丙泊酚和七氟醚麻醉對(duì)老年大鼠腹部術(shù)后認(rèn)知功能的影響

范曉英 鄭仲磊 張萬(wàn)平 薛沙

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是全身麻醉后影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，多發(fā)于老年人[1]。合理的麻醉方案有助于保護(hù)患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害。涉及女性子宮附件及胃腸、肝膽和膀胱的手術(shù)均需要開(kāi)腹，而麻醉和手術(shù)與患者POCD的發(fā)生密切相關(guān)。丙泊酚和七氟醚均是臨床十分常用的麻醉維持藥物，有研究報(bào)道，丙泊酚麻醉在腦部手術(shù)患者中具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用[2]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)是一種廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其在神經(jīng)元存活和分化以及突觸可塑性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。BDNF的失調(diào)導(dǎo)致與創(chuàng)傷性腦損傷、腦缺血、神經(jīng)退行性疾病及POCD密切相關(guān)[4,5]。本研究擬通過(guò)觀察丙泊酚、七氟醚麻醉的腹部手術(shù)大鼠認(rèn)知功能，檢測(cè)海馬炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)及BDNF的表達(dá)，揭示丙泊酚在老年患者腹部手術(shù)麻醉中減少認(rèn)知功能損害的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只18月齡健康的清潔級(jí)SD大鼠(537±55)g購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，合格證號(hào)：SCXK(滬)2021-0014。實(shí)驗(yàn)前1周進(jìn)行(23±1)℃，(55±5)%濕度的環(huán)境下足料足水，常規(guī)晝夜飼養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器 丙泊酚乳狀注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字：H20010368)購(gòu)自西安力邦制藥；七氟醚(國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：H20080681)購(gòu)自魯南貝特制藥；戊巴比妥鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；人白介素1β(IL-1β)檢測(cè)試劑盒、白介素6(IL-6)檢測(cè)試劑盒、腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天；兔抗BDNF多克隆抗體(28205-1-AP)、兔抗β-actin單克隆抗體(4970)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用氣體麻醉機(jī)購(gòu)自美國(guó)EZSystems；IQ-1000 多功能氣體檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)IST；YH-MWM Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購(gòu)自武漢一鴻科技公司；XR-XZ301型曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)購(gòu)自上海欣軟信息科技公司。Spark多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自上海帝肯貿(mào)易公司；ChemiDocXRS+凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-rad。

1.3 麻醉與分組 40只大鼠隨機(jī)分為丙泊酚組、七氟醚組，每組20只。

1.3.1 丙泊酚組：大鼠進(jìn)行腹腔注射丙泊酚100 mg/kg麻醉，行開(kāi)腹手術(shù)，關(guān)閉腹腔。

1.3.2 七氟醚麻醉需要帶有鈉石灰的密閉透明麻醉箱，進(jìn)氣孔與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用氣體麻醉機(jī)連接，出氣孔與氣體監(jiān)測(cè)儀連接，監(jiān)測(cè)七氟醚的濃度。

1.3.3 處理：待大鼠自由蘇醒，可行走1 d。從2組大鼠中各選4只，注射戊巴比妥麻醉，斷頸法處死大鼠，無(wú)菌分離海馬，-80℃保存，備用。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[6]大鼠在進(jìn)行麻醉前每天進(jìn)行學(xué)習(xí)訓(xùn)練，連續(xù)5 d，4次/d，每次間隔20 min。第6天對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉手術(shù)。待大鼠蘇醒且可行走后1 d，進(jìn)行逃避潛伏期、游泳距離測(cè)試。連續(xù)5 d，4次/d，每次間隔20 min。通過(guò)水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)記錄大鼠1 min內(nèi)找到水下平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)及游泳路線距離(cm)，以進(jìn)行評(píng)估。

1.5 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 剩余8只大鼠，放在準(zhǔn)備好的礦場(chǎng)分析箱中央格內(nèi)，大鼠自由活動(dòng)5 min。通過(guò)圖像跟蹤監(jiān)視系統(tǒng)記錄大鼠的路程、理毛次數(shù)、站立次數(shù)(離地>1 cm)和跨格次數(shù)(3個(gè)肢體跨入)。每次結(jié)束后，避免氣味殘留，需乙醇擦拭。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 取部分大鼠海馬組織，加入2倍體積的雙蒸水，無(wú)菌研磨。分裝置2 ml的EP管，離心，取上清進(jìn)行炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)，氧化應(yīng)激因子(MDA、SOD)的含量檢測(cè)。具體檢測(cè)的操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，判定標(biāo)準(zhǔn)確定樣本中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、SOD的含量。

1.7 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 無(wú)菌研磨大鼠海馬組織，加入3倍體積的RIPA裂解液，冰上充分裂解。提取組織總蛋白，測(cè)定蛋白濃度并變性。將變性蛋白上樣行SDS-PAGE電泳，再將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。用含有2.5%脫脂奶粉的封閉液37℃孵育2 h。充分洗膜3次，浸入稀釋過(guò)的一抗溶液(兔抗BDNF多克隆抗體，1∶1 000；兔抗β-actin單克隆抗體，1∶2 000)，4℃孵育過(guò)夜。同樣洗膜，浸入稀釋過(guò)的二抗溶液(HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，1∶500)，37℃孵育2 h。洗膜后用ECL發(fā)光液顯影曝光。Image J軟件分析蛋白灰度，用目的蛋白的灰度值與內(nèi)參β-actin的灰度值之比表達(dá)蛋白的相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 丙泊酚組、七氟醚組大鼠剖腹術(shù)前第1、3、5天的逃避潛伏期和游泳距離差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)后丙泊酚組大鼠第1、3、5天的逃避潛伏期和游泳距離均顯著低于七氟醚組(P<0.05)。見(jiàn)表1、2。

表1 2組腹部手術(shù)大鼠逃避潛伏期比較

表2 2組對(duì)腹部手術(shù)大鼠游泳距離比較

2.2 2組腹部手術(shù)大鼠礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)比較 2組大鼠術(shù)后第1天的理毛、站立、跨格的次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第5天的理毛、站立、跨格的次數(shù)丙泊酚組顯著高于七氟醚組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 2組對(duì)腹部手術(shù)大鼠礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)比較 n=20，次,

2.3 2組對(duì)腹部手術(shù)大鼠海馬炎性反應(yīng)比較 丙泊酚組IL-1β、IL-6、TNFα、MDA含量均顯著低于七氟醚組，SOD的含量顯著高于七氟醚組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 丙泊酚、七氟醚對(duì)腹部手術(shù)大鼠海馬炎性因子IL-1β、IL-6、TNFα、MDA、SOD含量比較

2.4 2組對(duì)腹部手術(shù)大鼠海馬BDNF蛋白表達(dá)比較 丙泊酚組大鼠海馬中BDNF的蛋白表達(dá)量顯著高于七氟醚組(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表5。

圖1 BDNF蛋白電泳圖

表5 2組腹部手術(shù)大鼠海馬BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

有學(xué)者認(rèn)為，在一定情況下，麻醉藥可能對(duì)各種神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用，當(dāng)然也有研究者認(rèn)為麻醉藥可能具有神經(jīng)毒性，如引起淀粉樣β的沉積[7,8]。不同的麻醉藥對(duì)大腦的影響及其在不同患者群體和臨床環(huán)境中的功能仍不確定，因此麻醉藥的選擇對(duì)患者認(rèn)知功能的恢復(fù)非常重要。異丙酚可引起發(fā)育期大鼠的大腦神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，但對(duì)老年大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[8]。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后3個(gè)月異丙酚麻醉患者發(fā)生認(rèn)知功能障礙的概率明顯低于七氟醚麻醉，術(shù)后第2天異丙酚麻醉患者的QoR-40總體評(píng)分顯著高于七氟醚麻醉[10]。劉蕊池[11]在探究丙泊酚與七氟醚麻醉對(duì)顱腦損傷患者術(shù)后認(rèn)知功能的研究中報(bào)道，丙泊酚麻醉的患者血清腦損傷標(biāo)志物、應(yīng)激指標(biāo)和MMSE評(píng)分均顯著低于七氟醚麻醉患者。Tang等[12]研究發(fā)現(xiàn)異丙酚可有效改善術(shù)后認(rèn)知功能并降低不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

在一項(xiàng)關(guān)于接受腹腔鏡膽囊切除術(shù)老年患者的麻醉藥比較的研究中顯示，相較于七氟醚或異氟醚麻醉，接受異丙酚麻醉的患者在術(shù)后第1天和第3天發(fā)生認(rèn)知功能障礙者顯著降低，血漿中S-100β和Aβ1-40蛋白及IL-1β、IL-6和TNF-α濃度均顯著降低，說(shuō)明了異丙酚在老年患者腹腔手術(shù)麻醉中有很大優(yōu)勢(shì)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚麻醉的大鼠逃避潛伏期和游泳距離明顯降低，大鼠的理毛、站立、跨格的頻率也明顯升高，充分說(shuō)明了在進(jìn)行腹部手術(shù)時(shí)丙泊酚麻醉優(yōu)于七氟醚，同時(shí)丙泊酚麻醉的大鼠海馬IL-1β、IL-6、TNFα和MDA的濃度均顯著降低，SOD的濃度顯著升高，這也說(shuō)明了丙泊酚麻醉能夠降低大鼠認(rèn)知功能損傷的潛在機(jī)制。

BDNF是一種在神經(jīng)可塑性中起重要作用的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其在術(shù)后認(rèn)知功能障礙中也具有關(guān)鍵作用[14]。Xie等[15]在研究BDNF與術(shù)后患者認(rèn)知功能障礙關(guān)系的研究中報(bào)道，在術(shù)后7 dBDNF rs6265位點(diǎn)攜帶G等位基因的患者發(fā)生認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)低于A等位基因攜帶者，而在術(shù)后3個(gè)月則相反，揭示了BDNF rs6265多態(tài)性可能與術(shù)后7 d認(rèn)知功能障礙的發(fā)生有關(guān)，rs6265位點(diǎn)的A>G突變可能是中國(guó)漢族人群早期認(rèn)知功能障礙的保護(hù)因素。BDNF/TrkB信號(hào)通路的活性在術(shù)后老年小鼠體內(nèi)受到抑制，并且這是小鼠術(shù)后發(fā)生認(rèn)知功能障礙的重要機(jī)制[16]。為了探索麻醉藥丙泊酚和七氟醚對(duì)BDNF是否具有影響，本研究通過(guò)WB法檢測(cè)大鼠海馬中BDNF的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，丙泊酚麻醉大鼠海馬中BDNF的蛋白表達(dá)顯著高于七氟醚麻醉大鼠海馬。此研究結(jié)果更說(shuō)明丙泊酚麻醉對(duì)神經(jīng)損傷的潛在保護(hù)作用，揭示了丙泊酚麻醉對(duì)臨床腹部手術(shù)的老年患者的意義。

總之，丙泊酚在老年大鼠腹部手術(shù)麻醉中可降低炎性和氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)BDNF的神經(jīng)保護(hù)作用，減輕認(rèn)知功能的損害，值得臨床的老年人腹部手術(shù)中進(jìn)行推廣。