一例南美白對(duì)蝦十足目虹彩病毒來(lái)源初探

施禮科，葉 鍵，王 力，姜路辛，蔣 靜

(杭州市農(nóng)機(jī)技術(shù)推廣中心，浙江杭州 310017)

南美白對(duì)蝦是當(dāng)前世界上養(yǎng)殖規(guī)模最大、產(chǎn)量最高的對(duì)蝦，具有肉質(zhì)鮮美、抗病力強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)。隨著養(yǎng)殖面積的擴(kuò)大和集約化生產(chǎn)的發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，病害頻發(fā)，極大地制約了南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其中十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，以下簡(jiǎn)稱DIV1)是近年來(lái)流行的主要病原之一。DIV1感染可引起養(yǎng)殖對(duì)蝦短時(shí)間內(nèi)暴發(fā)大面積死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2020年我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、海關(guān)總署正式將DIV1列位二類疫病。

2021年，杭州市農(nóng)機(jī)技術(shù)推廣中心選取了幾家典型的南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行DIV1 跟蹤檢測(cè)，其中一家養(yǎng)殖場(chǎng)在養(yǎng)殖后期加注外源河道水兩天后發(fā)生病害。根據(jù)發(fā)病前場(chǎng)內(nèi)對(duì)蝦檢測(cè)均呈現(xiàn)病毒陰性的情況，筆者對(duì)可能的病毒來(lái)源進(jìn)行了分析，并取樣檢測(cè)，初步發(fā)現(xiàn)外源水為重要傳染來(lái)源。同時(shí)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室感染驗(yàn)證，現(xiàn)將相關(guān)情況總結(jié)如下。

一、檢測(cè)樣品獲取

在杭州市設(shè)立南美白對(duì)蝦跟蹤監(jiān)測(cè)點(diǎn)3個(gè)，放苗前及放苗后每月對(duì)場(chǎng)內(nèi)對(duì)蝦取樣檢測(cè)DIV1。取樣方法按照《水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范》(SC/T 7103-2008)規(guī)定進(jìn)行，取苗時(shí)盡量選活力較弱的蝦苗。每份樣品加貼采樣標(biāo)簽，并填寫《蝦苗現(xiàn)場(chǎng)采樣記錄表》。河道水病毒采取直接取水100微升進(jìn)行檢測(cè)。

二、檢測(cè)方法

DNA 提取使用Qiagen DNA Mini Kit 試劑盒，使用套式PCR 方法對(duì)獲取樣品進(jìn)行DIV1 檢測(cè)。第一步擴(kuò)增引物SHIV-F1：5＇-GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT-3＇和SHIV-R1：5＇-TCGTTTCGGTACGAAGATGTA-3＇；第二步擴(kuò)增引物SHIV-F2：5＇-CGGGAAACGATTCGTATTGGG-3＇和SHIV-R2：5＇-TTGCTTGATCGGCATCCTTGA-3＇。第一步擴(kuò)增程序?yàn)?5℃變性；95℃30 秒、59℃30 秒、72℃30 秒，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 分鐘。第二步擴(kuò)增程序?yàn)?5℃變性；95℃30 秒、59℃30 秒、72℃20 秒，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸2分鐘。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳后，回收第二步擴(kuò)增陽(yáng)性條帶，送Takara 公司進(jìn)行克隆測(cè)序。測(cè)序所得序列通過(guò)NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析。

三、實(shí)驗(yàn)室感染模型構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)用蝦購(gòu)自杭州市某淡化苗種場(chǎng)，經(jīng)檢測(cè)未攜帶DIV1。飼養(yǎng)密度為每28 升水體養(yǎng)殖40 尾，飼養(yǎng)至3厘米規(guī)格后進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)。人工感染分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每個(gè)組別各設(shè)3 個(gè)養(yǎng)殖單位。實(shí)驗(yàn)組按養(yǎng)殖水體1/3 的量加入受污染的河道水，之后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組按每天兩次正常投喂飼料；7 天后每個(gè)養(yǎng)殖單位取10 尾蝦，解剖獲得肝胰腺，混合后檢測(cè)DIV1。

四、結(jié)果與分析

1.發(fā)病養(yǎng)殖場(chǎng)病樣診斷及外源河道水檢測(cè)

病蝦出現(xiàn)空腸、空胃、肝胰腺顏色變淺萎縮、體色變紅等癥狀(圖1)，游動(dòng)能力和反應(yīng)減弱。對(duì)發(fā)病養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)蝦苗、外源河道水、病蝦肝胰腺檢測(cè)DIV1，第一次擴(kuò)增外源河道水和發(fā)病蝦肝胰腺呈現(xiàn)陽(yáng)性(圖2)，其中發(fā)病蝦肝胰腺呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性；擴(kuò)增蝦苗(苗池加注了外源水)、外源河道水、發(fā)病蝦肝胰腺均呈陽(yáng)性(圖3)。結(jié)合癥狀初步判斷，病蝦為十足目虹彩病毒病，場(chǎng)內(nèi)蝦苗(苗池加注了外源水)為DIV1 弱陽(yáng)性，外源河道水為DIV1陽(yáng)性。

圖1 病蝦

圖2 套式PCR第一步擴(kuò)增

圖3 套式PCR第二步擴(kuò)增

2.實(shí)驗(yàn)室感染結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組3個(gè)養(yǎng)殖單位南美白對(duì)蝦肝胰腺第一次和第二次擴(kuò)增均呈DIV1 陽(yáng)性，對(duì)照組3 個(gè)養(yǎng)殖單位南美白對(duì)蝦肝胰腺第一次和第二次擴(kuò)增均呈DIV1 陰性(圖2、圖3)

3.陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序所獲得序列長(zhǎng)度及BLAST結(jié)果見(jiàn)表1，所有陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果均為DIV1 ATPase gene。

表1 陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

五、討論

該批次發(fā)病南美白對(duì)蝦在放養(yǎng)前對(duì)蝦苗進(jìn)行過(guò)檢測(cè)，未檢出DIV1，跟蹤檢測(cè)結(jié)果也一直呈現(xiàn)陰性，換水兩天后暴發(fā)十足目虹彩病毒病，且外源河道水DIV1 呈陽(yáng)性。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室人工感染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，初步判斷此病例為加注受污染的外源河道水引發(fā)。南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖后期通常為晴熱高溫天氣，養(yǎng)殖戶往往會(huì)加注外源水對(duì)養(yǎng)殖池塘進(jìn)行水量補(bǔ)充，因此，加注外源水時(shí)需謹(jǐn)慎，最好先經(jīng)過(guò)檢測(cè)，確保加注的外源水不攜帶病原。

跟蹤檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，發(fā)病場(chǎng)同時(shí)用攜帶DIV1 的水源對(duì)成蝦和蝦苗的養(yǎng)殖塘進(jìn)行水量補(bǔ)充，成蝦池暴發(fā)病害，苗種檢測(cè)呈弱陽(yáng)性。后期進(jìn)一步跟蹤這批陽(yáng)性苗種，30 天后檢測(cè)DIV1，結(jié)果呈陰性，推測(cè)養(yǎng)殖后期加注新水對(duì)成蝦造成應(yīng)激而發(fā)病。而蝦苗檢測(cè)結(jié)果呈弱陽(yáng)性可能為腸道內(nèi)攜帶病毒導(dǎo)致，實(shí)際未感染，因此后期檢測(cè)結(jié)果為陰性。

繼續(xù)飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組已感染DIV1 的南美白對(duì)蝦至后期，該批南美白對(duì)蝦始終未出現(xiàn)發(fā)病癥狀，這表明DIV1 發(fā)病需要一定的條件。實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖環(huán)境比較穩(wěn)定且單一，養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦應(yīng)激少，推測(cè)為后期不發(fā)病的原因之一。