料(Shengetal.,2014)。羽化后，將成蟲轉(zhuǎn)移至四壁覆蓋透明紗網(wǎng)的產(chǎn)卵籠中(長×寬×高=30 cm×30 cm×60 cm)，紗網(wǎng)上涂抹10%蜂蜜水以補(bǔ)充營養(yǎng)，養(yǎng)蟲籠中提供一張A4紙作為成蟲產(chǎn)卵基質(zhì)。

1.2 斜紋夜蛾FTZ-F1的生物信息學(xué)分析

從GenBank(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載草地貪夜蛾S.frugiperda、家蠶B.mori、煙草天蛾Manducasexta、甜菜夜蛾Spodopteraexigua等昆蟲的FTZ-F1序列作為查詢模板，使用BioEdit軟件中的tblastn程序，從本課題組前期構(gòu)建的斜紋夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(NCBI登錄號(hào)：PRJNA810583)中鑒定斜紋夜蛾FTZ-F1，并使用NCBI的BlastX在線程序?qū)﹁b定得到的斜紋夜蛾FTZ-F1進(jìn)行驗(yàn)證。使用ORF Finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orfnder/)在線軟件預(yù)測SlFTZ-F1基因的開放閱讀框。等電點(diǎn)(pI)和理論分子量由ExPASy在線軟件(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測。利用DNAMAN 8將斜紋夜蛾FTZ-F1氨基酸序列與其他昆蟲物種的FTZ-F1氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，使用MEGA 7.0軟件以鄰接(neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Kumaretal.,2016)，各分支置信度經(jīng)Bootstrap法重復(fù)檢驗(yàn)1 000次。

1.3 蟲螨腈和辛硫磷處理

分別按照亞致死濃度(LC30)的近似整數(shù)值配制蟲螨腈及辛硫磷供試藥液，其中，蟲螨腈的濃度為15.0 mg/L，辛硫磷的濃度為50.0 mg/L。采用浸葉法，將半徑為2 cm的新鮮圓形桑葉浸沒于供試藥液中30 s后取出晾干，并分別將其喂食斜紋夜蛾3齡幼蟲，以蒸餾水處理作為對(duì)照。在殺蟲劑處理后1,12,24,36和48 h，分別收集存活的幼蟲，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 qRT-PCR檢測斜紋夜蛾FTZ-F1基因的表達(dá)水平

使用RNAiso Plus (Thermo Scientific,美國)提取1.3節(jié)收集的斜紋夜蛾幼蟲總RNA，使用NanoDrop2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific,美國)和1.5%瓊脂糖凝膠電泳分別檢測總RNA的濃度和完整性；隨后，使用PrimeScript?RT試劑盒(TaKaRa,中國)合成cDNA第1鏈。qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL):2×iQTMSYBR?Green Ⅰ 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,cDNA模板2 μL,RNase-free ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序:95℃ 5 min;95℃ 15 s,60℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，溫度從60℃逐步升至95℃，繪制熔解曲線，以檢測是否存在引物二聚體。以斜紋夜蛾磷酸甘油醛脫氫酶基因GAPDH作為內(nèi)參，目的基因和內(nèi)參基因的引物見表1。每個(gè)處理進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭幼蟲。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平(Livak and Schmittgen,2001)。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences in qRT-PCR

1.5 dsRNA的合成

利用BLOCK-iTTM RNAi Designer(https:∥rnaidesigner.thermofisher.com/)在線軟件設(shè)計(jì)斜紋夜蛾FTZ-F1基因的5′端含有T7啟動(dòng)子序列的dsRNA引物(表2)。使用invitroTranscription T7 Kit (for siRNA Synthesis)(TaKaRa,中國)體外合成斜紋夜蛾FTZ-F1基因的dsRNA，以合成的綠色熒光蛋白(GFP)基因的dsRNA作為陰性對(duì)照。采用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific,美國)測定其濃度和純度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合成dsRNA的完整性。使用Nanoject Ⅱ顯微注射器(Drummond Scientific,美國)分別將1 μL dsSlFTZ-F1(1 000 ng/μL)或dsGFP(1 000 ng/μL)從斜紋夜蛾3齡幼蟲腹部第3節(jié)與第4節(jié)的節(jié)間褶處注射至其體內(nèi)。注射后24 h和48 h，收集存活的幼蟲，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用qRT-PCR技術(shù)檢測dsRNA注射后斜紋夜蛾FTZ-F1的表達(dá)水平，方法同1.4節(jié)。每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭幼蟲。

表2 合成dsRNA所用寡核苷酸序列Table 2 Sequences of oligonucleotides used in dsRNA synthesis

1.6 干擾FTZ-F1后斜紋夜蛾經(jīng)殺蟲劑處理的死亡率測定

收集注射dsSlFTZ-F1 48 h后的斜紋夜蛾3齡幼蟲，分別將LC30濃度蟲螨腈和辛硫磷處理過的桑葉喂食上述試蟲，處理方法同1.3節(jié)。喂食后24和48 h記錄斜紋夜蛾的死亡情況。以注射dsGFP的斜紋夜蛾幼蟲喂食蟲螨腈和辛硫磷為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)觀測10頭幼蟲。

1.7 干擾斜紋夜蛾FTZ-F1后解毒酶基因表達(dá)水平的測定

為探究沉默F(xiàn)TZ-F1對(duì)斜紋夜蛾體內(nèi)主要解毒酶基因表達(dá)的影響，選取8個(gè)斜紋夜蛾谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶SlGST基因(表1)，使用qRT-PCR技術(shù)檢測干擾FTZ-F1后上述SlGST基因的表達(dá)水平，qRT-PCR方法同1.4節(jié)，所用引物見表1。每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭幼蟲。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用R軟件(R Core Team,2014)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。亞致死濃度蟲螨腈和辛硫磷處理斜紋夜蛾3齡幼蟲后SlFTZ-F1的相對(duì)表達(dá)量差異經(jīng)由單因素方差分析(ANOVA)和Tukey氏測驗(yàn)進(jìn)行比較，注射dsRNA后不同時(shí)間點(diǎn)SlFTZ-F1的相對(duì)表達(dá)量、被沉默SlFTZ-F1的斜紋夜蛾幼蟲取食亞致死濃度蟲螨腈和辛硫磷處理的桑葉后的死亡率、沉默SlFTZ-F1后斜紋夜蛾幼蟲SlGST基因的相對(duì)表達(dá)量采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 SlFTZ-F1基因的序列特征及系統(tǒng)發(fā)育

從本課題組前期構(gòu)建的斜紋夜蛾幼蟲轉(zhuǎn)錄組(NCBI登錄號(hào)：PRJNA810583)中鑒定得到一個(gè)斜紋夜蛾FTZ-F1基因，并將其命名為SlFTZ-F1(GenBank登錄號(hào)：LOC111360584)，其開放閱讀框長1 665 bp，編碼555個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為6.39，理論分子量61.77 kD。BlastX比對(duì)結(jié)果表明，SlFTZ-F1與草地貪夜蛾SpodopterafrugiperdaFTZ-F1的氨基酸一致性最高(84.95%)。多序列比對(duì)結(jié)果表明，SlFTZ-F1與褐飛虱Nilaparvatalugens、埃及伊蚊Aedesaegypti、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、赤擬谷盜Triboliumcastaneum、西方蜜蜂Apismellifera、草地貪夜蛾S.frugiperda、家蠶B.mori、黑腹果蠅D.melanogaster、甜菜夜蛾S.exigua的FTZ-F1氨基酸序列均具有相似的DNA結(jié)合域、FTZ-F1 box及配體結(jié)合域(圖1)。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，鱗翅目昆蟲的FTZ-F1聚為同一個(gè)亞支，斜紋夜蛾SlFTZ-F1與草地貪夜蛾SfFTZ-F1聚為一支，家蠶BmFTZ-F1與棉鈴蟲HaFTZ-F1聚為一支，甜菜夜蛾SeFTZ-F1與煙草天蛾MsFTZ-F1聚為一支，顯示出FTZ-F1在鱗翅目物種間保守的親緣關(guān)系(圖2)。

圖2 基于氨基酸序列鄰接法構(gòu)建的不同昆蟲種轉(zhuǎn)錄因子FTZ-F1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of transcription factor FTZ-F1 in different insect species based on amino acid sequence by the neighbor-joining method蛋白來源物種及其GenBank登錄號(hào)Origin species of proteins and their GenBank accession numbers:Nl:褐飛虱Nilaparvata lugens,APU50621.1;Aa:埃及伊蚊Aedes aegypti,CAO79104.1;Ha:棉鈴蟲Helicoverpa armigera,XP_021187002.1;Tc:赤擬谷盜Tribolium castaneum,XP_008191375.1;Am:西方蜜蜂Apis mellifera,XP_006557455.1;Sf：草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda,XP_035437309.1;Bm:家蠶Bombyx mori,XP_021205999.1;Dm:黑腹果蠅Drosophila melanogaster,NP_730359.1;Se:甜菜夜蛾Spodoptera exigua,AMP42756.1;Nv：麗蠅蛹集金小蜂Nasonia vitripennis,XP_001600363.2；Ap:豌豆長管蚜Acyrthosiphon pisum,XP_001945464.2;Ph:體虱Pediculus humanus corporis,XP_002430379.1；Ms:煙草天蛾Manduca sexta,AAL50351.1;Px:小菜蛾P(guān)lutella xylostella,KAG7313439.1;Ld:馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata,XP_023015475.1.

2.2 殺蟲劑處理后SlFTZ-F1基因的表達(dá)模式

亞致死濃度蟲螨腈和辛硫磷處理斜紋夜蛾3齡幼蟲顯著改變SlFTZ-F1的表達(dá)水平(圖3)。其中，與蒸餾水處理的對(duì)照組相比，蟲螨腈處理后1,24和36 h，SlFTZ-F1的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)；辛硫磷處理后24和36 h，SlFTZ-F1的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)。其余時(shí)間點(diǎn)處理組SlFTZ-F1的表達(dá)量與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)(圖3)。

圖3 斜紋夜蛾3齡幼蟲取食LC30濃度蟲螨腈和辛硫磷處理桑葉不同時(shí)間后SlFTZ-F1的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of SlFTZ-F1 in the 3rd instar larvae of Spodoptera litura after feeding on the mulberry leaves treated with LC30of chlorfenapyr and phoxim at different time points處理組分別飼喂15.0 mg/L蟲螨腈和50.0 mg/L辛硫磷浸葉處理的桑葉；對(duì)照組飼喂經(jīng)蒸餾水浸泡并晾干的桑葉。圖中數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=9)；柱上不同小寫字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同組間基因表達(dá)量差異顯著(P<0.05,采用單因素方差分析和Tukey氏檢驗(yàn))。The larvae in the treatment groups were fed with the mulberry leaves treated with 15.0 mg/L chlorfenapyr and 50.0 mg/L phoxim,respectively,by leaf dipping method,and those in the control group were fed with the mulberry leaves immersed into distilled water and subsequently airing.Data in the figure are represented as mean±SE of three independent experiments (n=9).Different lowercase letters above bars indicate significant differences in the gene expression level among different groups at the same time point (P<0.05) by one-way ANOVA and Tukey’s test.

2.3 沉默SlFTZ-F1后斜紋夜蛾幼蟲對(duì)蟲螨腈及辛硫磷的敏感性

注射dsSlFTZ-F1后48 h，SlFTZ-F1的表達(dá)量與對(duì)照組相比極顯著降低(P<0.01)，而注射dsSlFTZ-F1 24 h時(shí)的表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著上調(diào)(P<0.05)(圖4)，表明注射dsSlFTZ-F1后48 h時(shí)成功敲降了SlFTZ-F1的表達(dá)水平。將注射dsSlFTZ-F1后48 h的斜紋夜蛾幼蟲暴露于亞致死劑量的蟲螨腈和辛硫磷，死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比,蟲螨腈和辛硫磷處理后48 h時(shí)，沉默了SlFTZ-F1的斜紋夜蛾幼蟲的死亡率分別顯著升高了22%和28%(P<0.05)，但兩種殺蟲劑處理后24 h斜紋夜蛾幼蟲的死亡率均未發(fā)生顯著變化(P>0.05)(圖5)。

圖4 注射dsRNA后不同時(shí)間斜紋夜蛾3齡幼蟲SlFTZ-F1的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of SlFTZ-F1 in the 3rd instar larvae of Spodoptera litura at different time after injection of dsRNA圖中數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=9)；柱上星號(hào)和雙星號(hào)分別表示兩組間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)(t測驗(yàn))。Data in the figure are represented as mean±SE of three independent experiments (n=9).The asterisk and double asterisk above bars indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01),respectively,between the two groups by t-test.

圖5 RNAi沉默SlFTZ-F1后取食LC30濃度蟲螨腈(A)和辛硫磷(B)浸葉處理的桑葉時(shí)斜紋夜蛾幼蟲的死亡率Fig.5 Mortality rates of Spodoptera litura larvae feeding on the mulberry leaves treated with LC30 of chlorfenapyr (A) and phoxim by leaf dipping method (B) after silencing SlFTZ-F1 by RNAi圖中數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=30)；柱上星號(hào)、雙星號(hào)和ns分別表示兩組間差異顯著(P<0.05)、差異極顯著(P<0.01)和差異不顯著(P>0.05)(t檢驗(yàn))。Data in the figure are represented as mean±SE of three independent experiments (n=30).The asterisk,double asterisk and ns above bars indicate significant difference (P<0.05),extremely significant difference (P<0.01) and no significant difference (P>0.05),respectively,between the two groups (t-test).

2.4 沉默SlFTZ-F1后SlGST基因的表達(dá)模式

為探究SlFTZ-F1與斜紋夜蛾主要解毒酶基因的相互關(guān)系，本研究測定了沉默斜紋夜蛾3齡幼蟲SlFTZ-F1后8個(gè)SlGST基因的表達(dá)模式。qRT-PCR結(jié)果表明，注射dsSlFTZ-F1后48 hSlGST-D1,SlGST-E1,SlGST-E2,SlGST-E3,SlGST-E4,SlGST-E5,SlGST-E6及SlGST-E7的相對(duì)表達(dá)量與注射dsGFP的對(duì)照組相比均顯著降低(P<0.05)(圖6)。

圖6 RNAi沉默SlFTZ-F1后斜紋夜蛾3齡幼蟲體內(nèi)SlGST基因的表達(dá)量Fig.6 Expression levels of SlGST genes in the 3rd instar larvae of Spodoptera litura after silencing SlFTZ-F1 by RNAiA:SlGST-E1;B:SlGST-E2;C:SlGST-E3;D:SlGST-E4;E:SlGST-E5;F:SlGST-E6;G:SlGST-E7;H:SlGST-D1.RNAi后48 h測定基因表達(dá)量。圖中數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號(hào)和三星號(hào)分別表示兩組間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.001)(t測驗(yàn))。The expression levels of genes were detected at 48 h after RNAi.Data in the figure are represented as mean±SE of three independent experiments.The asterisk and triple asterisk above bars indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.001),respectively,between the two groups by t-test.

3 討論

FTZ-F1是一種孤兒核受體型轉(zhuǎn)錄因子，在昆蟲幼蟲至蛹變態(tài)過程中響應(yīng)20E和可能的保幼激素信號(hào)，從而調(diào)控昆蟲的發(fā)育過程(Guoetal.,2020)。本研究首先從前期構(gòu)建的斜紋夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定得到一個(gè)FTZ-F1基因。序列分析表明，SlFTZ-F1與其他物種的FTZ-F1均具有保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、FTZ-F1 box及配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育分析也表明，SlFTZ-F1與其近緣種草地貪夜蛾的FTZ-F1聚在了同一個(gè)亞枝(圖2)，顯示了較為保守的親緣關(guān)系。有關(guān)FTZ-F1在昆蟲蛻皮激素合成及生長發(fā)育中的作用機(jī)制已有不少研究(Ekokaetal.,2021)，但其在昆蟲耐受農(nóng)藥脅迫中的作用機(jī)制尚不明確。Xu等(2017)發(fā)現(xiàn)，NlFTZ-F1在褐飛虱遭受氟啶蟲酰胺處理后表達(dá)量顯著上升。本研究中，在殺蟲劑蟲螨腈與辛硫磷脅迫后24與36 hSlFTZ-F1的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，表明殺蟲劑脅迫處理后可誘導(dǎo)顯著SlFTZ-F1上調(diào)表達(dá)，從而暗示FTZ-F1可能參與了斜紋夜蛾響應(yīng)這兩種常用殺蟲劑的生理過程。為深入揭示FTZ-F1在斜紋夜蛾耐受農(nóng)藥中的作用機(jī)制，本研究在注射dsSlFTZ-F1后48 h成功沉默了SlFTZ-F1的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，將沉默了SlFTZ-F1的斜紋夜蛾幼蟲暴露在亞致死劑量的蟲螨腈和辛硫磷后48 h，斜紋夜蛾幼蟲的死亡率顯著上升，從而表明FTZ-F1在斜紋夜蛾響應(yīng)常用殺蟲劑脅迫中發(fā)揮了重要作用。值得注意的是，用兩種殺蟲劑分別處理被沉默了SlFTZ-F1的斜紋夜蛾幼蟲后24 h，試蟲的死亡率與對(duì)照組相比并無顯著差異(圖5)，表明兩種藥劑處理被干擾了SlFTZ-F1的斜紋夜蛾幼蟲需要經(jīng)過較長時(shí)間才能發(fā)揮作用。由于昆蟲耐藥性與體內(nèi)復(fù)雜的代謝活動(dòng)密切相關(guān)，而FTZ-F1調(diào)控的蛻皮激素合成及其相關(guān)生理活動(dòng)也直接影響昆蟲代謝活動(dòng)。因此，本研究中沉默F(xiàn)TZ-F1引起的斜紋夜蛾對(duì)蟲螨腈和辛硫磷敏感性的增強(qiáng)可能與沉默F(xiàn)TZ-F1后斜紋夜蛾體內(nèi)代謝活動(dòng)發(fā)生變化有關(guān)，在未來的研究中，需進(jìn)一步對(duì)該推論進(jìn)行研究。

GSTs是一種多功能的代謝解毒酶，在內(nèi)源性和外源性化合物的解毒過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，也是昆蟲產(chǎn)生殺蟲劑耐受性的主要原因之一(Liuetal.,2017;Pavlidietal.,2018;Khanetal.,2020)。許多研究已經(jīng)證實(shí)，害蟲對(duì)殺蟲劑的高抗性與GST活性增強(qiáng)或轉(zhuǎn)錄水平上升有關(guān)。GST基因的過表達(dá)是亞洲小車蝗Oedaleusasiaticus對(duì)蘆丁耐受性增強(qiáng)的重要原因(Wangetal.,2020)，扶桑綿粉蚧Phenacoccussolenopsis蟲螨腈抗性品系中GST酶活性顯著高于敏感品系(Nazaretal.,2020)。在斜紋夜蛾中，GST對(duì)其耐受農(nóng)藥的作用機(jī)制已得到深入研究(何承帥等,2021;Lietal.,2021)，在前期研究中，我們從構(gòu)建的差異轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選得到8個(gè)上調(diào)表達(dá)的斜紋夜蛾GST基因，即本研究的8個(gè)SlGST基因，且這8個(gè)SlGST基因在亞致死劑量蟲螨腈和辛硫磷處理后的不同時(shí)間點(diǎn)顯著上調(diào)表達(dá)，表明GST基因在斜紋夜蛾幼蟲響應(yīng)這兩種殺蟲劑脅迫中可能發(fā)揮重要作用(另文發(fā)表)。盡管如此，轉(zhuǎn)錄因子是否調(diào)控斜紋夜蛾GST基因的轉(zhuǎn)錄水平尚未涉及。

本研究中，通過檢測斜紋夜蛾GST基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，在被沉默了SlFTZ-F1的斜紋夜蛾幼蟲中，所選的8個(gè)GST基因表達(dá)量均顯著下調(diào)(圖6)，表明SlFTZ-F1可調(diào)控斜紋夜蛾GST表達(dá)，暗示FTZ-F1可能與GST共同介導(dǎo)了斜紋夜蛾對(duì)蟲螨腈和辛硫磷的耐受性。類似的有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控GST基因的表達(dá)導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生抗藥性的研究已有不少報(bào)道。例如，在馬鈴薯甲蟲L.decemlineata中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子CncC調(diào)控與溴氰菊酯抗性有關(guān)的GST-1等多個(gè)解毒酶基因的表達(dá)(Kalsi and Palli,2015)。此外，在岡比亞按蚊Anophelesgambiae中，轉(zhuǎn)錄因子Maf-S被報(bào)道調(diào)控P450基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致按蚊對(duì)擬除蟲菊酯和DDT的敏感性增加(Inghametal.,2017)。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的研究對(duì)于研究蛋白質(zhì)與DNA的相互作用具有重要意義。在家蠶中，F(xiàn)TZ-F1與表皮基因WCP5上游的CRE結(jié)合來調(diào)節(jié)其表達(dá)(Alietal.,2012)。FTZ-F1還可通過與黑腹果蠅EDG84A基因的兩個(gè)順式元件結(jié)合來調(diào)節(jié)EDG84A的表達(dá)(Sultanetal.,2014)。最近研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TZ-F1可以通過結(jié)合小菜蛾CYB6PG1的啟動(dòng)子區(qū)域來調(diào)控CYB6PG1的表達(dá)(Lietal.,2019)。因此，在未來的研究中，可深入研究斜紋夜蛾FTZ-F1對(duì)GST的結(jié)合調(diào)控關(guān)系，從而深入解析FTZ-F1如何通過與GST互作介導(dǎo)斜紋夜蛾對(duì)殺蟲劑的耐受性。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)桑園常用殺蟲劑蟲螨腈和辛硫磷能顯著誘導(dǎo)斜紋夜蛾發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子SlFTZ-F1上調(diào)表達(dá)，沉默SlFTZ-F1顯著降低斜紋夜蛾對(duì)兩種殺蟲劑的耐受性，降低重要解毒酶GST基因的表達(dá)水平。本研究獲得的結(jié)果將拓展對(duì)昆蟲發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在害蟲耐藥性中的作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為斜紋夜蛾的抗性治理提供新思路。