產(chǎn)漆酶真菌篩選、鑒定及酶促去除苯酚的條件優(yōu)化

岑慶靜，萬 輝,，劉 薇，李 緒，洪 妮，付桂明，鄭洪立,1c，劉玉環(huán),1b，巫小丹,1c*

(1.南昌大學(xué)a.生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心；b.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.國際食品創(chuàng)新研究院，江西 南昌 330047;2.南昌市檢驗(yàn)檢測中心農(nóng)產(chǎn)品檢測分中心，江西 南昌 330005)

漆酶(laccase，EC 1.10.3.2，簡稱Lac)是含銅多酚氧化酶家族的重要成員，能通過分子氧催化氧化多種酚類、芳胺類等物質(zhì)，且其唯一的催化反應(yīng)副產(chǎn)物為水，已被公認(rèn)為環(huán)境友好型的綠色催化劑，在紙漿漂白、染料脫色、食品加工和有機(jī)污染物處理等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1,2]。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，眾多工業(yè)領(lǐng)域?qū)Ω呋钚云崦傅男枨蟛粩嘣黾?，而其生產(chǎn)成本、產(chǎn)量和催化效率成為了影響漆酶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。真菌漆酶主要來源于白腐真菌，如糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)[3]、云芝(Trametesversicolor)[4]、血紅密孔菌(Pycnoporuscoccineus)[5]、毛栓菌(Trameteshirsuta)[6]和粗毛革孔菌(Coriolopsisgallica)[7]等。然而，不同菌株的產(chǎn)酶能力存在差異，且自然條件下真菌產(chǎn)漆酶水平有限，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。研究表明，芳香化合物和金屬離子是白腐真菌表達(dá)漆酶的有效誘導(dǎo)劑，它們可通過上調(diào)漆酶基因的轉(zhuǎn)錄水平提高真菌漆酶的表達(dá)量[8,9]。在金屬離子中，銅離子對漆酶表達(dá)的促進(jìn)作用最為顯著[10,11]。此外，芳香化合物與金屬離子之間還可能存在協(xié)同誘導(dǎo)作用，但不同誘導(dǎo)劑的復(fù)合影響存在差異[8]。選育高產(chǎn)漆酶菌株并優(yōu)化其產(chǎn)酶誘導(dǎo)條件，仍然是目前提高真菌漆酶生產(chǎn)水平的重要手段。

苯酚及其衍生物廣泛存在于化工、煉油、造紙、制藥等工業(yè)廢水中[12]，由于其毒性風(fēng)險高、難去除，已成為環(huán)保部門重點(diǎn)關(guān)注的環(huán)境污染物。此外，苯酚也是飲用水中嚴(yán)格監(jiān)測的污染物，國家標(biāo)準(zhǔn)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB5749—2006規(guī)定飲用水中的揮發(fā)酚類(以苯酚計(jì))含量的限值為0.002 mg·L-1。為了控制酚類有毒物質(zhì)帶來的污染風(fēng)險，蒸餾、萃取、膜處理、吸附、光催化、高級氧化技術(shù)等多種方法被廣泛研究，相比而言，近年來新興的酶催化法(特別是漆酶和過氧化物酶)具有環(huán)境友好、條件溫和、高效和低成本等優(yōu)點(diǎn)，成為處理酚類污染物的重要技術(shù)[12-13]。已有研究表明，漆酶對酚類、芳胺類等頑固性有機(jī)污染物具有良好的催化效果，催化形成不溶性的聚合物，可采用過濾等方法將其從廢水中除去，實(shí)現(xiàn)水質(zhì)凈化[14-15]。由于漆酶的催化效率與漆酶來源和催化條件(如溫度和pH等)等諸多因素息息相關(guān)，探究這些因素對實(shí)現(xiàn)酚類污染物的高效去除具有重要意義。

本研究從自然環(huán)境中分離到一株高產(chǎn)漆酶的粗毛革孔菌(C.gallica)NCULAC F1，探究了其生產(chǎn)漆酶的誘導(dǎo)條件，并將其所產(chǎn)漆酶應(yīng)用于苯酚去除，進(jìn)一步優(yōu)化作用條件，以實(shí)現(xiàn)苯酚高效去除。目前應(yīng)用于酚類污染物處理的白腐菌漆酶多來源于云芝(T.versicolor)，而粗毛革孔菌漆酶的應(yīng)用鮮有報道。本研究發(fā)現(xiàn)粗毛革孔菌NCULAC F1產(chǎn)漆酶能力較強(qiáng)，其產(chǎn)酶能力是糙皮側(cè)耳(一種廣泛報道的高產(chǎn)漆酶真菌)的1.78倍，且其漆酶對苯酚具有很好的去除效果，研究結(jié)果可為處理酚類污染物的優(yōu)質(zhì)真菌漆酶資源開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

糙皮側(cè)耳(P.ostreatus)為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，野生菌株來源于自然樣本：1號自然樣本采集于南昌大學(xué)校內(nèi)苗圃園腐木，2號自然樣本采集于廣西貴港陳年稻草垛堆底土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基：26.0 g馬鈴薯葡萄糖水，20.0 g瓊脂粉，蒸餾水1.0 L，pH自然。以添加0.04%愈創(chuàng)木酚(Guaiacol)的PDA培養(yǎng)基為初篩培養(yǎng)基(G-PDA)，以添加0.04%愈創(chuàng)木酚的馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基(Potato dextrose broth,PDB)為復(fù)篩培養(yǎng)基(G-PDD)。初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基：柚皮粉8.3 g,麩皮16.7 g，磷酸二氫鉀3.0 g，硫酸鎂1.5 g，氯化鈣0.5 g，蒸餾水1.0 L，調(diào)節(jié)pH至5.0。每個250 mL錐形瓶分裝100 mL培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

馬鈴薯葡萄糖水購自青島海博生物技術(shù)有限公司；2’2-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS，98%)、愈創(chuàng)木酚(99%)和苯酚(99%)購自上海麥克林生化科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

全溫?fù)u床(HZQ-B)金壇市圣威實(shí)驗(yàn)儀器廠；可見分光光度計(jì)(UV-9000)上海元析儀器有限公司；酶標(biāo)儀(FlexA-200)杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)漆酶菌株的篩選

糙皮側(cè)耳菌是典型的產(chǎn)漆酶真菌，本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的糙皮側(cè)耳菌株為對照，評估篩選菌株的產(chǎn)漆酶水平。菌株篩選包括平板初篩和搖瓶復(fù)篩兩個步驟，具體如下：

初篩：將采集的腐木和土壤樣本在無菌環(huán)境中打碎，分別接入到裝有5顆小玻璃珠和適量無菌水的三角瓶中，搖床振蕩20 min，用無菌水將混合液稀釋至10-1，10-2和10-3等系列濃度。分別取100 μL各梯度稀釋液涂布于初篩平板上，28 ℃培養(yǎng)，挑取產(chǎn)生紅褐色氧化帶的菌落進(jìn)行重復(fù)分離純化，直至獲得純菌落。將純菌落接種至PDA斜面培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后于4 ℃保藏。

復(fù)篩：采用搖瓶復(fù)篩進(jìn)一步確定菌株的產(chǎn)酶能力，挑取適量菌絲接種至裝有復(fù)篩培養(yǎng)基的錐形瓶中，于28 ℃±2 ℃，120 r·min-1搖瓶培養(yǎng)14 d，每天取樣測定漆酶活力。

漆酶活力測定：參考Xu等人[7]的方法，以ABTS為底物，構(gòu)建3 mL反應(yīng)體系，包括2 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(0.1 mol·L-1，pH 4.5)，0.1 mL酶液和0.9 mL 1 mmol·L-1ABTS。在25 ℃條件下，測定反應(yīng)前3 min內(nèi)OD420的增加量，每分鐘氧化1 μmol ABTS所需要的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.3.2 高產(chǎn)漆酶菌株的鑒定

將高產(chǎn)漆酶菌株接種至PDA平板，于28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落的外觀形態(tài)和菌絲的顯微形態(tài)特征。利用真菌18S rDNA通用引物NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)和NS6(5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，基因提取和測序等工作委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。將測序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)，進(jìn)行BLAST比對分析，獲取相似序列，采用MEGA 6軟件通過Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 真菌漆酶協(xié)同誘導(dǎo)表達(dá)研究

種子液的制備：將菌種從保藏斜面上轉(zhuǎn)接至PDA平板，在恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)至菌絲長滿平板，用無菌打孔器從菌落邊緣取3個菌餅(10 mm)，接種至裝有100 mL液體PDA培養(yǎng)基和1顆攪拌子的錐形瓶中，于28 ℃±2 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)5 d，用磁力攪拌器將菌絲球打散，制成菌絲懸浮液。

誘導(dǎo)產(chǎn)酶：參考Zhuo等人[8]的方法，在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別添加終濃度為0.2 mmol·L-1的芳香化合物(丁香酸、丁香醛、香豆酸、香草醛、對羥基苯甲醛、ABTS、阿魏酸、愈創(chuàng)木酚和2,6-二甲基苯酚)，按照3%的接種量將種子液接種至培養(yǎng)基中，在28 ℃±2 ℃，120 r·min-1條件下，搖瓶培養(yǎng)6 d，于3，4，5，6 d取發(fā)酵液1 mL，測定漆酶活力，探究芳香化合物的誘導(dǎo)作用。在此基礎(chǔ)上，選擇較優(yōu)的芳香化合物(0.2 mmol·L-1)進(jìn)一步探究其與CuSO4(1.0 mmol·L-1)的協(xié)同誘導(dǎo)作用。對照組不添加任何化學(xué)誘導(dǎo)劑。每個處理重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 漆酶去除苯酚的特性研究

漆酶的提純：收集最佳誘導(dǎo)條件下的發(fā)酵液，參考鄒佩[16]的方法，采用90%飽和度硫酸銨鹽析、DEAE-FF陰離子交換層析和Sephadex G-75凝膠層析等步驟從發(fā)酵液中提純漆酶，漆酶的比活力由30.78 U·mg-1提高至188.79 U·mg-1。將提純的漆酶進(jìn)行冷凍干燥，用超純水將漆酶凍干粉配制成80 U·mL-1漆酶液，用于后續(xù)試驗(yàn)。

漆酶催化苯酚實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)確稱量50 mg苯酚晶體，用超純水定容至100 mL，配制成500 mg·L-1的苯酚溶液。建立10 mL反應(yīng)體系：8 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(0.1 mol·L-1，pH 4.5)，1 mL漆酶溶液(加酶量為8 U·mL-1)和1 mL苯酚溶液(終濃度為50 mg·L-1)。設(shè)定苯酚初始濃度范圍為10～60 mg·L-1，酶促反應(yīng)在50 ℃、150 r·min-1水浴搖床中進(jìn)行，在0.25，0.5，1，2，4，6 h取樣測定苯酚的去除率。進(jìn)一步地，采用單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)探究溫度(30 ℃～90 ℃)、體系pH(2.0～7.0)、加酶量(0～25 U·mL-1)和ABTS介體濃度(0～0.6 mmol·L-1)等條件對漆酶去除苯酚的影響。苯酚去除率的計(jì)算公式為：R(%)=(C0-C)/C0×100%，其中，R為苯酚去除率，C0為苯酚初始濃度，C為苯酚剩余濃度。

苯酚濃度的測定：參考Wood等人[17]的方法，并略有改動。取40 μL樣品溶液加入160 μL磷酸鹽緩沖液中(0.1 mol·L-1，pH 8.0)，隨后加入2 μL 4-氨基安替比林(0.1 mol·L-1)溶液，混勻，再加入2 μL鐵氰化鉀(0.2 mol·L-1)溶液，在25 ℃下振勻15 min，利用酶標(biāo)儀測定500 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算苯酚濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用軟件Excel 2016和SPSS 26.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和單因素方差分析，結(jié)果以3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差形式表示。采用軟件Origin 2018繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)漆酶菌株的篩選及鑒定

在G-PDA篩選平板中，菌株分泌胞外漆酶氧化愈創(chuàng)木酚生成紅褐色的醌類物質(zhì)，因此可根據(jù)顯色反應(yīng)高效地篩選出產(chǎn)漆酶菌株[18]。本研究采用平板顯色法共分離到3株產(chǎn)漆酶真菌，其中，菌株NCULAC F1篩自腐木(1號自然樣本)，菌株NCULAC F2和F3篩自土壤(2號自然樣本)。根據(jù)表1的初篩結(jié)果，篩選平板顏色的深淺為：NCULAC F1>糙皮側(cè)耳>NCULAC F3>NCULAC F2，初步判斷NCULAC F1和糙皮側(cè)耳的產(chǎn)漆酶能力較強(qiáng)。NCULAC F1在G-PDA篩選平板上形成深紅褐色的氧化圈，其菌落在PDA平板上呈白色細(xì)絨毛狀，與培養(yǎng)基結(jié)合較牢固，菌絲透明，有橫隔(圖1)。由表1的搖瓶復(fù)篩結(jié)果可知，NCULAC F1的產(chǎn)漆酶能力最強(qiáng)，其漆酶活力達(dá)(0.73±0.02) U·mL-1，顯著高于糙皮側(cè)耳、NCULAC F2和NCULAC F3所產(chǎn)漆酶的活力(P<0.05)。因此，選擇產(chǎn)漆酶潛力較強(qiáng)的NCULAC F1菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 產(chǎn)漆酶菌株的平板初篩和搖瓶復(fù)篩結(jié)果Tab.1 Results of initial screening on plate and re-screening in shake flask of laccase producing strains

圖1 NCULAC F1在G-PDA篩選平板上形成的紅褐色氧化圈(a為平板正面、b為平板背面)、PDA平板上的菌落形態(tài)(c)、光學(xué)顯微鏡下的菌絲形態(tài)(d)Fig.1 Red-brown oxidation circle formed by NCULAC F1 on G-PDA screening plate (a is the front side of the plate,b is the back side of the plate),colony morphology on PDA plate (c),mycelial morphology under optical microscope (d)

測序結(jié)果表明，NCULAC F1菌株的18S rDNA序列片段大小為1318 bp，其序列被提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(No.MW736896.1)。BLAST同源比對結(jié)果顯示，NCULAC F1菌株與粗毛革孔菌C.gallicaHTC(GenBank：KP262346.1)的同源性最高，并在系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)中與C.gallicaHTC、Coriolopsissp.M3 ZM-2012和C.gallicaRLG 7630-SP具有較強(qiáng)的親緣性。該菌株被鑒定為粗毛革孔菌，命名為粗毛革孔菌NCULAC F1，保藏至中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC No.M2021731)。

2.2 粗毛革孔菌漆酶協(xié)同誘導(dǎo)表達(dá)研究

9種芳香化合物對粗毛革孔菌NCULAC F1產(chǎn)漆酶的影響如圖3所示，在搖瓶發(fā)酵4 d后，各組均達(dá)到產(chǎn)酶高峰，而后酶活力逐漸下降，但不同誘導(dǎo)劑對NCULAC F1漆酶活力的影響存在較大差異。在不添加任何誘導(dǎo)劑的對照組中，最大漆酶活力為3.00 U·mL-1，而添加了2,6-二甲基苯酚和對羥基苯甲醛后，獲得的最大漆酶活力分別達(dá)到3.87和3.70 U·mL-1，分別是對照組的1.29和1.23倍。這一結(jié)果表明2,6-二甲基苯酚和對羥基苯甲醛對漆酶的誘導(dǎo)表達(dá)具有積極的影響，但這種誘導(dǎo)作用并不顯著(P>0.05)。另外，丁香酸、丁香醛、香豆酸、香草醛、ABTS和阿魏酸等的誘導(dǎo)效果不明顯，甚至出現(xiàn)了輕微的抑制作用。這種抑制效果可能是由于芳香化合物對菌絲生長的毒害作用大于其對漆酶表達(dá)的誘導(dǎo)作用。因?yàn)榉枷阏T導(dǎo)劑本身具有一定的毒性，真菌分泌漆酶是其自身的一種防御機(jī)制：通過釋放胞外漆酶去降解毒性物質(zhì)，從而減少不良環(huán)境的威脅[19,20]。Souza等人[21]發(fā)現(xiàn)肺形側(cè)耳(Pleurotuspulmonarius)漆酶的最佳芳香誘導(dǎo)劑是阿魏酸和香草醛；而Valle等人[22]發(fā)現(xiàn)姬松茸(Agaricusblazei)漆酶的最佳芳香誘導(dǎo)劑是愈創(chuàng)木酚和香草醛。最適誘導(dǎo)劑的差異可能與菌株的來源、對芳香化合物的毒性耐受性及培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。根據(jù)本研究的結(jié)果，2,6-二甲基苯酚和對羥基苯甲醛是較適合粗毛革孔菌產(chǎn)漆酶的誘導(dǎo)劑，因此選擇這兩種誘導(dǎo)劑進(jìn)一步探討其與銅離子的協(xié)同作用。

圖2 NCULAC F1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of NCULAC F1 strain

t/d注：不同小寫字母表示不同芳香化合物對漆酶的誘導(dǎo)作用之間存在顯著性差異(P<0.05)；選擇誘導(dǎo)作用較強(qiáng)的兩種芳香化合物進(jìn)行顯著性分析。圖3 不同芳香化合物對粗毛革孔菌表達(dá)漆酶的影響Fig.3 Effects of different aromatic compounds on the expression of laccase from C.gallica

銅離子是漆酶分子結(jié)構(gòu)的活性中心，眾多研究已證明添加銅離子可以顯著增強(qiáng)真菌漆酶的表達(dá)水平[10,11]。圖4是硫酸銅單獨(dú)誘導(dǎo)及其分別與兩種芳香化合物復(fù)合誘導(dǎo)下的產(chǎn)酶效果。硫酸銅的誘導(dǎo)作用比2,6-二甲基苯酚和對羥基苯甲醛的誘導(dǎo)作用更顯著(P<0.05)，發(fā)酵4 d后，硫酸銅誘導(dǎo)下的漆酶活力(6.82 U·mL-1)分別是對照組的1.44倍、2,6-二甲基苯酚誘導(dǎo)下的1.20倍和對羥基苯甲醛誘導(dǎo)下的1.49倍。此外，該酶活力也高于Sadhasivam等人[23]報道的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)在1 mmol·L-1CuSO4誘導(dǎo)下的漆酶活力(4.36 U·mL-1)。Cu2+對漆酶表達(dá)的強(qiáng)烈誘導(dǎo)效果可能與其在漆酶基因轉(zhuǎn)錄中不可或缺的作用有關(guān)[24]。將硫酸銅與芳香化合物同時添加到培養(yǎng)基后，發(fā)現(xiàn)硫酸銅與2-6-二甲基苯酚對粗毛革孔菌漆酶的表達(dá)具有顯著的協(xié)同誘導(dǎo)效果(P<0.05)，其最大酶活力在搖瓶發(fā)酵5 d達(dá)到11.29 U·mL-1，比對照組、單一2-6-二甲基苯酚和單一硫酸銅誘導(dǎo)下的酶活分別提高了138.69%，98.14%和65.66%。相比之下，銅離子與對羥基苯甲醛的協(xié)同誘導(dǎo)作用不顯著(P>0.05)，培養(yǎng)4 d的最大酶活力僅為5.94 U·mL-1。

t/d注：不同小寫字母表示不同誘導(dǎo)劑組合對漆酶的誘導(dǎo)作用之間存在顯著性差異(P<0.05)。圖4 芳香化合物與硫酸銅對粗毛革孔菌漆酶表達(dá)的協(xié)同誘導(dǎo)作用Fig.4 Synergistic inducing effect of aromatic compounds and copper sulfate on laccase expression of C.gallica

2.3 粗毛革孔菌漆酶去除苯酚特性

2.3.1 漆酶催化苯酚動力學(xué)研究

為探究粗毛革孔菌漆酶對苯酚的去除效果，以苯酚去除率為考察指標(biāo)，在50 ℃、pH 4.5條件下，采用經(jīng)提純制備的漆酶液(8 U·mL-1)催化不同濃度苯酚(10～60 mg·L-1)。從圖5可看出，在酶促反應(yīng)初始的1 h內(nèi)，苯酚的去除率隨著時間的增加而快速上升，并且低濃度苯酚的去除率明顯大于高濃度苯酚，1 h時10 mg·L-1和20 mg·L-1苯酚的去除率分別達(dá)96.17%和94.45%，而30～60 mg·L-1苯酚的去除率只有83%～88%。在6 h后，10～60 mg·L-1苯酚的去除率均達(dá)到95%以上，這表明漆酶的催化能力較強(qiáng)，即使在相對高的底物濃度下，也能達(dá)到較好的去除效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果比Liu等人[25]利用云芝漆酶去除苯酚的效果(12 h內(nèi)的苯酚去除率為78%)更佳。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法確定該酶促反應(yīng)的Michaelis-Menten動力學(xué)參數(shù)，計(jì)算得米氏常數(shù)(km)為52.45 mg·L-1，最大反應(yīng)速率(Vmax)為181.82 mg·L-1·h-1(圖6)。Lineweaver-Burk方程的線性擬合度較好，R2為0.9843，表明粗毛革孔菌漆酶催化去除苯酚的過程遵循Michaelis-Menten動力學(xué)模型。

t/h圖5 漆酶對系列濃度苯酚的去除效果Fig.5 Removal effect of phenol with series concentrations by laccase

2.3.2 溫度和pH對漆酶催化苯酚的影響

由上述漆酶對系列濃度苯酚的去除效果(圖5)可知，去除過程主要發(fā)生在催化反應(yīng)的前1 h內(nèi)，為探究不同催化條件對苯酚去除作用的影響，選擇0.5和1.0 h兩個作用時間點(diǎn)進(jìn)行考察。溫度和pH是酶發(fā)揮催化作用的關(guān)鍵因素，在一系列溫度(30 ℃～90 ℃)和pH(2.0～7.0)條件下，研究了漆酶對50 mg·L-1苯酚的去除效果。如圖7所示，在30～70 ℃范圍內(nèi)，苯酚去除率隨著溫度升高而逐漸增加，并在70 ℃條件下達(dá)到最大值，在1.0 h時的去除率達(dá)92.82%，顯著高于60 ℃和80 ℃下的去除率(P<0.05)。當(dāng)溫度升至90 ℃，苯酚去除率顯著下降(P<0.05)，在0.5 h時僅為35.96%，而當(dāng)時間延長至1.0 h時，去除率僅增加了10.98%，說明高溫導(dǎo)致漆酶發(fā)生了熱失活。Songulashvili等人[26]發(fā)現(xiàn)粗毛革孔菌(C.gallica1184)漆酶的活性在70 ℃下最高，與本研究獲得的最佳催化溫度一致。漆酶在50 ℃～80 ℃范圍內(nèi)對苯酚均具有較好的催化效果，表明粗毛革孔菌漆酶具有良好的耐熱性，可適應(yīng)工業(yè)催化的中高溫環(huán)境。

S-1/(mg·L-1)圖6 漆酶去除苯酚的酶促動力學(xué)模型Fig.6 Enzymatic kinetic model of phenol removal by laccase

T/℃注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖7 溫度對漆酶去除苯酚的影響Fig.7 Effect of temperature on phenol removal by laccase

真菌漆酶多為酸性蛋白，一般在偏酸性范圍內(nèi)具有較高的活性[27]。因此，在酸性范圍內(nèi)(pH 2.0～7.0)探究了不同pH對粗毛革孔菌漆酶去除苯酚的影響，結(jié)果如圖8所示。在pH 2.0～4.0范圍內(nèi)，苯酚的去除效果不理想，0.5 h時去除率均低于30%。特別是在pH 2.0條件下，苯酚的去除率在0.5和1.0 h分別僅為16.85%和18.40%，說明低pH易引起漆酶失活，導(dǎo)致酶促反應(yīng)受到抑制。而在pH 4.5～6.0范圍內(nèi)，漆酶對苯酚的去除效果隨著pH的增加而顯著提升(P<0.05)，1.0 h時苯酚去除率均超過80%。其中，苯酚去除率在pH 6.0條件下獲得最高，1.0 h時達(dá)到97.37%。當(dāng)pH繼續(xù)增至7.0時，苯酚去除率下降至82.02%。本研究的結(jié)果表明，粗毛革孔菌漆酶在弱酸環(huán)境中(pH 4.5～6.5)對苯酚的催化效果較高，最適pH是6.0。劉紅艷等人[28]發(fā)現(xiàn)，在pH 5.5～7.0的范圍內(nèi)，云芝漆酶對己烯雌酚的催化效果較好，且在pH 6.0時效果最好，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

pH注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖8 pH對漆酶去除苯酚的影響Fig.8 Effect of pH on phenol removal by laccase

2.3.3 加酶量對漆酶催化苯酚的影響

當(dāng)環(huán)境因素和底物濃度一定時，酶促反應(yīng)速率取決于酶的濃度。在最佳酶促溫度70 ℃和pH 6.0的條件下，進(jìn)一步研究了漆酶加酶量(0，1，2.5，5，10，20，25 U·mL-1)對50 mg·L-1苯酚去除效果的影響，結(jié)果如圖9所示。當(dāng)反應(yīng)體系中未添加漆酶(即加酶量為0 U·mL-1)時，苯酚濃度無變化，表明苯酚的去除是由漆酶催化導(dǎo)致的。當(dāng)漆酶加酶量由1 U·mL-1增加到5 U·mL-1時，苯酚去除率顯著增加(P<0.05)，0.5 h時，5 U·mL-1漆酶對苯酚的去除率即達(dá)到93.19%，分別是1 U·mL-1和2.5 U·mL-1漆酶處理下的1.96倍和1.23倍。當(dāng)漆酶加酶量從5 U·mL-1繼續(xù)增加至25 U·mL-1時，苯酚去除率未隨著加酶量增大而明顯提高(P>0.05)，表明5 U·mL-1是漆酶催化50 mg·L-1苯酚的最優(yōu)加酶量。在相似的實(shí)驗(yàn)條件下，Tarasi等人[29]采用5 U·mL-1云芝漆酶處理苯酚40 min，苯酚去除率也僅達(dá)到52%。與之相比，本研究中的粗毛革孔菌漆酶對苯酚的去除效果較好，表明其具有較強(qiáng)的催化效率和應(yīng)用潛力。

加酶量/(U·mL-1)注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖9 漆酶加酶量對苯酚去除的影響Fig.9 Effect of laccase dosage on phenol removal

2.3.4 介體對漆酶催化苯酚的影響

由于漆酶的氧化還原電位較低，難以催化氧化還原電位較高的底物，為了提高漆酶的催化效果，常常在反應(yīng)體系中添加一些小分子介體物質(zhì)，這些氧化還原介體可起類似“橋梁”的作用，促進(jìn)酶與底物之間的電子轉(zhuǎn)移，從而提高酶促反應(yīng)效率[30]。根據(jù)最新的報道[31,32]，漆酶介體系統(tǒng)(LMS)的顯著效果已在處理抗生素、染料等多種難去除污染物的研究中得到證實(shí)。LMS作用效果與介體類型和濃度有關(guān)，劉紅艷等人[28]發(fā)現(xiàn)在5種介體中，ABTS對漆酶去除己烯雌酚的作用效果最好，且經(jīng)優(yōu)化設(shè)計(jì)后，獲得最佳ABTS作用濃度為1.52 mmol·L-1。為了提高漆酶催化苯酚的效果，本研究選擇應(yīng)用最廣泛的ABTS作為酶促反應(yīng)的介體，在最佳催化條件下，研究不同ABTS濃度(0～0.6 mmol·L-1)對漆酶去除苯酚的影響。從圖10中可看出，隨著ABTS濃度提高，在反應(yīng)10 min內(nèi)，漆酶對苯酚的催化效率顯著提升(P<0.05)。在0.6 mmol·L-1ABTS的協(xié)助下，苯酚去除率在2.5 min內(nèi)約為95%，在10 min內(nèi)達(dá)到100%，而對照組(0 mmol·L-1ABTS)在10 min時苯酚去除率僅為58.54%。周鑫等人[33]也發(fā)現(xiàn)ABTS可顯著提高毛栓菌27～1漆酶對丁香酸的催化效果。這些結(jié)果表明ABTS介體對漆酶催化作用的影響在一定濃度范圍內(nèi)具有明顯的濃度依賴性。

t/min注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖10 ABTS對漆酶去除苯酚的影響Fig.10 Effect of ABTS on phenol removal by laccase

3 結(jié)論

本研究從自然樣本中篩選到一株高產(chǎn)漆酶的白腐真菌NCULAC F1，經(jīng)鑒定為粗毛革孔菌(C.gallica)。粗毛革孔菌生產(chǎn)漆酶的最佳誘導(dǎo)劑組合為2,6-二甲基苯酚和硫酸銅，在協(xié)同誘導(dǎo)條件下，搖瓶發(fā)酵5 d漆酶活力達(dá)到11.29 U·mL-1，比對照組的漆酶活力提高了138.69%。粗毛革孔菌漆酶去除苯酚的過程遵循Michaelis-Menten模型，其動力學(xué)參數(shù)km和Vmax分別為52.45 mg·L-1和181.82 mg·L-1·h-1。苯酚去除效果與催化溫度、pH、加酶量和介體濃度等因素有關(guān)，最佳催化條件為：溫度70 ℃，pH 6.0，加酶量5 U·mL-1，ABTS介體濃度0.6 mmol·L-1，在此條件下，在10 min內(nèi)苯酚去除率達(dá)100%。本研究的結(jié)果表明，粗毛革孔菌漆酶對水溶液中的苯酚具有良好的去除效果。這一研究初步探明了粗毛革孔菌來源的漆酶催化特性及其應(yīng)用潛力，為促進(jìn)利用真菌漆酶高效處理含酚類有機(jī)物工業(yè)廢水提供理論參考。