BoBs技術(shù)快速產(chǎn)前診斷胎兒性染色體罕見結(jié)構(gòu)異常2例

斯庭威，莊玲丹，付夏，王玉萍，王炎康，凌麗，武其文

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科遺傳室；2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，安徽 蕪湖 241001)

性染色體病又稱性染色體異常綜合癥，是指由性染色體(X或Y)的數(shù)目異常或結(jié)構(gòu)畸變引起的疾病。人類染色體中性染色體異常，為染色體畸變的一種較常見類型，是導(dǎo)致性器官發(fā)育不全、第二性征及生育功能異常的重要原因，臨床上患者常伴有其他臟器或功能異常和一定程度的智力低下或精神障礙等表現(xiàn)[1]。常見的性染色體數(shù)目非整倍體主要包括45，X、47，XXX、47，XXY、47，XYY及性染色體的嵌合型，在胎兒期的發(fā)生率高達(dá)1/435，與21三體綜合征發(fā)病率接近[2-3]。性染色體結(jié)構(gòu)異常多為染色體片段的缺失、重復(fù)、倒位、異位等，不同的結(jié)構(gòu)異常類型導(dǎo)致的胎兒妊娠結(jié)局和臨床癥狀有所差異。性染色體畸變患者的發(fā)病一般在青春期出現(xiàn)，影響生長(zhǎng)發(fā)育和第二性征等。因此，在宮內(nèi)對(duì)胎兒的性染色體進(jìn)行產(chǎn)前診斷檢查對(duì)預(yù)防由性染色體造成的出生缺陷具有重要意義。

細(xì)菌人工染色體標(biāo)記微珠分離(BoBs)技術(shù)是一種基于液態(tài)芯片原理的用于常見染色體非整倍體和目標(biāo)區(qū)域微缺失/微重復(fù)檢測(cè)的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。由于其高通量、實(shí)驗(yàn)周期短的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于21、18、13、X和Y染色體非整倍體異常以及9種微缺失綜合征的快速檢測(cè)[4-5]。傳統(tǒng)的羊水穿刺染色體核型分析至少需要3～4 w才能出報(bào)告，而BoBs技術(shù)只需2～3 d即可獲得檢測(cè)結(jié)果。BoBs檢測(cè)技術(shù)作為傳統(tǒng)染色體核型分析方法的補(bǔ)充，能夠縮短檢測(cè)時(shí)間，減輕孕婦及其家人的焦慮，在臨床產(chǎn)前診斷中已得到廣泛應(yīng)用。本文我們利用產(chǎn)前BoBs技術(shù)快速檢測(cè)出2例孕婦胎兒性染色體結(jié)構(gòu)異常病例，并對(duì)異常進(jìn)行多技術(shù)平臺(tái)的驗(yàn)證，為孕婦后續(xù)臨床遺傳咨詢提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，報(bào)道如下。

1 病例資料

孕婦1：年齡25歲，孕周>22，否認(rèn)不良孕史、吸煙史及遺傳家族病史，來我院門診進(jìn)行常規(guī)產(chǎn)檢，經(jīng)無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)提示性染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)，要求進(jìn)行羊水穿刺，并簽訂染色體核型分析和產(chǎn)前BoBs檢查知情同意書進(jìn)行產(chǎn)前診斷。查體：孕前體健，輕度貧血貌。

孕婦2：年齡30歲，孕周>20，否認(rèn)遺傳家族病史。既往順產(chǎn)1女，健在，孕期診斷為子癇前期，高血壓，產(chǎn)后血壓恢復(fù)正常。此次妊娠合并貧血，伴有高血壓，口服拉貝洛爾，未口服阿司匹林，來我院門診進(jìn)行常規(guī)產(chǎn)檢，經(jīng)NIPT檢查提示性染色體數(shù)目減少，要求進(jìn)行羊水穿刺，并簽訂染色體核型分析和產(chǎn)前BoBs檢查知情同意書進(jìn)行產(chǎn)前診斷。查體：無宮縮，血壓130/84 mmHg。

2 輔助檢查

孕婦1羊水穿刺術(shù)前B超檢查示：子宮明顯增大，內(nèi)見單胎，胎盤位于子宮側(cè)壁，羊水最大徑線39 mm，胎心率156次/分鐘，羊水未見異常。血常規(guī)、血凝常規(guī)檢查無明顯異常。

孕婦2羊水穿刺術(shù)前B超檢查示：子宮明顯增大，內(nèi)見單胎，胎盤位于子宮后壁，胎頭橢圓形，羊水最大徑線67 mm，胎心率157次/分鐘，羊水正常。血常規(guī)檢查示：白細(xì)胞10.8×109/L[正常參考值范圍：(4～10)×109/L]，血紅蛋白100 g/L(正常參考值范圍：110～150 g/L)，余無異常。

3 分子細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)

3.1 BoBs檢測(cè)及結(jié)果

羊水穿刺后，取羊水5～10 mL用于胎兒基因組DNA提取(QIAamp DNA提取試劑盒，Qiagen，德國(guó))。根據(jù)制造商的說明，用產(chǎn)前BoBs檢測(cè)試劑盒(PerkinElmer Wallac，Turku，芬蘭)檢測(cè)常見的13、18、21、X和Y染色體非整倍體異常和9種微缺失綜合癥。試驗(yàn)操作過程主要分為DNA標(biāo)記、DNA純化、DNA雜交、DNA洗滌以及與報(bào)告分子結(jié)合、Luminex 200(上海透景生命)上機(jī)檢測(cè)。最后，使用BoBsoft 1.0軟件(PerkinElmer,Wallac，Turku，芬蘭)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。產(chǎn)前BOBs試劑盒在X染色體上分布有5個(gè)探針結(jié)合位點(diǎn)(短臂3個(gè)和長(zhǎng)臂2個(gè))，分別位于Xp22.31、Xp22.2、Xp21.1、Xq13、Xq27。Y染色體上也分布有5個(gè)探針結(jié)合位點(diǎn)(短臂1個(gè)和長(zhǎng)臂4個(gè))，分別位于Yp11.2、Yq11.221、Yq11.222、Yq11.223、Yq11.23。孕婦1的BoBs檢測(cè)結(jié)果顯示胎兒X染色體短臂3個(gè)探針信號(hào)減少，可能存在Xp22.31p22.2p21.1區(qū)域缺失，見圖1A。孕婦2胎兒BOBs檢測(cè)Yp11.2區(qū)域信號(hào)增強(qiáng)可能存在片段重復(fù)以及長(zhǎng)臂存在Yq11.221q11.222q11.223q11.23區(qū)域片段缺失，見圖2A。

3.2 染色體核型分析及結(jié)果

2位孕婦均進(jìn)行了羊水染色體核型分析，取羊水20 mL離心后，保留細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。常規(guī)染色體制片，G顯帶至少觀察20個(gè)染色體組，分析3～5個(gè)核型。按照國(guó)際人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名系統(tǒng)(ISCN 2016)進(jìn)行胎兒核型的描述。孕婦1胎兒核型結(jié)果報(bào)告為46，X，del (X) (p11.4)，驗(yàn)證了X染色體短臂存在大片段的缺失，斷裂點(diǎn)位于短臂p11.4，見圖1B。孕婦2胎兒染色體核型結(jié)果報(bào)告為46,X,del (Y) (q11)，檢出了Y染色體存在長(zhǎng)臂大片段的缺失但短臂重復(fù)未檢出，見圖2B。

A：BoBs結(jié)果顯示Xp21-22區(qū)域3個(gè)探針信號(hào)存在缺失(紅色為與正常女性基因組信號(hào)比較；藍(lán)色為與正常男性基因組信號(hào)比較)；B：箭頭所指為X染色體短臂缺失區(qū)域，核型為46，X，del (X) (p11.4)

3.3 Y染色體微缺失及CMA檢測(cè)結(jié)果

為驗(yàn)證孕婦2胎兒BoBs檢測(cè)結(jié)果及染色體核型分析結(jié)果，在征得孕婦夫妻雙方知情同意后，對(duì)胎兒羊水DNA同時(shí)進(jìn)行了Y染色體微缺失以及高分辨率的染色體微陣列(chromosome microarray analysis，CMA)檢測(cè)。運(yùn)用多重PCR熒光探針法試劑盒(上海透景生命科技有限公司)檢測(cè)位于Y染色體短臂的男性性別決定基因SRY以及位于長(zhǎng)臂的AZFa、AZFb、AZFc這3個(gè)區(qū)域，結(jié)果顯示孕婦2胎兒存在AZFb+c區(qū)域缺失，見圖2C。使用含有180K寡核苷酸探針的CGX SNP v1.1芯片(PerkinElmer,Wallac，Turku，芬蘭)進(jìn)行染色體片段重復(fù)/缺失以及SNP檢測(cè)，array芯片分析結(jié)果為：arr [GRCh37] Yp11.32q11.221 (246520_18386235)×2，Yq11.221q12 (18386235_59373566)×0，芯片結(jié)果表明Y染色體短臂存在18.14 Mb重復(fù)，以及長(zhǎng)臂Yq11.221q12存在約40.99 Mb的完全缺失，芯片結(jié)果對(duì)孕婦2胎兒核型修正為46，X，idic(Y) (q11.221)，見圖2D和E。

A：BoBs檢測(cè)結(jié)果顯示Yp11區(qū)域探針信號(hào)增強(qiáng)及Yq11C2～C5區(qū)域缺失(紅色為與正常女性基因組信號(hào)比較；藍(lán)色為與正常男性基因組信號(hào)比較)；B：箭頭所指為長(zhǎng)臂缺失的Y染色體，核型報(bào)告結(jié)果為46，X，del (Y) (q11)；C：Y染色體微缺失檢測(cè)結(jié)果為AZFb+c區(qū)域缺失；D和E：羊水CMA檢測(cè)結(jié)果；D為Y染色體短臂存在重復(fù)，E為Y染色體長(zhǎng)臂存在缺失，修正核型結(jié)果為46，X，idic(Y) (q11.221)

4 討 論

性染色體的結(jié)構(gòu)異常如缺失、重復(fù)、倒位等常是由人類染色體上無規(guī)律的新發(fā)突變引起的，由于性染色體不同片段區(qū)域的功能不同，將會(huì)導(dǎo)致患者臨床癥狀和遺傳表現(xiàn)有所差異。作為染色體產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，傳統(tǒng)核型分析在檢測(cè)染色體數(shù)目異常、大片段的缺失或重復(fù)等結(jié)構(gòu)異常方面具有較高的檢出率，但不能鑒定出小片段(<5 Mb)的亞結(jié)構(gòu)性微缺失/微重復(fù)[6-7]。產(chǎn)前BoBs技術(shù)利用DNA探針在染色體上的分布，提高了其在常見染色體非整倍體染色體數(shù)目變異快速檢出能力。我們應(yīng)用的產(chǎn)前BOBs試劑盒在性染色體探針分布區(qū)域各有5個(gè)位點(diǎn)，X染色體探針區(qū)域包括Xp22.31、Xp22.2、Xp21.1、Xq13.2、Xq27.3，Y染色體探針區(qū)域包括Yp11.2、Yq11.221、Yq11.222、Yq11.223、Yq11.23。臨床檢測(cè)過程中一旦發(fā)現(xiàn)某個(gè)探針位點(diǎn)出現(xiàn)信號(hào)異常，可快速得出該區(qū)域可能存在染色體片段缺失或重復(fù)的可能。

本研究孕婦1胎兒BoBs檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Xp22.31、Xp22.2、Xp21.1 3個(gè)區(qū)域探針信號(hào)缺失，判定為X染色體短臂可能存在缺失，之后的羊水核型結(jié)果驗(yàn)證為46，X，del (X) (p11.4)，表明其存在X染色體短臂缺失。研究表明，Xp22.31區(qū)域的缺失導(dǎo)致ANOS1和STS基因的丟失，這兩個(gè)基因分別與Kallmann綜合征和X連鎖魚鱗病相關(guān)，通常發(fā)生在男性，發(fā)病率為1/2000到1/6000[8-9]。也有研究報(bào)道Xp22.31區(qū)域重復(fù)主要與智力、行為異常等神經(jīng)認(rèn)知方面的臨床表型相關(guān)[10]。經(jīng)遺傳咨詢后，孕婦及其家屬選擇終止妊娠。

孕婦2胎兒BoBs檢測(cè)結(jié)果為Yp11.2區(qū)域重復(fù)，Yq11.221、Yq11.222、Yq11.223、Yq11.23 4個(gè)區(qū)域缺失，提示該患兒存在Y染色體短臂重復(fù)以及長(zhǎng)臂缺失，而核型分析結(jié)果未見短臂重復(fù)，可能與核型分析的分辨率較低有關(guān)。Y染色體微缺失檢測(cè)是針對(duì)Y染色體上一些與男性生殖相關(guān)的基因，如Yp11.3與睪丸發(fā)生相關(guān)的SRY基因和Yq11區(qū)域的與精子發(fā)生相關(guān)的AZFa、AZFb、AZFc 3個(gè)區(qū)域。Yq11.223及Yq11.23區(qū)域含有DAZ1、DAZ2、DAZ3等OMIM基因，位于AZFc區(qū)域，有研究表明該區(qū)域缺失是引起男性無精、少精、不育的原因之一[11-12]。為明確該患兒是否存在AZF區(qū)域缺失，本研究進(jìn)行了Y染色體微缺失檢測(cè)，結(jié)果顯示該胎兒存在AZFb和AZFc區(qū)段聯(lián)合缺失，推測(cè)該胎兒未來在精子生成方面可能會(huì)有缺陷。進(jìn)一步的CMA檢測(cè)驗(yàn)證了該患兒存在Y染色體短臂重復(fù)和長(zhǎng)臂缺失，芯片分析結(jié)果為：arr [GRCh37] Yp11.32q11.221 (246520_18386235) ×2，Yq11.221q12 (18386235_59373566) ×0，片段大小為18.14 Mb的重復(fù)以及40.99 Mb的完全缺失，表明該樣本Y染色體為等臂雙著絲粒染色體，根據(jù)芯片結(jié)果修正染色體核型結(jié)果為46，X，idic(Y) (q11.221)，文獻(xiàn)查詢提示該胎兒兒可能會(huì)表現(xiàn)出不育、小睪癥等臨床特征[13]。經(jīng)遺傳咨詢后，該孕婦及其家屬選擇終止妊娠。

Li[14]等研究表明，BoBs技術(shù)在檢測(cè)染色體微缺失/微重復(fù)方面具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性，其檢測(cè)結(jié)果與FISH或CMA完全一致，且相比于這些技術(shù)具有靈敏度高、高通量、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)。本報(bào)道中BoBs檢測(cè)提示孕婦2胎兒Y染色體存在短臂重復(fù)，而傳統(tǒng)核型分析未見短臂異常，并且Y染色體微缺失檢測(cè)和CMA驗(yàn)證了BoBs結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步說明了BoBs技術(shù)在檢測(cè)染色體微重復(fù)/微缺失異常方面具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度。目前關(guān)于產(chǎn)前BoBs檢測(cè)發(fā)現(xiàn)性染色體結(jié)構(gòu)異常(短臂或長(zhǎng)臂缺失/重復(fù))的研究報(bào)道并不多，臨床上以Klinefelter綜合征、Turner綜合征等性染色體數(shù)目異常更為常見。值得注意的是BoBs由于檢測(cè)技術(shù)本身的局限性，只能檢測(cè)染色體的目標(biāo)區(qū)域的基因變異，不能測(cè)出染色體的平衡異位、倒位、點(diǎn)突變、倍性變化、單親二倍體以及甲基化改變，對(duì)于嵌合體的敏感性低，無法檢出低比率的嵌合體[15-16]，仍無法完全取代核型分析，因此需要經(jīng)過染色體核型分析驗(yàn)證，防止發(fā)生漏檢，確保產(chǎn)前診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，本研究我們利用產(chǎn)前BoBs技術(shù)快速檢測(cè)出2例孕婦胎兒性染色體罕見結(jié)構(gòu)異常，為孕產(chǎn)婦后續(xù)的臨床遺傳咨詢提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。產(chǎn)前BoBs是一種靈敏快速的可用于檢測(cè)性染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常的方法，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)染色體核型分析的不足，大大提高了產(chǎn)前診斷的效率和準(zhǔn)確性，為遺傳咨詢提供切實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，從而減少了胎兒出生缺陷的發(fā)生。