一種新型抗菌肽對凡納濱對蝦生長、免疫和消化性能的影響

于志文，郭 冉，韓佳樂，何立彬，高佳朋

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066000)

抗菌肽被認(rèn)為是最適合的抗生素替代物[1]?？咕模置拗鞣烙模蔷哂锌咕匦缘囊活愋》肿佣嚯?，被認(rèn)為是機(jī)體抵抗病原入侵的“第一道屏障”?？咕牡膩碓捶浅V，在動物、植物、微生物中都有發(fā)現(xiàn)。此外，抗菌肽具有廣譜抗菌性，對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌有很好的抑制作用?？咕脑谏矬w內(nèi)還可以充當(dāng)免疫效應(yīng)分子調(diào)節(jié)機(jī)體的抗炎和促炎作用，加快傷口的愈合速度，參與生物體的細(xì)胞代謝等重要過程[2]。凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的抗病性試驗也證實，添加抗菌肽后，感染了對蝦白斑病毒和弧菌的對蝦成活率顯著提高[3]。

第益肽為一種新型抗菌肽，由地衣芽孢桿菌發(fā)酵而來，目前已應(yīng)用在仔豬、肉豬和禽類的養(yǎng)殖中，可以有效抑制革蘭氏陰性及陽性致病菌，提高動物免疫力、改善動物腸道健康、提升動物生產(chǎn)繁殖性能，是一款新型、綠色、環(huán)保的替抗飼料添加劑。目前，第益肽在凡納濱對蝦的養(yǎng)殖中尚未見報道。鑒于此，本試驗將第益肽添加到凡納濱對蝦飼料中，觀察其對凡納濱對蝦生長、免疫和消化性能的影響。

1 試驗方法

1.1 試驗飼料

以魚粉、豆粕為主要蛋白源，魚油、玉米油為脂肪源，根據(jù)飼料配方(見表1)制作飼料。試驗前將所需原料進(jìn)行粉碎。經(jīng)粉碎后的原料經(jīng)粉過80目篩，之后將經(jīng)過處理的各種原料按照飼料配方中的比例混勻。A組為基礎(chǔ)飼料組(不含抗菌肽)，E組添加0.03%抗菌肽(第益肽)。用飼料擠壓膨化機(jī)將混勻后的A、E兩組原料擠壓膨化成粒徑1.55 mm的顆粒飼料。制作成功的顆粒飼料先放入烘箱中熟化(60 ℃，30 min)，隨后自然風(fēng)干，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗設(shè)計

將購買來的蝦苗放入暫養(yǎng)桶中，進(jìn)行為期兩周的暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間投喂苗場購買的成品商業(yè)蝦飼料。本試驗共分兩組，對照組記為A，添加0.03%第益肽的記為E，每組設(shè)置3個平行，每個平行放蝦苗40尾。在正式試驗開始前將蝦苗空腹24 h，隨后挑選初始體重為(0.40±0.01)g，體質(zhì)健康，大小勻稱的蝦苗進(jìn)行為期10周的飼養(yǎng)試驗。

表1 飼料組成和營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

蝦苗飼養(yǎng)在大小為(60 cm×40 cm×50 cm)的魚缸中，每缸放苗40尾。養(yǎng)殖用水為天然海水，鹽度為(30±1)‰，用于養(yǎng)殖的海水先用二氧化氯消毒，靜置，經(jīng)過砂濾池過濾方可使用。每天投喂三次，投喂30 min后觀察飼料是否剩余，投喂量控制在蝦體重的6%～10%。每天換水一次，換水量為1/3。每兩周稱重一次，及時調(diào)整投喂量。在整個飼養(yǎng)期間不間斷供氧，確保水中溶解氧含量>5.5 mg/L，控制水溫在(28±1)℃，pH值在7.5～8.0，氨氮<0.2 mg/L，亞硝酸鹽含量<0.2 mg/L，鹽度在(30±1)‰。

1.4 樣品采集

試驗結(jié)束后，空腹24 h，撈取每缸中的蝦記錄總數(shù)、總重。隨機(jī)取4尾蝦，擦干其體表水分，于烘箱烘干至恒重，轉(zhuǎn)入干燥器中保存，用于全蝦體成分的測定。另取9尾蝦置于冰托盤中，小心取出肝胰腺放入液氮罐冷凍，隨后轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冷凍冰箱中保存，用于肝胰腺中各項指標(biāo)的測定。將蝦體剩余部分完整剝離出肌肉放入烘箱中烘至恒重，轉(zhuǎn)入干燥器中保存，用于肌肉成分含量的測定。

1.5 待測指標(biāo)及測定方法

飼料、全蝦和肌肉的水分含量采用烘干減重法(105 ℃)測定，粗灰分含量采用馬弗爐灰化法測定，粗脂肪含量采用索氏抽提法測定，粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定。堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、胰蛋白酶(TPS)、脂肪酶(LPS)使用南京建成生物科技有限公司的試劑盒測定。

1.6 計算公式

增重率(WGR，%)=100×(Wt-W0)/W0；

存活率(SR，%/d)=100×Nt/N0；

飼料系數(shù)(FCR)=F/(Wt-W0)；

肝體比(VSI，%)=100×Wh/W；

特定生長率(SGR，%/d)=100×(lnWt-lnW0)。

上式中：Wt為蝦終末體重，g；W0為蝦初始體重，g；Nt為試驗終末蝦尾數(shù)；N0為初始蝦尾數(shù)；Wh為蝦的肝胰腺重，g；W為蝦體重，g；F為飼料用量，g。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本試驗數(shù)據(jù)用SPSS26.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<0.05則表示各組的結(jié)果存在顯著性差異，而后用Duncan氏法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 第益肽對凡納濱對蝦生長性能的影響

各組對蝦的增重率、存活率、飼料系數(shù)、肝體比、特定生長率各組間均無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2 第益肽對凡納濱對蝦生長性能的影響

2.2 第益肽對凡納濱對蝦體成分的影響

全蝦和肌肉的水分含量兩組間均無顯著性差異(P>0.05)；粗蛋白質(zhì)含量A組顯著低于E(P<0.05)；粗灰分含量A組顯著高于E組(P<0.05)；全蝦和肌肉中的粗脂肪含量兩組無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

表3 第益肽對凡納濱對蝦體成分的影響

2.3 第益肽對凡納賓對蝦肝胰腺免疫指標(biāo)的影響

堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和丙二醛含量A組高于E組(P<0.05)；超氧化物歧化酶兩組間無顯著性差異(P>0.05)；總抗氧化能力E組高于A組。(P<0.05)。見表4。

2.4 第益肽對凡納濱對蝦肝胰腺代謝酶和消化酶活性的影響

E組的胰蛋白酶和脂肪酶活性顯著高于A組(P<0.05)。見表5。

表4 第益肽對凡納濱對蝦肝胰腺免疫指標(biāo)的影響

表5 第益肽對凡納濱對蝦消化酶活性的影響

3 討論

3.1 第益肽對凡納濱對蝦生長性能和體成分的影響

抗菌肽是一種在大自然中大量存在的，具有獨特生物學(xué)活性的多肽類物質(zhì)。能通過膜透化作用直接與靶細(xì)胞結(jié)合或與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)靶目標(biāo)相互作用干擾其代謝進(jìn)而殺死目標(biāo)，對細(xì)菌、真菌和病毒均有很好的抑制效果，被認(rèn)為是最適合的抗生素替代物[1]。覃志彪等[4]的研究表明，飼料中添加不同比例的抗菌肽對凡納濱對蝦的生長性能和體成分會產(chǎn)生不同的影響，但當(dāng)添加量小于3.0 mL/kg，增重率則無顯著性差異；當(dāng)超過5.0 mL/kg，粗脂肪含量顯著降低；超過8.0 mL/kg時，顯著提高肌肉蛋白質(zhì)含量，對灰分含量無顯著影響。石廣舉等[5]發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.01%的NT-6抗菌脂肽對凡納濱對蝦生長性能有顯著促進(jìn)作用。本試驗的結(jié)果表明，添加第益肽對凡納濱對蝦的生長性能并未造成顯著性影響，但肝體比略有升高，說明第益肽對肝臟有一定的保護(hù)作用；對蝦的粗蛋白含量也顯著提高，由此可以看出抗菌肽能提高對蝦的蛋白質(zhì)利用率；而添加抗菌肽對凡納濱對蝦生長性能影響不顯著的原因可能是當(dāng)飼料的營養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)能完全滿足凡納濱對蝦的生長需求時，添加劑的促生長效果完全可能被其他因子所掩蓋[6]。

3.2 第益肽對凡納賓對蝦免疫性能的影響

凡納濱對蝦屬低等無脊椎動物，以非特異性免疫為主，一般以血淋巴和肝胰腺中相關(guān)免疫酶活性和抗氧化能力來評價凡納濱對蝦的免疫功能。堿性磷酸酶和酸性磷酸酶是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，在對蝦的非特性免疫過程中有重要作用[7-8]。已有研究表明，在飼料中添加適量的抗菌肽可顯著提高凡納濱對蝦血清中堿性磷酸酶的活性[9-10]。在本試驗中，添加抗菌肽后對蝦的兩種磷酸酶活性反而偏低，與前人的研究結(jié)果并不一致。這兩種酶除了是溶酶體的標(biāo)志在亦在ADP形成ATP過程中有重要作用[7-8]。筆者發(fā)現(xiàn)，在養(yǎng)殖動物受到脅迫或處于應(yīng)激狀態(tài)時，堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性往往出現(xiàn)亦異常升高的現(xiàn)象，如王曉雯等[9]、劉慧玲等[10]的研究中發(fā)現(xiàn)，鹽度脅迫、養(yǎng)殖密度的變化均會導(dǎo)致受試動物體內(nèi)磷酸酶活性發(fā)生改變，往往表現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的效果，當(dāng)生物體不能適應(yīng)環(huán)境的變化就會死亡。因此，本試驗中對照組磷酸酶活性偏高可能是輕度應(yīng)激使機(jī)體大量合成ATP造成，而添加抗菌肽可以增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，減輕對蝦的應(yīng)激狀態(tài)，但真正原因還有待深入研究。

超氧化物歧化酶是凡納濱對蝦體內(nèi)重要的抗氧化酶，總抗氧化能力在整體上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。有研究表明，飼料中添加適量的抗菌肽可顯著提高凡納濱對蝦的總抗氧化能力[11]和超氧化物歧化酶活性[12]。丙二醛是凡納濱對蝦體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，可以間接反應(yīng)對蝦肝臟的受損傷情況，常與超氧化物歧化酶一起作為評價機(jī)體肝臟健康與否的指標(biāo)。王自蕊等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，在湘云鯽的飼料中添加0.015%和0.02%的天蠶素抗菌肽可顯著降低血清中丙二醛含量；王一娟等[14]也證實抗菌肽具有降低丙二醛濃度的作用。本試驗的結(jié)果表明，抗菌肽能顯著提高凡納濱對蝦的總抗氧化能力并降低丙二醛含量，這與前人的研究相似。而超氧化物歧化酶性未表現(xiàn)顯著性差異，但對照組偏高。總抗氧化能力高說明對蝦的免疫功能較強(qiáng)，而丙二醛含量升高表明體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多，肝臟受到脅迫，這一般會導(dǎo)致超氧化物歧化酶活性上升。抗氧化酶系是一個十分復(fù)雜的系統(tǒng)，各種酶活性在生物體內(nèi)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但毫無疑問的是，添加第益肽可以提高對蝦的免疫性能。

3.3 第益肽對凡納濱對蝦消化酶活性的影響

肝胰腺是凡納濱對蝦體內(nèi)重要的器官，測定其中胰蛋白酶和脂肪酶的活性可以反映其消化能力的高低。但關(guān)于抗菌肽對凡納濱對蝦消化酶活性影響的研究并不多，翟少偉等[15]發(fā)現(xiàn)抗菌脂肽可顯著提高中華稚鱉脂肪酶的活性；史慶超等[16]也證實，在吉富羅非魚的飼料中添加不同比例的抗菌肽，可以顯著提高腸道脂肪酶活性。本試驗的結(jié)果表明，抗菌肽可以顯著提高凡納濱對蝦肝胰腺蛋白酶和脂肪酶的活性；抗菌肽在生物體內(nèi)可以有效消滅病原微生物，同時又屬于小肽類物質(zhì)，可以有效保護(hù)對蝦的肝胰腺，其自身作為小肽類物質(zhì)便于消化吸收，對消化酶活性有較明顯的提高作用。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，飼料中添加0.03%的第益肽對凡納濱對蝦生長性能的影響并不顯著，但可以顯著提高對蝦的免疫和消化性能，有效保護(hù)對蝦的肝胰腺。