斜紋夜蛾蛻皮激素合成通路相關(guān)CYP450基因的鑒定及表達(dá)分析

谷 峻,葉 艷,李時(shí)宇,袁雅菲,黃立華

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東省昆蟲發(fā)育生物學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510631)

斜紋夜蛾Spodopteralitura屬于鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，最早起源于印度和東南亞地區(qū)。目前，斜紋夜蛾主要分布于亞洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)，包括印度、中國和日本。斜紋夜蛾寄主范圍廣泛，可為害100多種作物(Ferryetal.,2004)。除此之外，斜紋夜蛾生活周期短，繁殖能力強(qiáng)，并且對很多種化學(xué)殺蟲劑(Sparks and Nauen,2015)以及蘇云菌芽孢桿菌Bacillusthuringiensis毒素都產(chǎn)生了抗性(Wanetal.,2008)。這些特性使得斜紋夜蛾能對農(nóng)作物造成較大的為害。在印度，斜紋夜蛾通常造成10%～30%的作物損失(Ferryetal.,2004)。斜紋夜蛾是一種典型的完全變態(tài)類昆蟲，其一生要經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹和成蟲4個(gè)不同的發(fā)育階段。由于幼蟲和成蟲外部形態(tài)完全不同，因此這種發(fā)育方式稱為“變態(tài)發(fā)育”。在變態(tài)發(fā)育過程中，許多幼蟲的器官或組織，如表皮、中腸和脂肪體等在蛹期要解體，并重新生成相應(yīng)的成蟲器官或組織。昆蟲的變態(tài)發(fā)育主要受兩種激素調(diào)控，包括保幼激素(juvenile hormone,JH)和蛻皮激素(ecdysone)，前者使昆蟲保持幼體的形態(tài)，而后者誘導(dǎo)昆蟲蛻皮和變態(tài)。

昆蟲自身不能從頭合成蛻皮激素，只能利用從取食植物中獲得的甾醇來合成蛻皮激素，并最終轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘?0-羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)。昆蟲蛻皮激素合成的每一步反應(yīng)幾乎都依賴于一類特殊的酶——細(xì)胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)。CYP450是一個(gè)古老的以血紅素為輔基的B族細(xì)胞色素蛋白酶基因超家族，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物以及動(dòng)物等各種生物體內(nèi)(Omura,1999)。CYP450在昆蟲中的作用主要包括兩大方面：一是參與對外源物質(zhì)(植物次生代謝產(chǎn)物、殺蟲劑)的轉(zhuǎn)化與降解，使昆蟲對寄主的有毒性物質(zhì)產(chǎn)生耐受性；二是催化體內(nèi)生長發(fā)育過程所需物質(zhì)(蛻皮激素、保幼激素、脂肪酸、性激素等)的合成與代謝，調(diào)節(jié)昆蟲的生長發(fā)育、變態(tài)和繁殖過程(Werck-Reichhart and Feyereisen,2000)。

昆蟲蛻皮激素是由一系列CYP450負(fù)責(zé)合成的，這些CYP450包括CYP307A1,CYP306A1,CYP302A1,CYP315A1,CYP314A1以及CYP18A1(Niwaetal.,2004;Rewitzetal.,2006;Nakagawa and Sonobe,2016)。其中，CYP307A1負(fù)責(zé)將植物甾醇的初級代謝產(chǎn)物7-dehydrocholesterol轉(zhuǎn)化為Δ4-diketol；后者經(jīng)過一系列的代謝轉(zhuǎn)化為5β-ketodiol，并在CYP306A1的作用下轉(zhuǎn)化為5β-ketotriol；CYP302A1負(fù)責(zé)將5β-ketotriol轉(zhuǎn)化為2-deoxyecdysone，它隨后在CYP315A1的作用下轉(zhuǎn)化為蛻皮激素；最后由CYP314A1將蛻皮激素轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿叩?0E(Nakagawa and Sonobe,2016)，而CYP18A1負(fù)責(zé)降解20E(Guittardetal.,2011)。已有大量的證據(jù)顯示這些CYP450基因在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中起著非常重要的作用。例如，在沙漠蝗蟲Schistocercagregaria中抑制CYP307A1和CYP306A1的表達(dá)將顯著降低蛻皮激素的濃度，并破壞幼蟲蛻皮過程(Marchaletal.,2011)。CYP314A1是負(fù)責(zé)20E合成最后一步的關(guān)鍵酶，在小菜蛾P(guān)lutellaxylostella中通過RNAi抑制其基因的表達(dá)會(huì)使得幼蟲發(fā)育時(shí)期延長，化蛹率降低(Pengetal.,2019)。在果蠅Drosophila中抑制CYP18A1的表達(dá)會(huì)造成蛻皮延后以及蛹致死(Petryketal.,2003)。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性、長度為22～23 nt的非編碼RNA。越來越多的研究表明，miRNA在調(diào)控昆蟲變態(tài)發(fā)育方面起著重要的作用。在斜紋夜蛾中腸組織中鑒定出了101種miRNA，其中75種miRNA在變態(tài)發(fā)育過程中呈現(xiàn)出顯著的差異表達(dá)，并且它們可以靶向蛻皮激素信號通路中的多個(gè)基因，從而對蛻皮激素信號傳導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)控(Luoetal.,2020)。

盡管CYP450在昆蟲蛻皮激素合成代謝過程中的作用已經(jīng)比較清楚，但是這些CYP450基因在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律仍缺乏詳細(xì)的研究。本研究將以我國重要農(nóng)業(yè)害蟲斜紋夜蛾為研究材料，檢測負(fù)責(zé)20E合成代謝的6個(gè)CYP450基因的發(fā)育和組織表達(dá)譜，以及取食不同寄主植物對CYP450基因表達(dá)的影響，并預(yù)測靶向這些CYP450基因的miRNA。該研究將有助于明確影響20E合成代謝通路中的關(guān)鍵基因，從而為害蟲防治提供潛在的作用靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試蟲

斜紋夜蛾幼蟲來自中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，按照Huang等(2011)的方法在本實(shí)驗(yàn)室中穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。

1.2 激素合成代謝通路相關(guān)CYP450基因的鑒定

以家蠶BombyxmoriCYP450基因(https:∥drnelson.uthsc.edu/silkworm.pub.htm)為查詢序列，通過blast P在線軟件(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)從斜紋夜蛾基因組(GenBank登錄號:ASM270686v1)中檢索出相似性最高的CYP450基因，并根據(jù)家蠶CYP450基因的名稱給予相應(yīng)的命名。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

為進(jìn)一步揭示這些CYP450基因之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，用Cluster X軟件(Thompsonetal.,1997)比對1.2節(jié)鑒定出的斜紋夜蛾CYP450基因和家蠶全部82個(gè)CYP450基因，然后用MEGA軟件(7.0.18版本) (Kumaretal.,2016)，采用鄰接(neighbor-joining,NJ)法用P-distance模型來構(gòu)建其編碼蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。建樹過程中兩兩比對缺失的氨基酸被排除在外。根據(jù)1 000次重復(fù)來獲得bootstrap值，用于衡量分支的可靠性。

1.4 喂食寄主植物

取30頭剛從3齡蛻皮進(jìn)入4齡的斜紋夜蛾幼蟲，放置于長×寬=30 cm×10 cm的塑料養(yǎng)蟲盒中，喂食種植1～2個(gè)月的寄主植物(辣椒Capsicumannuum、黃瓜Cucumissativus、番薯Ipomoeabatatas和花生Arachishypogaea)葉片，視取食情況及時(shí)添加新的葉片，直到所有幼蟲都化蛹，喂食人工飼料(孫庚等,2015)作為對照。記錄每頭幼蟲從4齡第1天發(fā)育至化蛹所經(jīng)歷的時(shí)間，作為取食寄主植物后幼蟲的發(fā)育歷期。每種寄主植物喂食30頭，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 qPCR檢測基因表達(dá)量

參照我們以往的研究(Guetal.,2003)，分別收集斜紋夜蛾6齡幼蟲、預(yù)蛹和蛹，并在冰上分別解剖中腸、表皮和脂肪體組織。設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)樣品中包括至少3頭個(gè)體。收集1.4節(jié)喂食實(shí)驗(yàn)中發(fā)育至5齡中期的幼蟲，按同上方法解剖其中腸組織。采用Primer Premier (http:∥www.premierbiosoft.com/primerdesign/)為1.2節(jié)中鑒定出的CYP450基因和內(nèi)參基因EF-1α(GenBank登錄號:KC007373)設(shè)計(jì)相應(yīng)的qPCR引物(表1)，并由廣州擎科生物技術(shù)有限公司合成。采用RNAprep Pure Tissue Kit (天根生物技術(shù)公司,北京)提取樣品的總RNA，并采用On-Column DNase (QIAGEN Inc.,Valencia,CA,美國)去除殘留的微量基因組DNA。取1 μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR參考Hu等(2016)采用SYBRVR Premix EX TaqTMMaster Mixture (TaKaRa,大連)，并在ABI7300 Real-time PCR System (Applied Biosystems,Foster City,CA,美國)上進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 31 s,40個(gè)循環(huán)；熔解曲線:95℃ 15 s;60℃ 30 s,95℃15 s。定量PCR的結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析(Livak and Schmittgen,2001)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.6 靶向CYP450基因的miRNA預(yù)測

MiRNA參與變態(tài)發(fā)育過程中多個(gè)蛻皮激素信號通路基因的表達(dá)調(diào)控(Luoetal.,2020)。為探究miRNA是否也參與蛻皮激素合成通路基因的表達(dá)調(diào)控，我們分別利用4種不同軟件PITA(https:∥genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/index.html),miRanda(http:∥www.microrna.org/microrna/getDownloads.do),microTar(http:∥tiger.dbs.nus.edu.sg/microtar/)和RNAhybrid(https:∥bibiserv2.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)預(yù)測能夠靶向P450基因的miRNA，預(yù)測閾值分別設(shè)置為：score≥130(miRanda)，ddG≤-10 (PITA)(Candianietal.,2011;Bondaneseetal.,2014)，energy≥0.5(microTar)(Liuetal.,2018)，ΔG≤-20(RNAhybrid)(Candianietal.,2011)。為了提高預(yù)測的精準(zhǔn)度，只有同時(shí)被3種及3種以上方法預(yù)測到的miRNA才能最終采納。

1.7 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS軟件(SPSS Inc.,Chicago,美國)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用ANOVA中的LSD模型來分析差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 鑒定到的斜紋夜蛾蛻皮激素合成代謝通路相關(guān)CYP450基因

鑒定出了蛻皮激素合成代謝通路相關(guān)的6個(gè)直系同源CYP450基因CYP307A1,CYP306A1,CYP302A1,CYP315A1,CYP314A1和CYP18A1(表1)，這些基因均編碼大約500個(gè)氨基酸，具有2～11個(gè)不等的外顯子。

系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，這6個(gè)CYP450基因歸為兩個(gè)亞家族，其中，CYP307A1,CYP306A1和CYP18A1屬于CYP2亞家族，CYP302A1,CYP315A1和CYP314A1屬于線粒體CYP(mitochondrial CYP,MtCYP)亞家族(圖1)。

圖1 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的蛻皮激素合成代謝通路相關(guān)CYP450蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(1 000次重復(fù))Fig.1 Phylogenetic tree of CYP450 proteins involved in the ecdysone synthesis pathway based on the amino acid sequences using the neighbor-joining method (1 000 repeats)蛋白來源物種和GenBank登錄號Origin species of proteins and their GenBank accession numbers:BmCYP307A1:家蠶Bombyx mori,BAH47267;Sl_CYP307A1:斜紋夜蛾 Spodoptera litura,XP_022833232;BmCYP305B1:家蠶B. mori,BAM73852;BmCYP15C1:家蠶B. mori,C0SPF7;BMCYP303A1:家蠶B. mori,XP_004932789;BmCYP306A1:家蠶B. mori,NP_001106222;Sl_CYP306A1:斜紋夜蛾 S. litura,XP_022819702;BmCYP18A1:家蠶B. mori,NP_001077078;BmCYP18B1:家蠶B. mori,XP_004923216;Sl_CYP18A1:斜紋夜蛾 S. litura,XP_022819704;BmCYP339A1:家蠶B. mori,NP_001121192;BmCYP315A1:家蠶B. mori,NP_001106224;Sl_CYP315A1:斜紋夜蛾 S. litura,XP_022838098;BmCYP333:家蠶B. mori,NP_001266419;BmCYP49A2:家蠶B. mori,NP_001266419;BmCYP314A1:家蠶B. mori,NP_001106219;Sl_CYP314A1:斜紋夜蛾 S. litura,XP_022834006;BmCYP302A1:家蠶B. mori,NP_001036953;Sl_CYP302A1:斜紋夜蛾 S. litura,XP_022816743;BmCYP301A1:家蠶B. mori,XP_021208861;BmCYP49A1:家蠶B. mori,XP_037873587;BmCYP333A2:家蠶B. mori,XP_004932126;BmCYP333B1:家蠶B. mori,XP_004927968;BmCYP333B2:家蠶B. mori,XP_004928105.MtCYP:線粒體CYP Mitochondrial CYP.

2.2 CYP450基因在變態(tài)發(fā)育過程中的表達(dá)

6齡幼蟲期主要是CYP306A1和CYP18A1高表達(dá)，其中前者主要在中腸中表達(dá)，而后者主要在脂肪體中具有最高的表達(dá)水平(圖2:A)。預(yù)蛹期主要是CYP314A1和CYP18A1高表達(dá)，這兩個(gè)基因具有最高表達(dá)量的組織分別為脂肪體和中腸(圖2:C)。在蛹期，CYP306A1,CYP302A1,CYP314A1和CYP18A1具有相對較高的表達(dá)量，其中，CYP306A1仍然在中腸組織中的表達(dá)量最高，CYP302A1在表皮中的表達(dá)量最高，CYP314A1在中腸和脂肪體中表達(dá)量顯著高于表皮中的(P<0.05)，而CYP18A1的最高表達(dá)峰出現(xiàn)在表皮和中腸(圖2:E)。

分組織來看，在蛹期表皮中的CYP18A1具有最高的表達(dá)量，顯著高于其他組織中的(P<0.05) (圖2:B)；在幼蟲期中腸中的CYP306A1具有最高的表達(dá)量，顯著高于其他組織中的(P<0.05)(圖2:D)；CYP314A1在預(yù)蛹期的脂肪體中和CYP18A1在幼蟲期的脂肪體中表達(dá)量最高，顯著高于其他組織中的(P<0.05) (圖2:F)。

總體來看，CYP306A1,CYP314A1和CYP18A1的表達(dá)量相對較高，并且它們分別在幼蟲、預(yù)蛹和蛹期具有最高的表達(dá)量(圖2:A,C,E)。在3個(gè)典型的變態(tài)發(fā)育的組織(表皮、中腸和脂肪體)中，主要是CYP306A1,CYP302A1,CYP314A1和CYP18A1具有較高的表達(dá)，CYP302A1只在表皮組織中有較高的表達(dá)量，而CYP307A1和CYP315A1的表達(dá)量在3個(gè)組織中的表達(dá)量都非常低(圖2:B,D,F)。

2.3 喂食不同寄主植物葉片對斜紋夜蛾幼蟲發(fā)育及CYP450基因表達(dá)的影響

在鑒定的CYP450基因表達(dá)分析中我們發(fā)現(xiàn)CYP306A1在幼蟲中腸組織具有最高的表達(dá)量(圖2:A和D)。為此，我們進(jìn)一步探究了取食不同寄主植物葉片對幼蟲發(fā)育的影響以及對CYP306A1在中腸中的誘導(dǎo)表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)，與喂食人工飼料的對照相比，喂食番薯葉和花生葉顯著延長了4齡幼蟲發(fā)育至蛹的歷期(P<0.05) (圖3:A)。與此同時(shí)，喂食這兩種寄主植物葉片顯著上調(diào)了CYP306A1在5齡幼蟲中腸中的表達(dá)量(P<0.05)(圖3:B)。

圖2 斜紋夜蛾蛻皮激素合成通路相關(guān)的CYP450基因在6齡幼蟲(A)、預(yù)蛹(C)和蛹(E)期及其表皮(B)、中腸(D)和脂肪體(F)中的表達(dá)量Fig.2 Expression levels of the CYP450 genes involved in the edysone synthesis pathway at the 6th instar larval (A),prepupal (C) and pupal (E) stages and in their cuticle (B),midgut (D),and fat body (F)6L:6齡幼蟲6th instar larva;PP:預(yù)蛹Prepupa;P:蛹Pupa.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05,LSD)。圖3同。Data in the figure are mean±SE.Different letters above bars indicate significant difference (P<0.05,LSD).The same for Fig.3.

圖3 喂食斜紋夜蛾4齡幼蟲不同寄主植物葉片對4齡幼蟲發(fā)育至蛹的歷期(A)和5齡幼蟲中腸中CYP306A1表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of feeding the 4th instar larvae of Spodoptera litura with leaves of different host plants on the developmlental duration from the 4th instar larva to pupa (A) and the expression level of CYP306A1 in the midgut of the 5th instar larvae

2.4 靶向CYP450基因的miRNA

結(jié)果表明，有很多miRNA參與調(diào)控CYP307A1,CYP315A1,CYP314A1和CYP18A1，其中靶向CYP307A1的miRNA有7種：miR-1175-5p,miR-2-3p,miR-276-3p,miR-305-5p,miR-316-5p,miR-988-3p和miR-iab-3p；靶向CYP315A1的miRNA有3種：miR-13-5p,miR-31-3p和miR-981-3p；靶向CYP314A1的miRNA有1種：miR-9a-5p；靶向CYP18A1的miRNA有8種：miR-2765-5p,miR-305-3p,miR-307-3p,miR-308-3p,miR-31-5p,miR-3286-5p,miR-34-5p和miR-932-3p(表2)。這些結(jié)果顯示蛻皮激素合成代謝通路受到miRNA廣泛而嚴(yán)密的調(diào)控。

3 討論

2017年我們參與組裝了斜紋夜蛾基因組，從中注釋了138個(gè)CYP450基因，并將這些CYP450基因劃分為4個(gè)亞家族：CYP3,CYP4,CYP2和線粒體CYP(Chengetal.,2017)。CYP3和CYP4基因的分化非常復(fù)雜，通常具有物種特異性的基因擴(kuò)增現(xiàn)象。然而，CYP2和線粒體CYP亞家族卻相對比較保守，在大多數(shù)物種中都存在直系同源基因(Feyereisen,2012;Chengetal.,2017)。這也意味著CYP2和線粒體CYP的功能在不同物種可能具有高度的相似性。根據(jù)直系同源基因比對，本研究從斜紋夜蛾基因組中鑒定出了6個(gè)已知的參與蛻皮激素合成代謝的CYP450基因，它們歸屬于CYP2和線粒體CYP兩個(gè)亞家族(圖1)。研究表明，CYP2亞家族的很多成員，如CYP306A1,CYP307A1和CYP18等都參與昆蟲激素的代謝(Niwaetal.,2004;Rewitzetal.,2006;Nakagawa and Sonobe,2016)。線粒體CYP亞家族在進(jìn)化上也起源于CYP2亞家族，但功能上出現(xiàn)了一定的分化，一部分成員，包括CYP302,CYP314和CYP315參與蛻皮激素的代謝，另一部分如果蠅和按蚊Anopheles的CYP12則參與植物次生代謝產(chǎn)物的解毒代謝(Feyereisen,2006)。

表2 靶向斜紋夜蛾蛻皮激素合成通路相關(guān)CYP450基因的miRNA預(yù)測Table 2 Predication of miRNAs targeting the CYP450 genes involved in the ecdysone synthesis pathway of Spodoptera litura

CYP450基因在昆蟲蛻皮激素合成代謝過程中的功能已經(jīng)被揭示清楚，CYP307A1,CYP306A1,CYP302A1,CYP315A1和CYP314A1參與蛻皮激素的合成(Niwaetal.,2004;Rewitzetal.,2006;Nakagawa and Sonobe,2016)，其中CYP314A1負(fù)責(zé)將蛻皮激素轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿叩?0E，而CYP18A1負(fù)責(zé)降解20E(Guittardetal.,2011)。然而，在變態(tài)發(fā)育過程中哪些CYP450基因發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用呢？我們發(fā)現(xiàn)，在這6個(gè)CYP450基因中，只有CYP306A1,CYP314A1和CYP18A1具有相對較高的表達(dá)量，并且在幼蟲期CYP306A1的表達(dá)量最高，在預(yù)蛹期CYP314A1的表達(dá)量最高，而CYP18A1在蛹期的表達(dá)量最高(圖2)。以往有研究表明，這3個(gè)CYP450基因都是昆蟲變態(tài)發(fā)育所必需的，在果蠅中突變CYP306A1會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形(Niwaetal.,2004)，在柑桔大實(shí)蠅Bactroceraminax中利用RNAi抑制CYP314A1的表達(dá)能夠顯著增加幼蟲的死亡率并導(dǎo)致蛹發(fā)育畸形(Zhouetal.,2022)，在果蠅中利用RNAi抑制CYP18A1的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致蛹死亡(Guittardetal.,2011)。在鱗翅目昆蟲中蛻皮激素的滴度在預(yù)蛹期達(dá)到最高，在蛹期又急劇降低(Riddiford,1994)，蛻皮激素滴度的這種動(dòng)態(tài)變化與CYP314A1和CYP18A1的表達(dá)情況相一致。這顯然是由于預(yù)蛹期CYP314A1的高表達(dá)使得蛻皮激素在該時(shí)期的合成量達(dá)到最高峰，而蛹期CYP18A1的高表達(dá)導(dǎo)致蛻皮激素被大量分解掉。在植物甾醇轉(zhuǎn)化為蛻皮激素的過程中，主要是由CYP307A1,CYP306A1,CYP302A1和CYP315A1負(fù)責(zé)(Niwaetal.,2004;Rewitzetal.,2006;Nakagawa and Sonobe,2016)。然而，本研究中這些基因中只有CYP306A1在不同變態(tài)發(fā)育的組織中都具有很高的表達(dá)量，CYP302A1僅在表皮中有一定的表達(dá)，CYP307A1和CYP315A1在這些組織中幾乎不表達(dá)(圖2)，這意味著，在植物甾醇轉(zhuǎn)化為蛻皮激素的合成過程中，主要是幼蟲期高表達(dá)的CYP306A1在發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。綜合這些結(jié)果可以得出，在蛻皮激素合成代謝過程中，在幼蟲期、預(yù)蛹期和蛹期發(fā)揮關(guān)鍵作用的分別為CYP306A1,CYP314A1和CYP18A1。

我們經(jīng)常會(huì)觀察到取食不同寄主植物后，昆蟲的發(fā)育速率明顯不同。這通常與植物中所含有的某些次生代謝產(chǎn)物對昆蟲具有一定的毒害作用有關(guān)。CYP450基因家族中，CYP3和CYP4基因亞家族成員通常參與昆蟲體內(nèi)的解毒代謝。然而，也有少量的研究表明參與蛻皮激素合成代謝通路的基因也能夠?qū)τ卸疚镔|(zhì)的誘導(dǎo)產(chǎn)生反應(yīng)。例如，殺蟲劑辛硫磷處理后，斜紋夜蛾CYP302A1,CYP306A1和CYP314A1的表達(dá)量顯著上調(diào)(Lietal.,2015;Chengetal.,2017)。在抗啶蟲脒的棉蚜Aphisgossypii中，CYP302A1,CYP314A1,CYP306A1和CYP307A1的表達(dá)量顯著高于在敏感品系中的(Ulahetal.,2020)。我們發(fā)現(xiàn)，喂食番薯和花生葉片的斜紋夜蛾幼蟲發(fā)育歷期顯著慢于喂食其他兩種寄主植物(黃瓜和辣椒)葉片的(圖3:A)；并且，取食番薯和花生葉片的5齡幼蟲中腸組織中CYP306A1的表達(dá)量顯著高于喂食另外兩種寄主植物葉片的(圖3:B)。這意味著，番薯和花生葉片中可能存在著對幼蟲生長發(fā)育有毒害效應(yīng)的次生代謝物質(zhì)，并可以誘導(dǎo)中腸中的CYP306A1產(chǎn)生解毒作用。這些研究結(jié)果表明，參與蛻皮激素合成代謝的某些CYP450基因很可能也同時(shí)參對植物次生代謝產(chǎn)物的解毒代謝。

越來越多的研究表明，miRNA參與了多種昆蟲生理過程的調(diào)控。例如，蛻皮激素信號傳導(dǎo)通路基因，如蛻皮激素受體(ecdysone receptor,EcR)和E74(ecdysone-induced 74)基因等的表達(dá)受到miRNA的嚴(yán)格調(diào)控(Luoetal.,2020)。我們采用不同的miRNA預(yù)測軟件，鑒定出了多個(gè)miRNA能夠靶向蛻皮激素合成通路的CYP450基因(表2)。有研究表明，在小菜蛾細(xì)胞系中添加miR-14b-5p能夠顯著抑制CYP307A的轉(zhuǎn)錄水平(Etebarietal.,2018)。這些結(jié)果意味著蛻皮激素合成通路很可能也受到miRNA的調(diào)控。這些發(fā)現(xiàn)不僅有助于深入理解昆蟲變態(tài)發(fā)育調(diào)控的復(fù)雜機(jī)制，還為將來的害蟲防治提供了潛在的作用靶標(biāo)，有利于斜紋夜蛾等害蟲的可持續(xù)治理。