基于雙元轉(zhuǎn)基因CRISPR/Cas9系統(tǒng)的家蠶pax3基因功能分析

蒲尚昆,王 磊,譚安江,魏國清,*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,合肥 230036;2.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212100;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所,江蘇鎮(zhèn)江 212100)

Paired-box (PAX)家族蛋白是在20世紀(jì)80年代末發(fā)現(xiàn)的一類包含“配對(duì)(paired)”DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子，被稱為“主要調(diào)控因子”，廣泛存在于脊椎動(dòng)物到和無脊椎動(dòng)物中(Thompsonetal.,2021)。該家族所有成員都包含了1個(gè)保守的配對(duì)結(jié)構(gòu)域(paired domain,PD)，有的成員還選擇性地包含其他2個(gè)結(jié)構(gòu)域：八肽域(octapeptide,OP)和同源結(jié)構(gòu)域 (homeodomain,HD) (李莉等,2012)。在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了9個(gè)pax基因：pax1-pax9，其中pax3同時(shí)含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，在黑腹果蠅Drosophilamenalogaster基因組中paired(prd)和gooseberry(gsb)這兩個(gè)基因都與pax3同源(Liu and Xue,2012)。在哺乳動(dòng)物中，pax3的功能缺失會(huì)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)嵴細(xì)胞的正常發(fā)育和肌肉生成(Chappelletal.,2009)，從而導(dǎo)致神經(jīng)管和肢體肌肉缺損(Bhagavatietal.,2007)；在果蠅中，prd在奇數(shù)體節(jié)的不同區(qū)域激活了下游體節(jié)極性基因engrailed(en),wingless(wg)和gsb的表達(dá)。這些基因的相繼表達(dá)對(duì)維持果蠅胚胎發(fā)育過程中前后軸的位置是必需的(Belletal.,2020)。prd和gsb的突變體都會(huì)造成表皮條紋的缺失(Liu and Xue,2012)、體節(jié)發(fā)育的異常(Grahametal.,2019)及胚胎致死等表型，正是因?yàn)閜rd和gsb兩個(gè)基因?qū)儆谏舷掠位?，所以分別敲除之后會(huì)產(chǎn)生相似的表型。除此之外，gsb在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。gsb功能的缺失除了會(huì)造成表皮異常外，也會(huì)造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育缺陷(Marieetal.,2010)。prd的雜合突變體果蠅無法發(fā)育到成蟲階段，在幼蟲期全部致死(Small and Levine,1991)。此外，prd與成蟲雄蠅的生育力也有很大的關(guān)系，有研究表明prd-gsb或prd-pax3雖然可以緩解prd突變對(duì)幼蟲的影響，使其能發(fā)育到達(dá)成蟲期，但是所有的雄蠅的都喪失了生育能力(Baumgartner and Noll,1990)。

pax3的功能雖在哺乳動(dòng)物及果蠅中已有了較為充分研究，但在果蠅以外的昆蟲中研究還非常薄弱，本研究以鱗翅目模式昆蟲家蠶Bombyxmori為對(duì)象，利用CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)敲除技術(shù)，對(duì)Bmpax3展開功能研究。其結(jié)果將有助于闡明pax3在鱗翅目昆蟲生長發(fā)育中的作用，以期為后續(xù)深入研究Bmpax3在家蠶生長發(fā)育中的功能和調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 家蠶的飼養(yǎng)

本研究中所用的野生型家蠶是由江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院家蠶分子遺傳改良實(shí)驗(yàn)室提供的非滯育的Nistari品系。家蠶幼蟲在溫度25～28℃、相對(duì)濕度60%～75%條件下使用新鮮桑葉飼養(yǎng)。

1.2 家蠶pax3序列的驗(yàn)證

通過NCBI數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載Bmpax3基因序列，并且標(biāo)記其外顯子和內(nèi)含子，利用在線網(wǎng)站(www.crispr.dbcls.jp)預(yù)測其sgRNA候選位點(diǎn)，選用2個(gè)序列特異性較高的靶向位點(diǎn)，以靶點(diǎn)所在外顯子處設(shè)計(jì)引物Bmpax3-1F/R和Bmpax3-2F/R (表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序確認(rèn)pax3序列。PCR反應(yīng)體系(50 μL):10×Buffer 5 μL,MgSO43 μL,dNTP Mixture (2 mmol/L) 5 μL,上下游引物(10 μmol/μL)各1 μL,提取家蠶DNA作為模板(200 ng),KOD酶0.5 μL,雙蒸餾水補(bǔ)足到50 μL。擴(kuò)增程序:98℃ 10 s;98℃ 10 s,55℃ 30 s,68℃ 30 s,38個(gè)循環(huán);68℃延伸10 min。4℃存放備用。

1.3 Bmpax3的表達(dá)模式的qRT-PCR檢測

為了明確Bmpax3的表達(dá)模式，對(duì)家蠶5齡第3天幼蟲頭、表皮、脂肪體、中腸、馬氏管、前部絲腺、中部絲腺、后部絲腺和生殖腺(包括精巢和卵巢)進(jìn)行解剖取樣，提取總RNA，使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒，按照使用說明合成cDNA，使用TOYOBO公司的SYBR Green Real-time PCR Master Mix進(jìn)行qRT-PCR，使用Life Technologies公司的StepOnePlus qRT-PCR儀進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)的收集，使用家蠶核糖體蛋白基因Rp49作為內(nèi)參基因，使用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。每個(gè)樣品自3頭家蠶幼蟲混合取樣，點(diǎn)樣時(shí)進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)體系:SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μL,上下游引物(10 μmol/μL)各1 μL,cDNA模板1 μL,無酶水補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)程序:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 15 s,40個(gè)循環(huán)；72℃ 10 s。用2-ΔΔCt法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 Bmpax3突變體的構(gòu)建

利用引物HindⅢ-F和Bmpax3-sg1-R從pBac[IE1-DsRed2]原始質(zhì)粒中用KOD-Plus酶擴(kuò)增出U6啟動(dòng)子，退火溫度為55℃，延伸時(shí)間為30 s,擴(kuò)增得到約500 bp的產(chǎn)物；同樣用Bmpax3-sg1-F和Overlap-R擴(kuò)增出Overlap部分產(chǎn)物進(jìn)行跑膠，得到123 bp DNA產(chǎn)物，再用回收的產(chǎn)物與引物HindⅢ-F和Overlap-R進(jìn)行搭橋擴(kuò)增出第1個(gè)sgRNA，以此便將sgRNA1靶點(diǎn)成功地插入到U6啟動(dòng)子中。同理，按照上述方法擴(kuò)增出第2個(gè)sgRNA。最后用KOD-Plus酶通過橋連PCR分別對(duì)應(yīng)的兩個(gè)U6和sgRNA組裝成U6-sgRNAs單元，并利用Vazyme公司的多片段同源重組試劑盒ClonExpress?MultiS One Step Cloning Kit將它們和用限制性內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行的單酶切原始載體進(jìn)行同源重組。成功構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體pBac[IE1-DsRed2-U6-sgRNAs](圖1:A)，轉(zhuǎn)化后進(jìn)行大量提取質(zhì)粒。將家蠶產(chǎn)下8 h以內(nèi)的蠶卵用清水緩緩沖洗2 min，洗掉表面的鱗毛，整齊擺放在用75%酒精浸泡后的玻璃片上，用膠水將卵固定在玻璃片上，隨后便可將構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體(終濃度為400 ng/μL)、helper質(zhì)粒(終濃度為400 ng/μL)以及編碼PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的mRNA(終濃度為200 ng/μL)混合通過顯微注射導(dǎo)入到產(chǎn)下后蠶卵中，共注射了480粒蠶卵，注射完后用少量膠水封口。將注射后的蠶卵放在密閉的盒子里，加濕后放入25℃的培養(yǎng)箱中催青，在第5天后每天將蠶卵放于燈光下通風(fēng)30 min。11 d后，收集G0代蟻蠶進(jìn)行飼養(yǎng)，至成蟲期后與正常個(gè)體家蠶進(jìn)行交配并收集蠶卵。待蟻蠶孵化后使用熒光顯微鏡篩選帶有紅色熒光的個(gè)體即可得到G1代陽性個(gè)體。當(dāng)G1代個(gè)體發(fā)育到成蟲時(shí)，將其與實(shí)驗(yàn)室已有的nos驅(qū)動(dòng)Cas9表達(dá)pBac[IE1-EGFP-nos-Cas9]轉(zhuǎn)基因家蠶品系的成蟲進(jìn)行雜交(Tanetal.,2013)，交配6 h之后，將雌雄個(gè)體拆對(duì)，留下雌蛾產(chǎn)卵。產(chǎn)下的蠶卵在恒溫箱里放置10 d，當(dāng)幼蟲孵化之后挑選帶有紅光及綠光的家蠶進(jìn)行飼養(yǎng)，得到F1代突變體(圖1:B)，使用引物F3421/R3667和PJET1.2-F/R(表1)進(jìn)行質(zhì)粒序列驗(yàn)證。

圖1 Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建(A)和Bmpax3位點(diǎn)突變示意圖(B)Fig.1 Construction of Cas9 expression vectors (A) and schematic diagram of mutation sites of Bmpax3 (B)A:nos啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9蛋白的表達(dá)。IE1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的DsRed2和EGFP分別作為兩個(gè)載體的篩選標(biāo)記;兩個(gè)U6啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)兩個(gè)sgRNA的表達(dá)Schematic diagram of expression of Cas9 protein driven by nos promoter.DsRed2 and EGFP driven by IE1 promoter were served as the selection markers of two vectors,respectively.The expression of two sgRNAs is driven by two U6 promoters.NLS為核定位序列。NLS stands for nuclear localization sequence.B:突變體(M1和M2)與野生型之間進(jìn)行序列比對(duì)。白色方框分別表示 Bmpax3的 6個(gè)外顯子。紅色箭頭指sgRNA 靶點(diǎn)1 (TS1)和 sgRNA 靶點(diǎn)2 (TS2)均位于2號(hào)和5號(hào)外顯子正義鏈上。第一條序列為野生型序列。黑色堿基表示靶點(diǎn)序列，紅色堿基為PAM序列。虛線表示被刪除掉的堿基，序列后面的數(shù)字代表刪掉的堿基數(shù)目。Sequence alignment was perfomed between the mutants M1 and M2 and the wild-type (WT).The white boxes indicate the six exons of Bmpax3.The sgRNA targeting sites TS1 and TS2,indicated by red arrow,are both located in the sense strand of the exon-2 and exon-5.The target site is denoted in black,and the PAM sequence is marked in red.The dashed lines indicate the deleted residues,and the deletion sizes are shown to the right of each sequence.

1.5 Bmpax3突變檢測

獲得F1代之后選擇雙陽的個(gè)體進(jìn)行突變檢測：在家蠶基因組中距離靶點(diǎn)位置300～400 bp的位置設(shè)計(jì)引物Bmpax3-M1-F/R和Bmpax3-M2-F/R(表1)，以突變體的基因組為模板，使用KOD-Plus酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。之后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，切膠后使用Omega公司的Gel Extraction Kit回收DNA片段。將回收得到的產(chǎn)物連接到pJET-1.2載體上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化涂板并37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，在超凈工作臺(tái)上用無菌牙簽挑單克隆接種到96孔搖菌板上，每個(gè)孔加300 μL含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，置于37℃搖床上培養(yǎng)3～4 h，用Taq酶進(jìn)行進(jìn)行菌落PCR，選擇與目的條帶相等或者小的單克隆菌落進(jìn)行菌液測序，將測序結(jié)果與正常個(gè)體的相應(yīng)基因的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)是否發(fā)生突變及突變發(fā)生的位點(diǎn)

1.6 Bmpax3基因突變體分析

每代雜交至少獲得3個(gè)蛾圈，雜交3代，每一代將每個(gè)蛾圈的雙陽性個(gè)體(約100頭)和只帶有單色熒光的個(gè)體(200頭)篩選之后單獨(dú)飼養(yǎng)，同時(shí)與正常家蠶個(gè)體在相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察1齡幼蟲的生長情況，并對(duì)幼蟲的死亡率及發(fā)育情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，同一代3個(gè)蛾圈得到的數(shù)據(jù)取平均值。當(dāng)存活的個(gè)體發(fā)育到蛹期時(shí)，將突變體的雌雄分開，對(duì)雌雄成蟲的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并記錄。統(tǒng)計(jì)雌雄成蟲末端體節(jié)異常的個(gè)體數(shù)目，同時(shí)對(duì)異常體節(jié)進(jìn)行拍照。

1.7 性別特異性分析

由于突變發(fā)生在末端體節(jié)并且對(duì)生殖器官存在一定的影響，為了確認(rèn)Bmpax3是否參與了性別決定的調(diào)控通路，本研究對(duì)家蠶性別調(diào)控雙性基因Bmdsx的特異剪接體進(jìn)行分析，已知Bmdsx在家蠶體內(nèi)會(huì)存在兩種剪接形式，一種以長片段的分子在雌性家蠶體內(nèi)存在，另一種以相對(duì)短片段在雄性體內(nèi)存在。很多基因?qū)π詣e的調(diào)控都是通過影響B(tài)mdsx的剪接，進(jìn)而調(diào)控性別分化。提取Bmpax3突變體和野生型蛹期第4天雌雄個(gè)體的脂肪RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板用Bmdsx特異性引物Bmdsx-F/R(表1)在KOD-Plus酶的作用下進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，檢測Bmdsx雌雄特異性轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒按照使用說明合成cDNA，體系為Anchored Oligo(dT)18 Primer 1 μL,隨機(jī)引物1 μL,2×TS Reaction Mix 10 μL,TransScriptR RT/R1 Enzyme Mix 1 μL,gDNA Remover 1 μL,無酶水補(bǔ)足到 20 μL。反應(yīng)程序:42℃ 15 min,85℃ 5 s,4℃保存。后續(xù)PCR過程參照方法1.2節(jié)。收集野生型家蠶5齡第3天幼蟲雌性和雄性個(gè)體的頭、表皮、脂肪體、中腸、馬氏管、前部絲腺、中部絲腺、后部絲腺和生殖腺(包括精巢和卵巢)進(jìn)行解剖取樣，提取總RNA，使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒，按照使用說明合成cDNA，并以其為模板用特異性引物Bmpax3-q-F/R(表1)和SYBR Green Real-time PCR Master Mix 進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)(實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)同1.3節(jié))，檢測分析雌雄個(gè)體間Bmpax3表達(dá)量差異。

1.8 數(shù)據(jù)分析

將得到的數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及繪圖。差異顯著性是通過雙尾t檢驗(yàn)并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 Bmpax3的表達(dá)模式

結(jié)果表明，Bmpax3在家蠶5齡第3天幼蟲的不同組織中表達(dá)存在一定的差異(圖2)。Bmpax3在前部絲腺中表達(dá)量最高，在中部絲腺、頭和中腸中表達(dá)量較高，在后部絲腺、精巢及卵巢中有少量的表達(dá)，而在表皮、脂肪體和馬氏管中幾乎沒有檢測到表達(dá)，可以看出其表達(dá)不具有組織特異性。

圖2 家蠶5齡第3天幼蟲不同組織中Bmpax3的表達(dá)模式Fig.2 Expression pattern of Bmpax3 in different tissues of the day-3 5th instar larvae of Bombyx moriHead:頭Head;Cu:表皮Cuticle;FB:脂肪體Fat body;MG:中腸Midgut;MT:馬氏管Malpighian tubules;ASG:前部絲腺Anterior silk gland;MSG:中部絲腺M(fèi)iddle silk gland;PSG:后部絲腺Posterior silk gland;Gonad:生殖腺(包括精巢和卵巢)Gonads including testis and ovary.圖5同。The same for Fig.5.

2.2 Bmpax3突變對(duì)幼蟲生存的影響

Bmpax3突變體的蠶卵孵化率能達(dá)到90%(n=90)左右，與對(duì)照組正常個(gè)體的蠶卵孵化率相比并無顯著差異(P>0.05)。但是收蟻之后，約有80%(n=80)突變體蟻蠶拒絕進(jìn)食，即使有部分個(gè)體最初能進(jìn)食，當(dāng)進(jìn)食1～2 d之后，也會(huì)停止食桑，最后只剩下約15%(n=15)的幼蟲入眠、蛻皮，繼續(xù)發(fā)育到達(dá)2齡，但是部分個(gè)體生長發(fā)育受到了嚴(yán)重影響，其中少部分幼蟲生長幾乎停滯在3齡，明顯表現(xiàn)為齡期延長，期間能少量進(jìn)食，但不能跨越4齡，即不能進(jìn)入眠期，更不能進(jìn)行蛻皮，導(dǎo)致最終死亡；最后僅有大概10%(n=10)的突變個(gè)體能順利發(fā)育到成蟲階段，存活個(gè)體數(shù)與野生型對(duì)照組相比各生長階段沒有顯著差異(P>0.05)(圖3:A)，且成功化蛹后雌雄成蟲數(shù)量存在顯著差異(P<0.05)(圖3:B)，雌成蟲數(shù)量少甚至沒有，雄成蟲數(shù)量接近存活總數(shù)的70%(n=7)，表明當(dāng)Bmpax3發(fā)生突變時(shí)對(duì)家蠶雌性幼蟲生存能力的影響更大。

圖3 家蠶Bmpax3突變體存活個(gè)體數(shù)(A)和成蟲數(shù)量(B)Fig.3 Number of survial individuals (A) and number of adults (B) of Bmpax3 mutants of Bombyx moriWT:野生型Wild-type;△Bmpax3:突變體Mutant;L1-L5:分別為1-5齡幼蟲1st-5th instar larvae,respectively;P:蛹Pupa;Ad:成蟲Adult.下圖同The same for the following figures.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；采用雙尾t檢驗(yàn)檢測兩組數(shù)據(jù)的差異顯著性(**P<0.01;***P<0.001)。圖5同。Data in the figure are the mean±SE.Two-tailed t-test was used to detect the difference between the two groups (**P<0.01;***P<0.001).The same for Fig.5.

2.3 Bmpax3突變體成蟲腹部末端體節(jié)缺陷

Bmpax3突變體在1齡幼蟲時(shí)期大部分死亡，部分存活個(gè)體的個(gè)體末端體節(jié)發(fā)育也發(fā)生了異常，造成蛹期時(shí)部分突變體尾部出現(xiàn)體表?xiàng)l紋混亂，這使雄性個(gè)體表現(xiàn)出介于雌性和雄性之間的表型，而雌性突變體則表現(xiàn)出不規(guī)則的分節(jié)(圖4:A)。隨著蛹的發(fā)育，突變體發(fā)育到成蟲階段時(shí)，其末端體節(jié)存在發(fā)育缺陷，并且可以更加準(zhǔn)確地分辨性別，盡管在蛹期雄性突變體的體節(jié)會(huì)出現(xiàn)與雌性相似的條紋，但是其成蟲依然保持其雄性特征，并未出現(xiàn)雌性化。通過顯微觀察可以清楚看到不論是雌性突變體還是雄性突變體，它們的腹節(jié)腹板都有部分缺失，并且末端體節(jié)發(fā)育不良，分節(jié)混亂，導(dǎo)致腹面或者是背面只有少量鱗毛甚至沒有鱗毛所覆蓋。生殖器官及其周圍的其他輔助器官出現(xiàn)不同程度的損傷(圖4:B)。

圖4 家蠶Bmpax3突變體蛹(A)和成蟲(B)末端體節(jié)的異常形態(tài)Fig.4 Abnormal morphology of the terminal segments in pupae (A) and adults (B) of Bmpax3 mutants of Bombyx mori紅色三角形指示突變發(fā)生處。The red triangles indicate the occurring sites of mutation.

2.4 Bmdsx性別特異性剪接及Bmpax3表達(dá)的性別差異

RT-PCR檢測結(jié)果表明(圖5:A)，Bmpax3的突變并未影響突變體Bmdsx的雌雄特異性剪接，證明Bmpax3可能并沒有參與性別調(diào)控，突變體所表現(xiàn)的末端體節(jié)的異常并沒有對(duì)性別的分化產(chǎn)生影響。將雙陽性的雌雄突變體分別與正常家蠶個(gè)體進(jìn)行交配，發(fā)現(xiàn)無表型缺陷的雙陽突變體能夠正常交配，產(chǎn)生的后代也能夠正常孵化；相反地，存在表型缺陷的突變體，不論雌性個(gè)體還是雄性個(gè)體，即使能表現(xiàn)出正常的求偶行為，最終都不能完成交配。同時(shí)個(gè)體的死亡主要發(fā)生在幼蟲期，為了檢測該基因在野生型家蠶雌雄體內(nèi)的表達(dá)差異，對(duì)5齡第3天幼蟲正常個(gè)體各組織基因表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR檢測，分析其在雌雄個(gè)體間的表達(dá)差異，結(jié)果顯示在5齡第3天幼蟲期時(shí)，雌雄個(gè)體的頭(P<0.001)、中部絲腺(P<0.001)、后部絲腺(P<0.01)及生殖腺(精巢和卵巢) (P<0.001)中的Bmpax3表達(dá)量存在顯著差異(圖5:B)，由此推測家蠶雌雄突變體所表現(xiàn)出的存活率差異可能主要由Bmpax3在雌雄個(gè)體間的表達(dá)量差異所導(dǎo)致?？傊珺mpax3的功能與幼蟲的存活及成蟲的末端體節(jié)正常發(fā)育密不可分。

圖5 通過Bmpax3剪接體表達(dá)量分析家蠶Bmpax3突變體性別二態(tài)性(A)和野生型5齡第3 天雌雄幼蟲不同組織中Bmpax3的表達(dá)量 (B)Fig.5 Sexual dimorphism of Bmpax3 mutants through the analysis of the expression level of Bmpax3 splicesome (A) and the expression levels of Bmpax3 in different tissues of the day-3 5th instar female and male larvae of the wild-type Bombyx moriBmdsxF:雌性特異剪接體Female-specific isoform;BmdsxM:雄性特異剪接體Male-specific splicing isoform.

3 討論

pax3在模式生物黑腹果蠅及哺乳動(dòng)物中的研究已相當(dāng)成熟(Relaixetal.,2005)，但在鱗翅目及其他昆蟲中的具體功能尚不清楚。根據(jù)已有的研究表明，Bmpax3在進(jìn)化上十分保守，并且它的同源基因在果蠅體內(nèi)發(fā)生突變時(shí)都會(huì)表現(xiàn)出明顯的表型缺陷。在本實(shí)驗(yàn)中我們運(yùn)用雙元基因CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)Bmpax3的小片段缺失，在獲得的嵌合突變體中，出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的表型缺陷。

已知果蠅的gsb基因及其同亞家族基因是prd,其在一定層度上可以調(diào)節(jié)gsb的表達(dá)，有研究表明prd和gsb突變所導(dǎo)致的表型缺陷是相近的(He and Noll,2013)，它們都屬于pax3的同源基因；而在家蠶中，目前只有Bmpax3屬于pax3同源基因。研究表明，果蠅gsb在神經(jīng)細(xì)胞及表皮細(xì)胞中高度表達(dá)；而本研究檢測到Bmpax3在家蠶5齡第3天幼蟲頭、中腸、前部絲腺、中部絲腺中都能檢測到表達(dá)(圖2)，在前部絲腺中所檢測到的表達(dá)量最高，在表皮、脂肪體、馬氏管、后部絲腺及生殖腺中表達(dá)量極低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在頭、中部絲腺、后部絲腺及生殖腺中，表達(dá)量存在顯著的性別差異(圖5:B)，結(jié)果顯示在正常的雌性家蠶個(gè)體中，Bmpax3的表達(dá)量明顯比雄性高，與Bmpax3發(fā)生突變時(shí)雌性存活率更低可能存在一定聯(lián)系。果蠅gsb基因主要對(duì)幼蟲角質(zhì)層和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、成蟲期的存活和雄性生殖等過程都是必需的(Ouelletteetal.,1992)，有研究表明當(dāng)其發(fā)生突變時(shí)會(huì)造成表皮條紋的缺失、體節(jié)發(fā)育的異常及胚胎致死等表型。這一表型與本研究在家蠶中得到的結(jié)果相似，Bmpax3突變導(dǎo)致幼蟲大部分死亡，并且主要發(fā)生在1齡幼蟲早期，推測可能在其胚胎時(shí)期已存在缺陷，導(dǎo)致突變體即使能成功孵化，也會(huì)在孵化后陸續(xù)死亡；也可能是Bmpax3的突變影響了與幼蟲取食相關(guān)的器官或基因，導(dǎo)致幼蟲不能進(jìn)食而導(dǎo)致死亡。根據(jù)已有的研究表明前者的可能性更大。同時(shí)，果蠅prd基因與雄蠅的生育力也有很大的關(guān)系(Underhilletal.,2012)。同時(shí)prd也與甲蟲的體節(jié)分化有關(guān)(Davisetal.,2001)。而本研究結(jié)果中，有極少部分突變體能發(fā)育到成蟲階段(圖3)，其中部分個(gè)體腹部末端體節(jié)分節(jié)異常，生殖器官附近的其他保護(hù)器官缺損，表皮條紋紊亂等現(xiàn)象，同時(shí)產(chǎn)生表型突變的個(gè)體不育(圖4)。以上結(jié)果說明家蠶中Bmpax3可能既參與了胚胎發(fā)育的調(diào)控，對(duì)1齡幼蟲的存活起到關(guān)鍵作用，同時(shí)也在體節(jié)分化過程起到了重要的調(diào)控作用，間接導(dǎo)致了突變體的不育。由于Bmpax3突變所引起的表型非常復(fù)雜，涉及的表型眾多且具有致死性，突變體存活個(gè)體少等原因，造成對(duì)其在家蠶體內(nèi)的具體調(diào)控途徑的探索具有一定難度。根據(jù)Bmpax3在家蠶體內(nèi)功能的初步探索，推測在其他昆蟲特別是鱗翅目昆蟲體內(nèi)也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，為該基因功能的進(jìn)一步研究及其調(diào)控家蠶生長發(fā)育的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。