家蠶胚胎中胚胎發(fā)育因子基因BmEDF G4結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證及其結(jié)合蛋白的篩選

黃 瓊,彭玉玲,馮啟理,?？悼?/p>

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,昆蟲科學(xué)與技術(shù)研究所,廣東省昆蟲發(fā)育生物學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州市昆蟲發(fā)育應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510631)

DNA是重要的遺傳物質(zhì)，DNA分子能形成一些非B(non-B)結(jié)構(gòu)(van Holde and Zlatanova,1994)，如Z-DNA、三聯(lián)體(triplex)結(jié)構(gòu)、十字形結(jié)構(gòu)(cruciform)、G-四鏈體(G-quadruplex)和i-motif等結(jié)構(gòu)(Gellertetal.,1962;Frank-Kamenetskii and Mirkin,1995)。在一些鳥嘌呤(guanine,G)富集的區(qū)域會(huì)形成一種特殊的四鏈體結(jié)構(gòu)，被稱為G-四鏈體(G4)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被Gellert等(1962)在體外首次發(fā)現(xiàn)。G-四鏈體的結(jié)構(gòu)有很多構(gòu)型(Collie and Parkinson,2011)，現(xiàn)階段研究比較多且結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定的是由3個(gè)以上G平面構(gòu)成的G4結(jié)構(gòu)(Bugaut and Balasubramanian,2008)，這種結(jié)構(gòu)的G4序列通常可用結(jié)構(gòu)式表示：…G≥3N1-7G≥3N1-7G≥3N1-7G≥3…(N代表A，T或C；數(shù)字表示堿基的數(shù)目)。4個(gè)G可以通過Hoogsteen氫鍵連接構(gòu)成一個(gè)G-四分體(G-quartet)，1價(jià)陽離子(例如K+,Na+等)可以幫助穩(wěn)定G-四分體(Parkinsonetal.,2002)。兩個(gè)或多個(gè)G-四分體堆疊形成G4結(jié)構(gòu)。由于G束(G-tracts)方向多樣、組成G4的DNA鏈多樣、構(gòu)成G4的G-四分體平面數(shù)不同以及連接各G-四分體的環(huán)(loop)不一樣，導(dǎo)致G4結(jié)構(gòu)構(gòu)型的不一樣，所以G4結(jié)構(gòu)存在構(gòu)型和功能的多樣性(Yakuetal.,2012;Qiuetal.,2015)。

研究結(jié)果顯示，基因組中存在大量潛在的G4序列(Rhodes and Lipps,2015;Bedratetal.,2016)，并且傾向于富集在某些功能域，如啟動(dòng)子區(qū)、復(fù)制起始區(qū)、端粒末端等(Rawaletal.,2006;Reedetal.,2006;Maizels and Gray,2013;Bedratetal.,2016)。G4在基因組中的位置和分布上的保守性暗示了該結(jié)構(gòu)在細(xì)胞中起著重要的調(diào)控功能(Nakkenetal.,2009;Capraetal.,2010)。目前G4的生物學(xué)功能主要與DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、端粒壽命等細(xì)胞過程相關(guān)(Bonnaletal.,2003;Bochmanetal.,2012;Valtonetal.,2014;Rhodes and Lipps,2015;Wallgrenetal.,2016;Niuetal.,2019)。幾乎所有這些細(xì)胞過程都涉及與G4特異性相互作用的蛋白質(zhì)。G4結(jié)合蛋白的鑒定對(duì)于研究DNA G4結(jié)構(gòu)的生物學(xué)功能至關(guān)重要。目前已有多個(gè)G4結(jié)合蛋白被鑒定出來，它們均與G4結(jié)構(gòu)的形成、解構(gòu)或功能有關(guān)(Arimondoetal.,2000;Mohagheghetal.,2001;Etzionietal.,2005;Londonetal.,2008;Williamsetal.,2017;Niuetal.,2019)。

有研究表明，G4結(jié)構(gòu)在斑馬魚Daniorerio胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，當(dāng)通過反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)干擾的方法抑制G4形成后，斑馬魚的胚胎發(fā)育受阻，最終死亡(Davidetal.,2016)。本研究為了闡釋G4在家蠶胚胎發(fā)育過程中的功能，我們根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果，篩選到家蠶Bombyxmori胚胎發(fā)育因子(embryonic development factor,EDF)基因BmEDF可能受到G4結(jié)構(gòu)的調(diào)控，而且在家蠶胚胎發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要的調(diào)控功能。通過圓二色譜(circular dichroism,CD)和凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)證明BmEDF的啟動(dòng)子區(qū)存在G4結(jié)構(gòu)，并且核蛋白BmeIF4H在體外條件下可與BmEDF的G4結(jié)構(gòu)結(jié)合，二者可能與家蠶的胚胎發(fā)育有一定關(guān)系，研究結(jié)果可為解析家蠶胚胎發(fā)育的DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)控機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 家蠶材料與主要試劑

實(shí)驗(yàn)材料家蠶為P50(大造)品系，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)所提供，在溫度27℃、相對(duì)濕度70%±5%和光周期設(shè)定為14L∶10D的恒溫培養(yǎng)箱飼養(yǎng)。家蠶 Bm12卵巢細(xì)胞株，用含有10%胎牛血清(HYCLONE,澳洲)的Grace (GIBCO，美國(guó))昆蟲培養(yǎng)基于27～28℃恒溫培養(yǎng)中貼壁培養(yǎng)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScript Reverse Transcription Mix購(gòu)自Promega公司;熒光定量試劑盒Eastep qPCR Master Mix Kit購(gòu)自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司;核蛋白提取試劑盒Minute Cytoplasmic and Nuclear Extraction Kit購(gòu)自Invent公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自貝博公司;鏈霉親和素磁珠購(gòu)自Thermo公司;化學(xué)發(fā)光EMSA試劑盒Light Shift Chemiluminescent EMSA Kit購(gòu)自Thermo公司;表達(dá)載體為pET28a，為實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)DH5α以及BL21(DE3)均購(gòu)自康體生命公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;蛋白純化所用的Ni-NTA鎳柱購(gòu)自GE Healthcare公司;無血清培養(yǎng)基Opti-MEM購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Promega公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司;pGL3載體以及內(nèi)參載體pRL-SV40購(gòu)自 Promega公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用軟件QGRS Mapper(https:∥bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/index.php)預(yù)測(cè)BmEDF的潛在G4序列。將質(zhì)譜鑒定得到的BmEDF蛋白質(zhì)序列與UniProt、家蠶數(shù)據(jù)庫(kù)silkDB3.0(https:∥silkdb.bioinfotoolkits.net/main/species-info/-1)和NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)等蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行比對(duì)。BmEDF基因編號(hào)BGIBMGA003873為家蠶數(shù)據(jù)庫(kù)silkDB3.0登錄號(hào)。用軟件SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用軟件Genscript和NLS Mapper進(jìn)行核定位信號(hào)預(yù)測(cè)，利用軟件Compute pI/Mw Tool(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)進(jìn)行等電點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.3 G4結(jié)構(gòu)的圓二色譜檢驗(yàn)

圓二色譜(CD)是研究DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)常用的方法之一，根據(jù)DNA樣品吸收峰所在的位置，可以判斷該DNA樣品是否含有DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)(Cogoi and Xodo,2006)。將BmEDF的G4序列送至賽默飛公司合成探針，并在探針5′端用生物素(BIO)標(biāo)記，得到的帶標(biāo)簽的G4寡核苷酸探針按比例稀釋至100 mmol/L的工作液濃度，配制退火體系(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,5 μmol/L探針,100 mmol/L KCl)，以不加KCl(0 mmol/L)的退火體系作為對(duì)照?；旌暇鶆蚝笥?5℃加熱10 min，置于沸水中緩慢(4 h以上)冷卻至室溫，促進(jìn)G4序列形成G4結(jié)構(gòu)。

利用CD法檢查G4序列和G4結(jié)構(gòu)。CD實(shí)驗(yàn)采用J-815型CD光譜儀(Jasco International,美國(guó))進(jìn)行。采集的光譜波長(zhǎng)范圍為220～350 nm，步長(zhǎng)為1 nm，響應(yīng)時(shí)間為1 s。CD光譜以在室溫下對(duì)同一樣品的3次掃描平均值的表示，并根據(jù)緩沖區(qū)對(duì)信號(hào)的貢獻(xiàn)進(jìn)行基線校正。本實(shí)驗(yàn)所用的BmEDF(BGIBMGA003873)啟動(dòng)子區(qū)的G4序列為：野生型(WT):5′-TGGTGGGTGGTGGGGAGCGCGGGAGGG GTGCG-3′;突變型(Mut):5′-TGGTGAGTGATGAA GAGCGCGAGAGAGATGCG-3′(下同)。

1.4 G4結(jié)構(gòu)的電泳遷移實(shí)驗(yàn)

電泳遷移實(shí)驗(yàn)同樣可以用于檢驗(yàn)DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)是否形成。使用Light Shift Chemiluminescent EMSA Kit(Thermo,上海)進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)，配制帶生物素標(biāo)記的野生型和突變型G4寡核苷酸探針退火體系(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4,100 mmol/L KCl,5 mmol/L DNA探針)，以及野生型G4寡核苷酸探針不加KCl作為對(duì)照組退火體系(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4,5 mmol/L DNA探針)，混合均勻后于95℃加熱10 min，置于沸水中緩慢(4 h以上)冷卻至室溫，促進(jìn)G4序列形成G4結(jié)構(gòu)，取上述退火探針2 μL稀釋50倍。參照EMSA試劑盒說明書配制20 μL反應(yīng)體系，用4%的非變性聚丙烯酰胺凝膠分析樣品，冰上90 V進(jìn)行電泳，溴酚藍(lán)遷移至凝膠2/3處停止電泳，凝膠被印跡在帶正電的尼龍膜上(Amersham Biosciences,Boston,美國(guó))，使用化學(xué)發(fā)光EMSA試劑盒進(jìn)行顯影。

1.5 BmEDF啟動(dòng)子活性實(shí)驗(yàn)

將BmEDF啟動(dòng)子區(qū)片段連接到pGL3質(zhì)粒中，同時(shí)連接突變G4序列的啟動(dòng)子區(qū)片段到pGL3質(zhì)粒中作為對(duì)照。在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板里植入105/mL的細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，至細(xì)胞密度80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取0.5 μg目的載體以及0.05 μg內(nèi)參載體pRL-SV40，1.5 μL轉(zhuǎn)染試劑，加入25 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中充分混勻，室溫靜置15～20 min，然后轉(zhuǎn)染Bm12細(xì)胞。熒光素酶活性測(cè)定參照上海翊圣生物科技有限公司的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。上述Bm12細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加200 μL裂解液，于4℃搖床輕微震蕩5 min，充分裂解細(xì)胞，于10 000 r/min離心1 min，取20 μL裂解液100 μL熒光素酶底物混勻，用 Promega Glo Max 發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定熒光素酶活性A后，加入100 μL反應(yīng)終止液，繼續(xù)測(cè)定海參熒光素酶發(fā)光值B，A/B的比值即為相對(duì)熒光素酶活性(relative luciferase activity,RLA)，同一轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 BmEDF,BmeIF4H和BmADDH表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè)

根據(jù)BmEDF(BGIBMGA003873)，BmeIF4H(GenBank登錄號(hào):NM_001044195.1)以及BmADDH(GenBank登錄號(hào):XM_038013091.)序列利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物序列，BmEDF-F:5′-GTTTCGTGATCGACACCGCC-3′;BmEDF-R:5′-GA CGGGTGAAAGGCTGGGTT-3′;BmeIF4H-F:5′-CCC ACCAGACCAGACACTTC-3′;BmeIF4H-R:5′-CCG CCGAATATCGACGAAGA-3′；BmADDH-F:5′- TGGT GGCACTCTGTTAGTCC-3′;BmADDH-R:5′- TGTA CTATTTCAACATTACGCCAC-3′。內(nèi)參基因?yàn)锽mRP49，引物序列為:BmRP49-F:5′-CAGGCGGTTCAAGGG TCAATAC-3′;BmRP49-R:5′-TGCTGGGCTCTTTCC ACGA-3′。引物由擎科生物公司合成。取家蠶胚胎發(fā)育各時(shí)期(即產(chǎn)后0.5,2,3,8,16,24,32,40,48,72,96,120,144,156,168,180,196和216 h)的卵，每個(gè)時(shí)期取約30粒卵為1組，取3組重復(fù)，提取RNA，參照GoScript Reverse Transcription Mix試劑盒說明書進(jìn)行加樣，并按照說明書程序反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。參照Eastep qPCR Master Mix Kit試劑盒說明書進(jìn)行加樣，混合均勻后按兩步法PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，3次技術(shù)重復(fù)，擴(kuò)增程序:95℃ 2 min;95℃ 15 s,60℃ 1 min,40個(gè)循環(huán)。

1.7 家蠶胚胎核蛋白的提取及濃度測(cè)定

取家蠶產(chǎn)卵后第1-9天的卵若干，每天30粒左右，將不同時(shí)期的所有卵混合，以PBS緩沖液沖洗兩次，參照Minute Cytoplasmic and Nuclear Extraction Kit(Invent,北京)試劑盒說明書進(jìn)行核蛋白提取。核蛋白濃度用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行測(cè)定。蛋白樣品于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 與G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的家蠶胚胎核蛋白電泳遷移實(shí)驗(yàn)

使用Light Shift Chemiluminescent EMSA Kit(Thermo,上海)進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)，配制帶生物素標(biāo)記的野生型和突變型G4寡核苷酸探針退火體系(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4,100 mmol/L KCl,5 mmol/L DNA探針)，混合均勻后于95℃加熱10 min，置于沸水中緩慢(4 h以上)冷卻至室溫，促進(jìn)G4序列形成G4結(jié)構(gòu)，取上述退火探針2 μL稀釋50倍。參照EMSA試劑盒說明書配制20 μL反應(yīng)體系，實(shí)驗(yàn)組中加入1.7節(jié)提取的家蠶胚胎核蛋白10 μg，于室溫下靜置反應(yīng)20 min，對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，競(jìng)爭(zhēng)探針(相同的DNA序列但沒有生物素標(biāo)記)按比例添加到結(jié)合反應(yīng)中。反應(yīng)結(jié)束后，用4%的非變性聚丙烯酰胺凝膠分析樣品，冰上90 V進(jìn)行電泳，溴酚藍(lán)遷移至凝膠2/3處停止電泳，凝膠被印跡在帶正電的尼龍膜上(Amersham Biosciences,Boston,美國(guó))，使用化學(xué)發(fā)光EMSA試劑盒進(jìn)行顯影。

按上述實(shí)驗(yàn)步驟，配制兩塊同樣4%的聚丙烯酰胺凝膠，制備兩份實(shí)驗(yàn)所用反應(yīng)樣品，使用的所有試劑所有操作以及孵育溫度時(shí)間等條件都相同，分別上樣至兩塊膠中，在同樣條件下進(jìn)行凝膠遷移，遷移結(jié)束后將其中一塊進(jìn)行后續(xù)印跡顯影操作，另一塊置于0.5×TBE緩沖液中，4℃保存。顯影成功后將尼龍膜與凝膠對(duì)應(yīng)，將有滯后條帶對(duì)應(yīng)位置的凝膠切下，送至輝駿生物公司(廣州)進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定。由于與G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的蛋白，應(yīng)該是存在于細(xì)胞核中，所以我們根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果優(yōu)先挑選蛋白分子量在20～40 kD之間的轉(zhuǎn)錄因子，含有核定位信號(hào)的蛋白，并具有蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域的蛋白，或者有研究顯示其功能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控等有一定關(guān)系的蛋白作為與BmEDFG4結(jié)構(gòu)結(jié)合的候選蛋白。

1.9 與G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的候選蛋白BmeIF4H和BmADDH的基因克隆、重組表達(dá)與純化

為了驗(yàn)證BmeIF4H蛋白與BmADDH蛋白是否可以與BmEDF G4結(jié)構(gòu)結(jié)合，取家蠶胚胎發(fā)育各時(shí)期(即1-9 d)的卵提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)BmeIF4H(GenBank登錄號(hào):NM_001044195.1)和BmADDH(GenBank登錄號(hào):XM_038013091.1)基因的CDS序列設(shè)計(jì)和合成引物，BmEIF4H的擴(kuò)增引物：EIF4H-F:5′-GGATCCGATTTGCAGTGTTCCA TGTTTCT-3′；EIF4H-R:5′-AAGCTTACTCATTCGTT TCCCTTAAGTTCT-3′。BmADDH的擴(kuò)增引物:ADDH-F:5′-GGATCCATGGCACACAAACATTCGCT TG-3′；ADDH-R:5′-AAGCTTTCACTCGAGATTTATG TAATTCG-3′。以家蠶卵cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到候選蛋白BmeIF4H和BmADDH基因的開放閱讀框。PCR擴(kuò)增體系(20 μL):cDNA 2 μL,Taq酶0.2 μL,dNTPs 1 μL,10×PCR Buffer 1 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL,ddH2O 15 μL。擴(kuò)增程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,34個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。16℃永久保存。將獲得的DNA片段克隆到帶His標(biāo)簽的pET-28a(+)表達(dá)載體中，構(gòu)建pET-28a-BmeIF4H和pET-28a-BmADDH重組表達(dá)載體。

將pET-28a-BmeIF4H及表達(dá)質(zhì)粒(對(duì)照)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21)，在含有100 μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中加入0.2 mmol/L IPTG，于37℃ 220 r/min誘導(dǎo)4 h。離心收集菌體，結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,50 mmol/L NaCl)重懸菌體，混合后放置冰上超聲破碎，4℃離心取上清，根據(jù)說明書使用Ni-NTA鎳柱進(jìn)行純化，結(jié)合緩沖液配制含咪唑的濃度梯度洗脫液洗脫非特異性結(jié)合蛋白，咪唑濃度梯度分別為20 mmol/L(30 mL),50 mmol/L(20 mL),100 mmol/L(20 mL)和400 mmol/L(6 mL)和1 000 mmol/L(6 mL)。純化蛋白在4℃條件下用緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,50 mmol/L NaCl)透析過夜去除咪唑。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。純化蛋白用SDS-PAGE檢測(cè)。對(duì)于BmADDH蛋白的表達(dá)和純化條件與BmeIF4H的相同，但結(jié)合緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,50 mmol/L NaCl,6 mol/L尿素。純化蛋白在4℃條件下用緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,50 mmol/L NaCl,尿素) 透析過夜，尿素濃度從6 mol/L到4 mol/L到2 mol/L逐漸遞減，以使蛋白復(fù)性。

1.10 候選蛋白BmeIF4H和BmADDH與G4結(jié)構(gòu)和G4序列結(jié)合的電泳遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

候選蛋白BmeIF4H和BmADDH的獲取見1.9節(jié)，BmeIF4H和BmADDH與G4結(jié)構(gòu)和G4序列結(jié)合的電泳遷移實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟同1.8節(jié)。本實(shí)驗(yàn)所用的BmEDF(BGIBMGA003873)啟動(dòng)子區(qū)的G4序列為：野生型(WT):5′-TGGTGGGTGGTGGGGA GCGCGGGAGGGGTGCG-3′;突變型(Mut):5′-TG GTGAGTGATGAAGAGCGCGAGAGAGATGCG-3′。

1.11 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，兩組數(shù)據(jù)之間的差異顯著性用Student氏t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，多組數(shù)據(jù)間的差異顯著性采用單因素方差分析及post-hocTurkey氏HSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 BmEDF啟動(dòng)子區(qū)的G4序列可形成G4結(jié)構(gòu)

對(duì)基因BmEDF的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在該基因啟動(dòng)子-47--70 bp位置區(qū)間內(nèi)CG含量高達(dá)75%，經(jīng)QGRS Mapper軟件分析在-47--70 bp位置預(yù)測(cè)到一個(gè)G4序列。CD結(jié)果顯示，該野生型G4序列在沒有KCl存在的情況下(圖1:A，黑色曲線)最大和最小吸收峰分別在263和240 nm，但波峰波谷不明顯。在100 mmol/L KCl存在情況下，野生型最大吸收峰和最小吸收峰分別在265和240 nm處明顯增強(qiáng)，波峰波谷明顯(圖1:A，紅色曲線)，這是典型的平行G4結(jié)構(gòu)的CD譜(Carvalhoetal.,2017;del Villar-Guerraetal.,2018)，K+有利于G4結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定。當(dāng)G4序列突變后(圖1:A，藍(lán)色曲線)CD峰圖發(fā)生了改變，263和240 nm處吸收峰消失，說明突變后序列無法形成G4結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果說明，BmEDF的G4序列在體外可以形成平行的G4結(jié)構(gòu)。

EMSA結(jié)果顯示，在未加KCl時(shí)，野生型G4高級(jí)結(jié)構(gòu)形成很少，主要存在一條單鏈自由探針(圖1:B，泳道1)，在加入KCl時(shí)，有助于G4高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定，在單鏈自由探針后方有一明顯條帶(圖1:B,泳道2)，說明其已形成G4結(jié)構(gòu)。當(dāng)序列突變后，單鏈探針后方的條帶消失不見，(圖1:B,泳道3)，說明突變后序列無法形成G4結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果同樣說明，BmEDF基因的G4序列在體外可以形成平行的G4結(jié)構(gòu)。

通過突變G4序列，檢測(cè)G4對(duì)BmEDF基因啟動(dòng)子活性的影響，結(jié)果(圖1:C)顯示，對(duì)比野生型G4序列，突變G4序列后，其啟動(dòng)子活性顯著下降了大約3/4(P<0.01)，說明BmEDFG4結(jié)構(gòu)的存在對(duì)BmEDF轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有正調(diào)控的作用。

圖1 家蠶BmEDF G4結(jié)構(gòu)的圓二色譜(A)和凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(B)驗(yàn)證及其對(duì)BmEDF啟動(dòng)子活性的影響(C)Fig.1 Validation of the G4 structure of BmEDF of Bombyx mori by circular dichroism (A) and EMSA (B) and its effects on the promoter activity of BmEDF (C)EMSA:凝膠遷移實(shí)驗(yàn)Electrophoretic mobility shift assay;WT:野生型Wild-type;Mut:突變型Mutant.圖3,5和6同。The same for Figs.3,5 and 6.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上雙星號(hào)表示兩組間差異極顯著(P<0.01,Student氏t檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE.Double asterisk above bars indicates extremely significant difference between two groups (P<0.01,Student’s t-test).

2.2 家蠶胚胎發(fā)育時(shí)期BmEDF基因的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果(圖2)顯示，BmEDF基因在家蠶胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量一直較低，但在產(chǎn)卵后120 h時(shí)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

圖2 BmEDF在不同發(fā)育階段家蠶胚胎中的表達(dá)量Fig.2 Expression levels of BmEDF in Bombyx mori embryos at different developmental stages圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05,單因素方差分析,post-hoc Turkey氏HSD檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE.Different small letters above bars represent significant difference (P<0.05,one-way ANOVA,post-hoc Turkey’s HSD test).

2.3 篩選的與BmEDF基因G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的蛋白

EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，野生型G4序列探針與家蠶胚胎核蛋白孵育明顯出現(xiàn)3條遷移滯后的條帶，并且加入競(jìng)爭(zhēng)探針之后，3條結(jié)合條帶逐漸消失，隨著競(jìng)爭(zhēng)探針濃度增加3條條帶在逐漸減弱，100倍競(jìng)爭(zhēng)探針競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，條帶幾乎消失不見。這一結(jié)果說明，這3個(gè)條帶可能是BmEDF基因的G4與家蠶胚胎核蛋白專一結(jié)合的蛋白條帶。

圖3 EMSA篩選與BmEDF G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的家蠶胚胎核蛋白Fig.3 EMSA experiments of screening embryonic nuclear protein in Bombyx mori binding with the G4 structure of BmEDF泳道Lanes 1-6:1:不加KCl的野生型探針WT probe not added with KCl;2:加入100 mmol/L KCl的野生型探針WT probe added with 100 mmol/L KCl;3:加入100 mmol/L KCl野生型探針+胚胎核蛋白WT probe added with 100 mmol/L KCl+embryonic nuclear protein;4:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+胚胎核蛋白+10×競(jìng)爭(zhēng)探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+embryonic nuclear protein+10×cold probe;5:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+胚胎核蛋白+50×競(jìng)爭(zhēng)探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+embryonic nuclear protein+50×cold probe;6:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+胚胎核蛋白+100×競(jìng)爭(zhēng)探針WT probe added with 100 mmol/L KCI+embryonic nuclear protein+100×cold probe.

2.4 與BmEDF基因G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的蛋白質(zhì)譜鑒定

從圖3中的3條蛋白帶中共鑒定到29種蛋白，篩選得到的其中的兩個(gè)候選蛋白BmADDH (GenBank登錄號(hào):XM_038013091.1)和BmeIF4H (GenBank登錄號(hào):NM_001044195.1)均是細(xì)胞核蛋白，具有與DNA和蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。BmADDH和BmeIF4H在家蠶胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)情況結(jié)果顯示，BmADDH和BmeIF4H在BmEDF高表達(dá)時(shí)期(產(chǎn)卵后120 h時(shí))(圖2)之前都有一個(gè)較高的表達(dá)峰(圖4)。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步表明BmADDH和BmeIF4H可能是BmEDF基因上游的調(diào)控因子。

圖4 qRT-PCR檢測(cè)BmeIF4H (A)和BmADDH (B)在家蠶胚胎發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)量Fig.4 Expression levels of BmeIF4H (A) and BmADDH (B) in Bombyx mori embryo at different developmental stages detected by qRT-PCR

2.5 BmeIF4H和BmADDH蛋白與BmEDF G4結(jié)構(gòu)的結(jié)合

原核表達(dá)獲得BmeIF4H和BmADDH重組蛋白(圖5:A,B;圖6:A,B)。EMSA結(jié)果顯示，形成G4高級(jí)結(jié)構(gòu)的探針在凝膠中比單鏈DNA探針遷移得慢，在自由單鏈探針后方有一明顯條帶，說明其已形成G4結(jié)構(gòu)(圖5:C，泳道1)。在加入BmeIF4H蛋白后，G4結(jié)構(gòu)的條帶明顯減弱，同時(shí)在上方出現(xiàn)一條明顯的結(jié)合條帶(圖5:C，泳道2)，并且隨著蛋白量下降，該條帶的結(jié)合下降(圖5:C，泳道2-4)。在加入競(jìng)爭(zhēng)探針后，結(jié)合條帶明顯減弱，G4結(jié)構(gòu)的條帶則明顯增強(qiáng)，并且隨著競(jìng)爭(zhēng)探針濃度的增加，結(jié)合的條帶逐漸減弱直至消失，G4結(jié)構(gòu)的條帶增強(qiáng)至原始強(qiáng)度(圖5:C，泳道5-8)。而突變探針在G4結(jié)構(gòu)位置無明顯條帶，說明突變后不能形成G4高級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)合條帶也沒有出現(xiàn)(圖5:C，泳道9)，即BmeIF4H蛋白不與突變序列結(jié)合，說明BmeIF4H蛋白與BmEDFG4結(jié)構(gòu)結(jié)合，但并不與G4序列結(jié)合。加入BmADDH蛋白后，無明顯的蛋白-G4結(jié)合條帶，且G4結(jié)構(gòu)條帶并沒有明顯變化，隨著蛋白量的增加，也無結(jié)合條帶出現(xiàn)，說明BmADDH蛋白可能并不與BmEDFG4結(jié)構(gòu)直接結(jié)合(圖6:C)。

圖5 BmeIF4H蛋白表達(dá)(A)和純化(B)及其與BmEDF G4結(jié)合的EMSA分析(C)Fig.5 Expression (A) and purification (B) of BmeIF-4H and EMSA analysis of its binding with the G4 structure of BmEDF (C)M:蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量Protein molecular mass standard;1:未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)Not induced by IPTG;2:總蛋白Total protein;3:上清蛋白 Supernatant protein;4:沉淀蛋白Precipitated protein;5:上清蛋白過柱Supernatant protein through the column;6:結(jié)合緩沖液過柱Binding buffer through the column;7-13:分別用20,50,100,400,400,400和1 000 mmol/L咪唑洗脫Elution with 20,50,100,400,400,400 and 1 000 mmol/L imidazole,respectively;14:加入100 mmol/L KCl的野生型探針WT probe added with 100 mmol/L KCl;15:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+138 μmol/L BmeIF4H WT probe added with 100 mmol/L KCl+138 μmol/L BmeIF4H;16:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+69 μmol/L BmeIF4H WT probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H;17:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+34.5 μmol/L BmeIF4H WT probe added with 100 mmol/L KCl+34.5 μmol/L BmeIF4H;18:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+69 μmol/L BmeIF4H +10×競(jìng)爭(zhēng)探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H+10×cold probe;19:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+69 μmol/L BmeIF4H+50×競(jìng)爭(zhēng)探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H +50×cold probe;20:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+69 μmol/L BmeIF4H +100×競(jìng)爭(zhēng)探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H +100×cold probe;21:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+69 μmol/L BmeIF4H +200×競(jìng)爭(zhēng)探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H +200×cold probe;22:加入100 mmol/L KCl的突變型探針+69 μmol/L BmeIF4H Mut probe added with 100 mmol/L KCl+69 μmol/L BmeIF4H.

圖6 BmADDH蛋白表達(dá)(A)和純化(B)及其與BmEDF G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的EMSA分析(C)Fig.6 Expression (A) and purification (B) of BmADDH and EMSA analysis of its binding with the G4 structure of BmEDFM:蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量Protein molecular mass standard;1:未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)Not induced by IPTG;2,5:總蛋白Total protein;3,6:上清蛋白Supernatant protein;4,7:沉淀蛋白Precipitated protein;8:蛋白過柱Protein through the column;9:結(jié)合緩沖液過柱Binding buffer through the column;10-13:分別為用20，50,100和400 mmol/L咪唑洗脫Elution with 20,50,100 and 400 mmol/L imidazole,respectively;14,15:依次用2和0 mol/L尿素進(jìn)行透析Diaysis with 2 and 0 mol/L urea subsequently;16:用PBS緩沖液進(jìn)行透析Dialysis with PBS buffer;17:加入100 mmol/L KCl的野生型探針WT probe added with 100 mmol/L KCl;18:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+260 μmol/L BmADDH WT probe added with 100 mmol/L KCl+260 μmol/L BmADDH;19:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+130 μmol/L BmADDH WT probe added with 100 mmol/L KCl+130 μmol/L BmADDH;20:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+65 μmol/L BmADDH WT probe added with 100 mmol/L KCl+65 μmol/L BmADDH;21:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+130 μmol/L BmADDH +10×競(jìng)爭(zhēng)探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+ 130 μmol/L BmADDH +10×cold probe;22:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+130 μmol/L BmADDH +50×競(jìng)爭(zhēng)探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+ 130 μmol/L BmADDH +50×cold probe;23:加入100 mmol/L KCl的野生型探針+130 μmol/L BmADDH +100×競(jìng)爭(zhēng)探針WT probe added with 100 mmol/L KCl+ 130 μmol/L BmADDH +100×cold probe;24:加入100 mmol/L KCl的突變型探針+130 μmol/L BmADDH Mut probe added with 100 mmol/L KCl+130 μmol/L BmADDH.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)BmEDF基因啟動(dòng)子區(qū)含有潛在的G4序列，在體外可以形成G4結(jié)構(gòu)(圖1)。我們前期在家蠶中鑒定到一個(gè)特異性G4結(jié)合蛋白BmLARK (Niuetal.,2019)，那么BmLARK蛋白是否通過與BmEDF基因的G4結(jié)構(gòu)結(jié)合而發(fā)揮作用的呢？然而在核蛋白的質(zhì)譜分析中并沒有鑒定到BmLARK，可能原因是多樣的：第一，BmEDF的G4可能并不與BmLARK結(jié)合；第二，BmLARK蛋白與G4結(jié)構(gòu)結(jié)合作用較弱，沒有檢測(cè)到它們的結(jié)合；第三，與G4結(jié)構(gòu)相結(jié)合并且發(fā)揮調(diào)控作用的蛋白可能并不是單一的，而是多個(gè)蛋白共同與其結(jié)合，形成蛋白復(fù)合體進(jìn)而發(fā)揮其調(diào)控作用；第四，在體內(nèi)發(fā)生結(jié)合作用的蛋白，在體外實(shí)驗(yàn)過程中，可能因?yàn)闆]有合適的條件因而不結(jié)合了。因此本研究通過DNA pull-down和EMSA等方法鑒定與BmEDF啟動(dòng)子G4特異性結(jié)合的蛋白，結(jié)果顯示體外條件下BmeIF4H與BmEDF基因啟動(dòng)子區(qū)的G4結(jié)構(gòu)可以結(jié)合(圖5)。BmeIF4H是翻譯起始因子，在蛋白質(zhì)翻譯過程中發(fā)揮作用。該蛋白含有RNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域(RNA recognization motif,RRM)，RRM可以與RNA序列結(jié)合，也可以與DNA序列結(jié)合(Marisetal.,2005)。在BmLARK中，含有兩個(gè)RRM，它們是與BmPOUM2的G4結(jié)構(gòu)結(jié)合所必需的(Pengetal.,2021)。有研究表明，兔eIF4H在蛋白質(zhì)翻譯合成中能夠刺激其他真核啟動(dòng)因子例如eIF4B和eIF4F的體外活性(Richteretal.,1998)。雖然，我們還沒有研究證據(jù)表明BmeIF4H參與了家蠶的胚胎發(fā)育過程，但是由于BmEDF基因在家蠶胚胎中后期上調(diào)表達(dá)，而BmeIF4H能與BmEDF基因的G4結(jié)構(gòu)結(jié)合，因此我們推測(cè)BmeIF4H和BmEDF可能參與了家蠶的胚胎發(fā)育過程。

本研究鑒定到一個(gè)可能與BmEDF基因G4結(jié)構(gòu)結(jié)合的蛋白BmeIF4H，兩者之間的結(jié)合及調(diào)控活性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。但這一結(jié)果為深入研究G4結(jié)構(gòu)參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和家蠶胚胎發(fā)育提供了依據(jù)，為G4-蛋白相互作用的生物功能研究提供參考。