甘草活性成分低共熔溶劑提取工藝的研究

劉小琳，陳莎莎，黃瑤雁

（閩南科技學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362332）

甘草為豆科甘草屬多年生草本植物的干燥根或根莖[1]，為我國傳統(tǒng)中藥材。甘草含有多種生物活性成分，其中黃酮類化合物具有抑菌、抗炎，抗氧化等作用[2]。而甘草苷是甘草中一種重要的黃酮類化合物，可增加免疫、抗抑郁、抗糖尿病、保護神經(jīng)等。有研究發(fā)現(xiàn)，甘草總黃酮通過改變小鼠腸道菌群和糞便代謝，減輕伊立替康誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，具有作為化療佐劑的潛力。甘草總黃酮可通過減輕炎癥反應(yīng)、提高抗氧化活性酶活性等途徑來實現(xiàn)小鼠肝組織的修復(fù)，減輕肝損傷[3]。甘草苷對UVB誘導(dǎo)的大鼠皮膚損傷具有保護作用，可作為預(yù)防UVB損傷的有效藥物[4]。

甘草黃酮類活性成分常通過有機溶劑、超聲波、微波等方法提取[5]。與上述方法相比，低共熔溶劑（DES）具有低成本、反應(yīng)快、易合成、可降解、低毒性或非毒性等特點[6]。通過氫鍵結(jié)合的機化合物和離子型化合物可以形成DES[7]。采用DES提取在天然活性成分的提取中應(yīng)用廣泛[8]。研究中的甘草總黃酮和甘草苷活性成分采用超聲法，并結(jié)合氯化膽堿和乙二醇組成的DES同步提?。徊捎庙憫?yīng)面法優(yōu)化獲得最佳提取工藝，以期探索甘草資源的高效利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘草，購自泉州藥店；蘆丁標準品，Aladdin（上海）有限公司提供；氯化膽堿，Macklin（上海）有限公司提供；乙腈，國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；乙二醇、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、醋酸銨，西隴化工股份有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

V-1800PC型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀表公司產(chǎn)品；Agilent 1260型高效液相色譜儀，C18反相色譜柱（20RBAX SB-C18，4.6 mm×150 mm，50 μm），德國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；TDL-40B型離心機，上海安亭科學(xué)儀器設(shè)備廠產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 DES的制備

根據(jù)已有文獻報道[9-10]及前期試驗結(jié)果，選取以氯化膽堿作為氫鍵受體，乙二醇作為氫鍵供體，按照1∶4的比例混合，加入一定體積的水，于80℃水浴條件下加熱攪拌至完全溶解，形成均勻液體。

1.3.2 原料預(yù)處理

取一定量甘草，于60℃下恒溫烘干至質(zhì)量不變，粉碎過篩（40目），得到甘草粉末，避光冷藏（8℃）備用。

1.3.3 提取工藝

取一定量甘草粉末，加入一定含水率的DES混合均勻，于超聲功率200 W，恒溫條件下水浴浸提，再將混合液離心，取上清液，即甘草提取液。

1.3.4 總黃酮含量的測定

總黃酮含量采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[11]測定。根據(jù)標準曲線（蘆丁）計算甘草黃酮類物質(zhì)提取量。其中，擬合的回歸方程為Y=14.057X-0.016 5，R2=0.999 4。其公式為：

式中：W1——總黃酮提取量，mg/g；

V——提取液體積，mL；

C1——溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；

n——稀釋倍數(shù)；

m——粉末質(zhì)量，g。

1.3.5 甘草苷含量的測定

色譜條件：在靳雪飛等人[12]的方法上進行條件改動，選用C18反相色譜柱（4.6 mm×150 mm，50 μm）；流動相：乙腈（A）0.03 mmol/L，醋酸銨（B）；梯度洗脫（0~6.0 min，18%~24%A，82%~76%B；6.0~12.0 min，24%~35%A，76%~65%B；12.0~20.0 min，35%~70%A，65%~30%B），體積流量1.0 mL/min，柱溫28℃，檢測波長327 μm（0~5 min），進樣量20 μL。

測定方法配制0.02 mg/mL的甘草苷標準品溶液，依次取0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 mL標準品溶液于容量瓶定容至25 mL，取20 μL進樣檢測。以標準品溶液甘草苷質(zhì)量濃度（X，μg/μL）為橫坐標，色譜峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。擬合的回歸方程為Y=14 451X+134.78，R2=0.999 3。對照甘草苷標準曲線得出提取液中甘草苷量，計算出甘草提取液中甘草苷的提取量。其公式為：

式中：W2——甘草苷提取量，mg/g；

C2——高效液相測定的提取液甘草苷質(zhì)量濃度，μg/μL；

V——提取液體積，mL；

m——甘草粉末質(zhì)量，g。

1.3.6 優(yōu)化試驗

在前期已完成的單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計響應(yīng)面，選取4個自變量依次是DESs含水率（A）、料液比（B）、超聲溫度（C）、超聲時間（D），選取2個響應(yīng)值依次是甘草總黃酮提取量、甘草苷提取量。

試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 試驗因素與水平設(shè)計

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面試驗設(shè)計分析使用Design Expert 11.0軟件。其中，“*”表示差異顯著p＜0.05，“**”表示差異極顯著p＜0.01。試驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面分析結(jié)果

響應(yīng)面分析試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果

2.2 總黃酮提取量回歸模型方差分析

依據(jù)2.1試驗結(jié)果，建立關(guān)于4個影響因素A，B，C，D與總黃酮提取量（Y1）之間的多元二次回歸模型，得到方程如下：

總黃酮提取量回歸方程的R2=0.934 5，說明有93.45%的響應(yīng)面值符合此模型，試驗因素影響較大，相關(guān)性高；R2adj為0.869 1，說明有86.91%的試驗數(shù)據(jù)變化可用此模型作參考；精密度值為12.75，說明方程有好的擬合效果；變異系數(shù)為2.87%，說明此方程具有較高的合理性。

響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析見表3。

表3 響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析

由表3可知，失擬項p=0.396 8＞0.05，說明該模型具有較高的擬合度，選擇總黃酮提取量與各因素之間關(guān)系科學(xué)合理；該模型方程p＜0.000 1，說明該模型顯著性極好。據(jù)F值可知，4個影響因素對總黃酮提取量的影響順序由大到小為超聲溫度＞DESs含水率＞料液比＞超聲時間。

2.3 甘草苷提取量回歸模型方差分析

依據(jù)2.1試驗結(jié)果，建立關(guān)于4個影響因素A，B，C，D與甘草苷提取量（Y2）之間的多元二次回歸模型，得到方程如下：

甘草苷提取量回歸方程的R2=0.976 0，說明有97.60%的響應(yīng)面值符合此模型，試驗因素影響較大，相關(guān)性高；R2adj為0.951 9，說明有95.19%的試驗數(shù)據(jù)變化可用此模型作參考；精密度值為22.60，說明方程有較好的擬合效果；變異系數(shù)為1.94%，說明此方程具有較高的合理性。

響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析見表4。

表4 響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析

失擬項p=0.892 1＞0.05，說明該模型具有較高的擬合度，選擇甘草苷提取量與各因素之間關(guān)系科學(xué)合理；該模型方程p＜0.01，說明該模型顯著性極好；據(jù)F值可知，4個影響因素對甘草苷提取量的影響順序由大到小為DESs含水率＞超聲溫度＞料液比＞超聲時間。

2.4 最佳組合工藝的確定及驗證

綜合分析回歸方程及三維響應(yīng)面圖，得出甘草總黃酮和甘草苷的最優(yōu)提取工藝條件為DESs含水率41.677%，料液比1∶52.44（g∶mL），超聲溫度62.376℃，超聲時間39.953 min。為了方便驗證模型的有效性，取DESs含水率41.7%，料液比1∶52.4（g∶mL），超聲溫度62.5℃，超聲時間40 min。在超聲功率200 W條件下得到總黃酮和甘草苷提取量依次為26.83 mg/g和10.73 mg/g，與響應(yīng)面模型預(yù)測值26.912 mg/g和10.746 mg/g非常接近，說明該回歸方程可行。

3 結(jié)論

研究表明，李志英等人[13]采用超聲輔助雙水相系統(tǒng)提取甘草總黃酮，提取量為1.96 %；何自強等人[14]采用超聲輔助堿性乙醇浸提法提取甘草總黃酮，提取量為2.1%。試驗采用超聲輔助低共熔溶劑（氯化膽堿-乙二醇）提取甘草活性成分總黃酮和甘草苷，在超聲功率200 W，低共熔溶劑含水率41.7%，料液比1∶52.4（g∶mL），超聲溫度62.5℃，超聲時間40 min的條件下得到總黃酮和甘草苷的提取量最高，依次為26.832 mg/g（2.68%）和10.727 mg/g，總黃酮提取量高于堿性乙醇法提取和雙水相系統(tǒng)提取。該方法可行且更綠色環(huán)保，為甘草資源的綜合開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。