三種水質(zhì)調(diào)控方式對(duì)春秋季刺參池塘水細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響

張東升，周 瑋

三種水質(zhì)調(diào)控方式對(duì)春秋季刺參池塘水細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響

張東升1,2，周 瑋1※

（1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，大連 116023；2. 大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023）

通過(guò)16SrRNA高通量測(cè)序技術(shù)，以自然納潮和微孔曝氣兩種水質(zhì)調(diào)控方式池塘為對(duì)照，研究了養(yǎng)水機(jī)水質(zhì)調(diào)控方式對(duì)春秋季刺參養(yǎng)殖池塘水細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：各池塘水前10優(yōu)勢(shì)門(mén)和前3優(yōu)勢(shì)綱組成基本一致，但優(yōu)勢(shì)屬組成差異較大；試驗(yàn)后期（11月份），養(yǎng)水機(jī)池塘水與自然納潮池塘水和微孔曝氣池塘水中某些種群豐度具有明顯的差異，養(yǎng)水機(jī)顯著提高了池塘水乳酸菌目的豐度（lefse分析LDA Score＞4），分別提高了251和343倍，顯著降低了交替假單胞菌科和屬的豐度（-test檢驗(yàn)），各池塘水優(yōu)勢(shì)功能菌為化能異養(yǎng)菌12.78%～19.65%和好氧化能異養(yǎng)菌0.96%～4.97%，各功能菌豐度均值差異不顯著，但試驗(yàn)后期養(yǎng)水機(jī)池塘水發(fā)酵菌和植物致病菌豐度增加明顯，比自然納潮池塘和微孔曝氣池塘分別提高了32、50和159、216倍；硝酸鹽還原菌豐度降低明顯，養(yǎng)水機(jī)池塘水-多樣性最高，養(yǎng)水機(jī)顯著提高了池塘水乳酸菌和植物致病菌豐度，提高了細(xì)菌種群的-多樣性，前者抑制池塘大型藻生長(zhǎng)，后者有益于水質(zhì)穩(wěn)定。

水產(chǎn)養(yǎng)殖；群落組成；水質(zhì)調(diào)控；養(yǎng)水機(jī)；功能菌；FAPRTAX；刺參池塘

0 引 言

細(xì)菌菌群組成和功能特點(diǎn)與環(huán)境息息相關(guān)，不同環(huán)境其細(xì)菌菌群組成和功能特點(diǎn)不同[1]，因此測(cè)定環(huán)境中細(xì)菌菌群組成和功能特點(diǎn)，不僅能指示環(huán)境好壞及環(huán)境物質(zhì)組成，也能為矯正環(huán)境提供理論和技術(shù)指導(dǎo)[2]，因此人們?cè)诟纳瞥靥痢⒑?、河流生態(tài)時(shí)，往往測(cè)定水質(zhì)或沉積物中的細(xì)菌菌群組成和功能特點(diǎn)以及他們與環(huán)境中物理化學(xué)及生物參數(shù)的關(guān)系[3-9]，以期了解不同水質(zhì)改良技術(shù)對(duì)細(xì)菌菌群、物理化學(xué)參數(shù)的影響，探討細(xì)菌菌群與環(huán)境因子的關(guān)系，為以后的水質(zhì)調(diào)控提供技術(shù)指導(dǎo)。

近30年遼寧、山東地區(qū)刺參養(yǎng)殖發(fā)展迅速，而隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)，刺參疾病頻發(fā)，主要原因在于池塘環(huán)境不佳，池塘底部沉積大量有機(jī)物，且在2、6月份池塘形成的溫鹽躍層[10-11]，加據(jù)了池塘環(huán)境惡化，導(dǎo)致刺參疾病甚至死亡，降低了漁民收入，因此，刺參池塘水質(zhì)調(diào)控勢(shì)在必行[10]。

為了解引起刺參疾病的主要細(xì)菌種群，不少科研工作者對(duì)刺參養(yǎng)殖池塘細(xì)菌菌群進(jìn)行了研究[12-14]，為預(yù)防刺參疾病提供技術(shù)支撐，然而水質(zhì)調(diào)控對(duì)刺參池塘微生物菌群和功能的影響報(bào)道較少。目前刺參養(yǎng)殖池塘的主要水質(zhì)物理調(diào)控方式為自然納潮和微孔曝氣，前者為刺參養(yǎng)殖池塘普遍采用的一種方式，后者是部分池塘采用的方式，后者在改良水質(zhì)方面比前者有優(yōu)勢(shì)，但其設(shè)備通氣孔易堵塞，難以清理，費(fèi)用較高，同時(shí)2種水質(zhì)調(diào)控方式池塘均存在水體分層和大型藻生長(zhǎng)旺盛現(xiàn)象，尤其夏、秋季，池塘生長(zhǎng)的大型藻纏繞刺參，致其死亡；大型藻在秋季死亡后，嚴(yán)重污染池塘，為更好地解決上述問(wèn)題，本課題組研制了一種新型水質(zhì)改良機(jī)-養(yǎng)水機(jī)，為探討?zhàn)B水機(jī)對(duì)池塘水質(zhì)改良效果，王祖峰[10]報(bào)道了養(yǎng)水機(jī)對(duì)池塘水體分層及水質(zhì)的影響，孫廣偉等[11]報(bào)道了養(yǎng)水機(jī)對(duì)池塘生產(chǎn)力的影響，均表明養(yǎng)水機(jī)對(duì)池塘2、6月份的池塘水分層具有明顯的消除作用；林青、張東升等[15-16]報(bào)道了養(yǎng)水機(jī)對(duì)池塘浮游植物和水化指標(biāo)及異養(yǎng)菌豐度的影響。本文報(bào)道了養(yǎng)水機(jī)對(duì)刺參池塘水細(xì)菌菌群、功能和水質(zhì)的影響，不僅為養(yǎng)水機(jī)對(duì)刺參池塘水質(zhì)調(diào)控機(jī)理提供技術(shù)支撐，同時(shí)探討了細(xì)菌種群變化與水質(zhì)的關(guān)系，為不同細(xì)菌種群的主要功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為是否可用細(xì)菌菌群變化預(yù)示調(diào)控效果奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)水機(jī)結(jié)構(gòu)和使用原理

養(yǎng)水機(jī)是一種針對(duì)刺參生長(zhǎng)特點(diǎn)、能打破池塘水體溫、鹽躍層的新型水質(zhì)調(diào)控設(shè)備（圖1），該設(shè)備主要分為進(jìn)水組件、生物包、水循環(huán)動(dòng)力裝置和水輸出噴頭４部分，其中生物包直徑1 m、高度0.3 m，內(nèi)含生物濾料（活性炭），進(jìn)水組件和微生物添加管隨池水的高度變化而變化。該設(shè)備結(jié)合物理和生物水質(zhì)調(diào)控技術(shù)，在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出肥水、抑草、活水、節(jié)能等多方面優(yōu)點(diǎn)[7-10]。養(yǎng)水機(jī)在工作時(shí)通過(guò)位于生物包內(nèi)的動(dòng)力裝置和進(jìn)水組件抽取表層溶氧豐富的水，進(jìn)入生物包進(jìn)行過(guò)濾，然后由位于生物包外面的出水噴頭將水朝向與養(yǎng)水機(jī)位置相對(duì)的池塘方向噴射出去，實(shí)現(xiàn)池塘水在垂直方向快速交換，打破溫、鹽躍層造成池塘底部缺氧問(wèn)題。

圖1 養(yǎng)水機(jī)結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 試驗(yàn)池塘及刺參養(yǎng)殖管理

本試驗(yàn)在大連莊河寶發(fā)海珍品有限公司刺參養(yǎng)殖池塘進(jìn)行，所選池塘長(zhǎng)約600 m，寬85 m，水深1.2～2.0 m，選擇9口大小、形狀一致的相鄰池塘進(jìn)行試驗(yàn)，3口安裝了養(yǎng)水機(jī)的池塘作為試驗(yàn)組，其余6口池塘均為對(duì)照組，其中3口為微孔曝氣對(duì)照組，3口為自然納潮對(duì)照組，上述各池塘已運(yùn)轉(zhuǎn)了2 a。

養(yǎng)水機(jī)試驗(yàn)組，在池塘最深處放置一臺(tái)功率為750 Ｗ的養(yǎng)水機(jī)，3－11月份每日21:00－次日9:00工作，連續(xù)工作12 h（共消耗9 kW·h），冬季（12、1、2月）工作1 h；微孔曝氣對(duì)照組，在池塘底部鋪設(shè)１套微孔曝氣系統(tǒng)，由空壓機(jī)（1.5 kW·h/m2，每天用電量至少15.2 kW·h）、總供氣管和微孔曝氣盤(pán)組成，池塘缺氧時(shí)，開(kāi)始工作）這是微孔曝氣裝置標(biāo)準(zhǔn)使用方法）；自然納潮對(duì)照組，除了與養(yǎng)水機(jī)試驗(yàn)組和微孔曝氣對(duì)照組在每月大潮期間同時(shí)更換池塘水外，無(wú)其他調(diào)水裝置。試驗(yàn)期間，各池塘放養(yǎng)的刺參規(guī)格（2.5 g/個(gè)）、密度（15個(gè)/m2）相同，不投餌、不投藥，統(tǒng)一管理（包括所有池塘均使用微生態(tài)制劑的時(shí)間和劑量等）。

試驗(yàn)周期為9個(gè)月，試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)間是從每年的3月開(kāi)始，至當(dāng)年的11月結(jié)束，投苗時(shí)間分別為春季和秋季。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水樣采集

2017年，每月于大潮前3～5d的上午采集水樣1次，采用5L顛倒式采水器采集各池塘進(jìn)水口、出水口、中心位點(diǎn)的表層（距水面約5cm）、中層、底層水（距池底約5cm），然后各點(diǎn)各層水樣在現(xiàn)場(chǎng)等量混合后帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 池塘水理化指標(biāo)測(cè)定

各個(gè)采樣點(diǎn)，使用YSI多參數(shù)水質(zhì)分析儀（Pro Plus，美國(guó)）即時(shí)測(cè)定水的各層水溫、鹽度、溶解氧。將采回的混合水樣，立即采用GB/T 12763.4?2007中的次溴酸鹽氧化法、萘乙二胺分光光度法、鋅隔還原法、磷鉬藍(lán)分光光度法、過(guò)硫酸鉀氧化法測(cè)定總銨氮（Total Ammonia Nitrogen，TAN）、亞硝酸態(tài)氮（NO2--N）、硝酸態(tài)氮（NO3--N）、活性磷酸鹽（PO43--P）、總磷（Total Phosphorus，TP）和總氮（Total Nitrogen，TN）含量[17]。

懸浮物的測(cè)定采用GB/T 11901-1989標(biāo)準(zhǔn)中[18]的重量法，葉綠素的測(cè)定采用HJ-897-2017標(biāo)準(zhǔn)[19]中的分光光度法。

1.3.3 水樣中細(xì)菌菌群及功能菌的測(cè)定

除前言中表明的目的以外，為了解養(yǎng)水機(jī)對(duì)刺參生長(zhǎng)期菌群的影響，本次試驗(yàn)僅測(cè)定了刺參生長(zhǎng)期3、5、11月份的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，將1.3.1中采集的水樣，用0.22m無(wú)菌醋酸纖維濾膜過(guò)濾，濾膜裝入無(wú)菌自封袋中，養(yǎng)水機(jī)、自然納潮、微孔曝氣3個(gè)刺參池塘水樣分別標(biāo)記為Wn、Wt、Ws，采樣的月份用羅馬數(shù)字表示，然后立即放入?80 ℃液氮中冷凍1 h后，用干冰冷凍運(yùn)送至北京諾禾致源科技股份有限公司，該公司采用Illumina NovaSeq 16SrRNA高通量測(cè)序技術(shù)，測(cè)定細(xì)菌的V3-V4區(qū)，根據(jù)所擴(kuò)增的16S區(qū)域特點(diǎn)，構(gòu)建小片段文庫(kù)，基于Illumina NovaSeq 測(cè)序平臺(tái)對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序（Paired_End）。經(jīng)過(guò)Reads拼接過(guò)濾，OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類(lèi)，進(jìn)行物種注釋及豐度分析；通過(guò)-和-多樣性分析，揭示出樣本中物種組成和樣本間群落結(jié)構(gòu)的差異；采用PAPROTAK和PICRUSt軟件對(duì)細(xì)菌功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過(guò)wilcox和-test對(duì)不同池塘同一功能菌進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 水質(zhì)調(diào)控方式對(duì)池塘水質(zhì)的影響

池塘水理化參數(shù)見(jiàn)表1，水溫變化在?3.0～27.9 ℃之間，8月份最高，12月份最低；溶氧變化在0.3～13.9 mg/L之間，12、1－3月最高，7月最低；鹽度變化在29.9‰～36.3‰之間，1－3月份最高，8月份最低；銨態(tài)氮、亞硝酸、硝酸鹽含量分別變化在0.1～0.56、0.005～0.023、0.19～0.65 mg/L之間，最高均出現(xiàn)在9月份，最低分別出現(xiàn)在2、4、6月份；PO43--P含量變化在0.018～0.048 mg/L之間，最高出現(xiàn)在9月份，最低出現(xiàn)在1月份，TN變化在0.540～1.878 mg/L之間，最高值出現(xiàn)在8-10月份，最低值出現(xiàn)在1月份；TP變化在0.022～0.330 mg/L之間，最高值出現(xiàn)在7－9月份；懸浮物變化在4.318～20.938 mg/L間，最高值出現(xiàn)在2－4月和10月份；葉綠素變化在0.019～2.009 mg/L之間，最高值出現(xiàn)在10或11月，上述理化因子中無(wú)機(jī)氮均是養(yǎng)水機(jī)池塘年均值較低，而溶氧、磷酸鹽、TN、TP、葉綠素、懸浮物年均值均是養(yǎng)水機(jī)池塘較高，其中養(yǎng)水機(jī)池塘溶氧年均值顯著高于自然納潮池塘（<0.05），與微孔曝氣池塘無(wú)顯著差異，葉綠素年均值顯著高于自然納潮和微孔曝氣池塘（<0.05）。

表1 池塘水物理化學(xué)參數(shù)

注：Wn、Wt、Ws分別表示養(yǎng)水機(jī)、自然納潮、微孔曝氣池塘水樣。下同。

Note: Wn, Wt and Ws respectively represent the water samples of the pond with Jet Water Mixer (JWM), water exchange by spring tides (WEST), submerged aerator (SA). The same below.

2.2 養(yǎng)水機(jī)對(duì)池塘水細(xì)菌菌群α、β多樣性及結(jié)構(gòu)的影響

本研究對(duì)所獲序列片段，經(jīng)拼接、質(zhì)控和去除嵌合體后共得到681 429條有效克隆序列，樣品文庫(kù)覆蓋率均大于0.98，說(shuō)明本試驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確且有說(shuō)服力，所獲序列以97%的相似度聚類(lèi)后共獲得19 334個(gè)操作分類(lèi)單元(OTUs)。池塘水細(xì)菌菌群-多樣性指數(shù)見(jiàn)（圖2a、b、c、d），可見(jiàn)，養(yǎng)水機(jī)池塘水在各時(shí)段菌群豐富度（Observed species, Shao1, ACE）、多樣性指數(shù)和均勻度（Shannon, simpson）均最高，而微孔曝氣池塘水菌群豐富度均最低，但經(jīng)過(guò)Tukey和wilcox檢驗(yàn)，3組之間-多樣性差異不顯著。-多樣性的PCoA分析和基于Amova unweighted unifrac檢驗(yàn)分析，養(yǎng)水機(jī)池塘與對(duì)照池塘水細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)總體差異不顯著（圖2e），但相似度（Similarity）也不高，僅在8.77%～9.37%之間，這種菌群結(jié)構(gòu)相似度不高、區(qū)別性又不顯著（>0.05）的現(xiàn)象是月份不同和水質(zhì)處理方式不同協(xié)同作用的結(jié)果，既水質(zhì)調(diào)控方式對(duì)試驗(yàn)前期（3, 5月份）同一月份各池塘水菌群結(jié)構(gòu)影響較小，對(duì)試驗(yàn)后期（11月份）菌群結(jié)構(gòu)影響較大的結(jié)果。經(jīng)spearman分析，影響?zhàn)B水機(jī)池塘水與對(duì)照池塘水-多樣性差異的主要環(huán)境因子為NH4+-N、NO2--N、NO3--N含量，它們均與-多樣性指數(shù)呈負(fù)相關(guān)（表2），即水質(zhì)越差，-多樣性指數(shù)越低。

注：Wn3、Wn5、Wn11分別代表3、5、11月份的養(yǎng)水機(jī)池塘，Wt3、Wt5、Wt11分別代表3、5、11月份的自然納潮池塘，Ws3、Ws5、Ws11分別代表3、5、11月份的微孔曝氣池塘，下同。

表2 菌群α-多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性

2.3 養(yǎng)水機(jī)對(duì)池塘水優(yōu)勢(shì)菌群組成的影響

養(yǎng)水機(jī)池塘水前10優(yōu)勢(shì)門(mén)和前3優(yōu)勢(shì)綱組成基本與對(duì)照池塘水一致，前10優(yōu)勢(shì)門(mén)（圖3a），分別為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、酸桿菌門(mén)a、綠彎菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)，除11月份養(yǎng)水機(jī)池塘水以變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)為前2優(yōu)勢(shì)門(mén)外，其余時(shí)間各池塘水前2優(yōu)勢(shì)門(mén)均為變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，豐度極顯著高于其它門(mén)（<0.05），除11月份養(yǎng)水機(jī)池塘水前3優(yōu)勢(shì)綱為-變形桿菌綱、-變形菌綱和桿菌綱外，其余各時(shí)間各池塘水前3優(yōu)勢(shì)綱均為-變形桿菌綱、-變形菌綱和黃桿菌綱，但各綱排序不同（圖3b），可見(jiàn)，11月份養(yǎng)水機(jī)池塘水與對(duì)照池塘水在門(mén)和綱水平上出現(xiàn)了差異。

圖3 在門(mén)、綱、屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌群組成

養(yǎng)水機(jī)池塘水與對(duì)照池塘水豐度超過(guò)1%的優(yōu)勢(shì)屬組成差異較大（圖3c），豐度超過(guò)3%的優(yōu)勢(shì)屬養(yǎng)水機(jī)池塘有亞硫酸桿菌屬、NS3a_marine_group、極地桿菌屬、4屬，自然納潮池塘有亞硫酸桿菌屬、、、4屬，微孔曝氣池塘有、NS3a_marine_group、亞硫酸桿菌屬、、5屬，可見(jiàn)對(duì)照微孔曝氣池塘和自然納潮池塘優(yōu)勢(shì)屬組成相近，而與養(yǎng)水機(jī)池塘有一定的差異，值得關(guān)注的是各池塘均含有亞硫酸桿菌屬。在測(cè)定期間，自然納潮池塘水除了藍(lán)藻在5月份增量較多以外，變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的豐度變化不大，而養(yǎng)水機(jī)池塘和微孔曝氣池塘水?dāng)M桿菌門(mén)均呈下降趨勢(shì)，養(yǎng)水機(jī)池塘水除了變形菌門(mén)變化不大以外，其他菌門(mén)均呈明顯升高，尤其是厚壁菌門(mén)和藍(lán)藻門(mén)，而微孔曝氣池塘變形菌門(mén)呈增加趨勢(shì)，其它門(mén)變化不明顯，說(shuō)明養(yǎng)水機(jī)和微孔曝氣對(duì)池塘水的菌群影響既有相同之處，也有不同之處。

總體來(lái)說(shuō)，水質(zhì)調(diào)控方式對(duì)池塘水分類(lèi)層級(jí)越高的優(yōu)勢(shì)菌群組成影響越小，對(duì)分類(lèi)層級(jí)越低的菌群組成影響越大，試驗(yàn)后期（11月份）影響較試驗(yàn)前期（3、5月份）大。

2.4 各池塘水豐度差異顯著的種群

通過(guò)T-test檢驗(yàn)，養(yǎng)水機(jī)池塘水與對(duì)照池塘水細(xì)菌菌群在門(mén)、綱、目分類(lèi)層次上無(wú)顯著差異，但在某些科和屬的豐度上有顯著差異，養(yǎng)水機(jī)池塘水交替假單胞菌科見(jiàn)圖4a）和屬（見(jiàn)圖4b）的豐度顯著低于對(duì)照自然納潮池塘水的豐度，與對(duì)照微孔曝氣池塘水無(wú)顯著差異，的豐度均值分別為1.2%、2.8%、1.53%，屬的豐度均值分別為0.87%、2.47%、1.42%。再通過(guò)lefse（LDA Effect Size）差異性檢驗(yàn)可知（圖4c），養(yǎng)水機(jī)池塘水與對(duì)照池塘水只有厚壁菌門(mén)-桿菌綱-乳酸菌目豐度具有生物統(tǒng)計(jì)學(xué)Biomarker意義，其中養(yǎng)水機(jī)池塘水和自然納潮池塘水及微孔曝氣池塘水中的豐度均值分別為5.98%、1.48%、0.52%，豐度均值分別為4.01%、0.26%、0.17%，均值分別是3.720%、0.048%、0.039%，其LDA值超過(guò)4.0，這主要得益于養(yǎng)水機(jī)不斷促進(jìn)生長(zhǎng)的結(jié)果，運(yùn)轉(zhuǎn)到后期（11月份），仨池塘該目豐度分別達(dá)到11.02%、0.04%、0.03%，說(shuō)明養(yǎng)水機(jī)顯著促進(jìn)了該種群細(xì)菌的生長(zhǎng)。

2.5 引起各池塘水菌群結(jié)構(gòu)差異的主要種群

通過(guò)Simper（Similarity percentage）分析（見(jiàn)圖5），引起各池塘水菌群結(jié)構(gòu)差異的門(mén)，按照從大到小排序分別是擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，可見(jiàn)擬桿菌門(mén)對(duì)水質(zhì)反應(yīng)比變形菌門(mén)敏感，引起各池塘水菌群結(jié)構(gòu)差異的屬是各池塘前優(yōu)勢(shì)屬（除亞硫酸桿菌屬外），再加上科爾韋爾氏菌屬和屬，可見(jiàn)引起各池塘水菌群結(jié)構(gòu)差異的主要類(lèi)群為各池塘優(yōu)勢(shì)種群。

圖4 水中細(xì)菌菌群顯著差異科和屬及目

圖5 引起池塘之間菌群結(jié)構(gòu)差異的細(xì)菌門(mén)和細(xì)菌屬

2.6 影響各池塘水菌群結(jié)構(gòu)差異的環(huán)境因子

通過(guò)spearman和CCA_envifie中的OUT分析可見(jiàn)，引起池塘水多數(shù)門(mén)豐度和菌群結(jié)構(gòu)差異的水質(zhì)指標(biāo)是水中的總磷TP(=0.003)、NH4+-N(=0.005)、NO2--N(=0.008)（見(jiàn)表3），如影響擬桿菌門(mén)豐度的環(huán)境因子是NH4+-N、NO2--N和總磷TP，與NH4+-N、NO2--N濃度成正相關(guān)，與總磷TP濃度成負(fù)相關(guān)，影響厚壁菌門(mén)豐度的環(huán)境因子是PO43--P和O2，該門(mén)豐度與2環(huán)境因子呈正相關(guān)，值得注意的是影響池塘水豐度最高的變形菌門(mén)的環(huán)境因子卻是鹽度，兩者呈正相關(guān)，而與營(yíng)養(yǎng)鹽無(wú)關(guān)。影響池塘菌群結(jié)構(gòu)差異的環(huán)境因子也是總磷TP(=0.003)、NH4+-N(=0.005)、NO2--N(=0.008)濃度（見(jiàn)圖6）。

2.7 養(yǎng)水機(jī)對(duì)池塘水功能菌的影響

采用FAPROTAX、PICRUS軟件預(yù)測(cè)了池塘各功能菌豐度，經(jīng)FAPROTAX預(yù)測(cè)菌群功能的t-test和wilcox檢驗(yàn)分析，養(yǎng)水機(jī)與對(duì)照池塘相比，各功能菌豐度均無(wú)顯著差異，池塘水FAPROTAX檢驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)功能菌依次為：化能異養(yǎng)、好氧化能異養(yǎng)、硫氧化、硫呼吸、硝酸鹽還原、發(fā)酵和植物病原菌（圖7a），各功能菌豐度分別變化在12.78%～19.65%、0.96%～4.97%、0.37%～2.74%、0.05%～11.40%、0.18%～8.07%之間，其他功能菌豐度低于1%；與細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化類(lèi)似，試驗(yàn)前期（3，5月），各池塘同一優(yōu)勢(shì)功能菌豐度差異較小，試驗(yàn)后期（11月），有些功能菌豐度差異較大（圖7b），其中養(yǎng)水機(jī)池塘水較對(duì)照自然納潮和微孔曝氣池塘水發(fā)酵菌豐度（分別為9.658%、0.300%、0.190%）、植物致病菌豐度（分別為3.676%、0.023%、0.017%）有較大的提高（圖7a），硝酸鹽還原菌豐度（分別為1.563%、7.378%、12.104%）有較大的降低。

表3 影響細(xì)菌門(mén)豐度與水質(zhì)的相關(guān)性

注：*為顯著（<0.05），**為極顯著（<0.01）。

Note: * is significant (<0.05), ** is extremely significant (<0.01).

圖6 菌群結(jié)構(gòu)與水質(zhì)指標(biāo)的關(guān)系

圖7 FAPROTAX檢驗(yàn)的池塘優(yōu)勢(shì)功能菌的相對(duì)豐度及PCA分析

經(jīng)過(guò)PICRUS軟件分析（圖8），各池塘主要功能菌依次為代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程，其豐度依次變化在50.97%～52.48%、14.43%～17.24%、10.51%～14.24%、3.31%～3.75%之間，其中在Level 1水平上2對(duì)照池塘中的代謝和細(xì)胞過(guò)程存在顯著差異（<0.05），而養(yǎng)水機(jī)與對(duì)照池塘菌群功能并無(wú)顯著差異。在代謝Level 2水平上，養(yǎng)水機(jī)池塘和對(duì)照微孔曝氣池塘除了外源物質(zhì)生物降解和代謝豐度低于自然納潮池塘以外，其他代謝功能均高于自然納潮池塘，而養(yǎng)水機(jī)池塘以碳水化合物、能量代謝、外源性物質(zhì)生物降解和代謝為主要代謝類(lèi)型，對(duì)照微孔曝氣池塘以氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝、脂質(zhì)代謝、核苷酸代謝為主，其中氨基酸代謝在2池塘中（<0.05）值顯著，而（>0.05）值不顯著，可見(jiàn)不同水質(zhì)調(diào)控方式池塘水主要代謝類(lèi)型是不同的。

各池塘植物致病菌豐度與優(yōu)勢(shì)屬關(guān)系不同（表4），養(yǎng)水機(jī)池塘植物致病菌豐度與科爾韋爾氏菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬三屬豐度呈顯著正相關(guān)，微孔曝氣池塘與NS3a-marine- group呈顯著正相關(guān)，但三種水質(zhì)調(diào)控方式池塘植物致病菌均與NO3--N含量呈正相關(guān)，說(shuō)明驅(qū)動(dòng)池塘植物致病菌豐度的主要因素是水中的NO3--N含量。

表4 植物致病菌與水中優(yōu)勢(shì)屬和水質(zhì)的相關(guān)性

3 討 論

3.1 養(yǎng)水機(jī)對(duì)刺參池塘水質(zhì)的影響

養(yǎng)水機(jī)對(duì)刺參池塘水質(zhì)的影響與前一年測(cè)定結(jié)果類(lèi)似[12]，說(shuō)明養(yǎng)水機(jī)對(duì)池塘水質(zhì)的影響是比較穩(wěn)定的。

3.2 刺參養(yǎng)殖池塘水細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類(lèi)群特點(diǎn)

刺參養(yǎng)殖池塘細(xì)菌前10優(yōu)勢(shì)門(mén)的組成與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，這可能與養(yǎng)殖對(duì)象均為刺參有關(guān)[4,12-14,20-21]，自然納潮刺參養(yǎng)殖池塘水第1優(yōu)勢(shì)門(mén)和優(yōu)勢(shì)綱分別為變形菌門(mén)和-變形桿菌綱，均與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4,12-14,20-21]，這可能與變形菌門(mén)為自然界中第1大菌門(mén)有關(guān)，變形菌門(mén)包括各種生態(tài)位細(xì)菌，因此不同環(huán)境條件的改變，可能對(duì)其排位影響不大，而第2優(yōu)勢(shì)門(mén)和優(yōu)勢(shì)綱與文獻(xiàn)報(bào)道存在差異，本試驗(yàn)池塘中的第2優(yōu)勢(shì)門(mén)與長(zhǎng)海、乳山刺參池塘一致[4,12]均為擬桿菌門(mén)（均為黃海水域池塘），而渤海海域刺參池塘均為放線(xiàn)菌門(mén)[4]，本文刺參池塘第2優(yōu)勢(shì)綱為-變形菌綱，與長(zhǎng)海池塘一致，但與營(yíng)口和乳山刺參池塘分別為黃桿菌綱和放線(xiàn)菌綱不同，可見(jiàn)相同海域距離較近池塘第2優(yōu)勢(shì)門(mén)和第2優(yōu)勢(shì)綱相同，不同海域或相同海域距離較遠(yuǎn)，第2優(yōu)勢(shì)門(mén)和優(yōu)勢(shì)綱差異較大，說(shuō)明刺參池塘水第2優(yōu)勢(shì)門(mén)和優(yōu)勢(shì)綱類(lèi)別既受不同海域影響，也受相同海域距離遠(yuǎn)近的影響；而不同海域或距離相近的同一海域?qū)Τ靥了牡?優(yōu)勢(shì)菌門(mén)和優(yōu)勢(shì)綱影響更大，這可能與第3優(yōu)勢(shì)門(mén)及優(yōu)勢(shì)綱菌群包含的細(xì)菌種類(lèi)少，受環(huán)境條件影響更大有關(guān)。而不同海域?qū)?yōu)勢(shì)屬組成影響更大[4]，屬級(jí)位于分類(lèi)層級(jí)較低的位置，包含菌種數(shù)量少、生態(tài)位較窄，受環(huán)境影響其豐度變化差異更大，但不同海域刺參池塘中均出現(xiàn)了極地桿菌屬、亞硫酸桿菌屬、、4屬[4]，其豐度均超過(guò)了1%，而該四屬中的某些種是某些藻類(lèi)的伴隨者，某些種卻是柴油降解菌[22-23]，這可能與刺參池塘里某些藻較多和柴油較多有關(guān)。

3.3 水質(zhì)調(diào)控方式對(duì)池塘水優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群豐度的影響

養(yǎng)水機(jī)對(duì)池塘水優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群組成的影響顯示對(duì)分類(lèi)層級(jí)越高影響越小，對(duì)分類(lèi)層級(jí)越低影響越大的特點(diǎn)，這與王飛鵬等[7]的結(jié)果一致，其原因與分類(lèi)層級(jí)越高生態(tài)位越多，分類(lèi)層級(jí)越低生態(tài)位越小有關(guān)。

盡管在門(mén)、綱水平上，各池塘各優(yōu)勢(shì)門(mén)、綱豐度差異不顯著，但與自然納潮對(duì)照池塘相比，養(yǎng)水機(jī)池塘水和微孔曝氣池塘水變形菌門(mén)豐度降低了，擬桿菌門(mén)豐度升高了，說(shuō)明養(yǎng)水機(jī)和微孔曝氣裝置對(duì)池塘水細(xì)菌菌群的調(diào)節(jié)有一定的相似性，這可能與養(yǎng)水機(jī)和微孔曝氣裝置都能提供池塘氧氣有關(guān)，但養(yǎng)水機(jī)對(duì)池塘細(xì)菌菌群的作用也有其特殊性，養(yǎng)水機(jī)對(duì)厚壁菌門(mén)豐度影響比對(duì)變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)豐度影響更大，養(yǎng)水機(jī)池塘厚壁菌門(mén)豐度分別是自然納潮和微孔曝氣對(duì)照池塘的4和11.5倍，分別是對(duì)照池塘的15.4和23.4倍，乳桿菌目豐度分別是對(duì)照池塘的77.6、95.6倍，且該目豐度在養(yǎng)水機(jī)池塘與對(duì)照池塘之間具有顯著差異，而該目在養(yǎng)水機(jī)池塘主要以乳桿菌屬和乳球菌屬為主，說(shuō)明養(yǎng)水機(jī)的轉(zhuǎn)運(yùn)具有富集乳酸桿菌和乳酸球菌的作用，該屬細(xì)菌兼性厭氧，通常被用作益生菌使用，理論上，該屬的增多對(duì)改善水質(zhì)、加快池塘有機(jī)物的降解有益，但養(yǎng)水機(jī)池塘該屬大量繁殖其機(jī)理需進(jìn)一步研究。

與自然納潮對(duì)照池塘相比，養(yǎng)水機(jī)顯著降低了交替單胞菌科科和居水菌屬屬豐度，這2組細(xì)菌基因組較大，適合環(huán)境變動(dòng)較大和具有較多大型褐藻、甲殼等復(fù)雜高分子糖類(lèi)環(huán)境里生長(zhǎng)[24-25]，說(shuō)明養(yǎng)水機(jī)池塘大型藻類(lèi)較少、環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，而對(duì)照池塘大型藻類(lèi)較高、水質(zhì)參數(shù)波動(dòng)較大，這與實(shí)際情況相符[16]，可見(jiàn)，池塘細(xì)菌豐度差異反應(yīng)了池塘環(huán)境條件。

除上述具有顯著差異的菌科和菌屬以外，養(yǎng)水機(jī)池塘前優(yōu)勢(shì)屬與對(duì)照池塘差異也較大，養(yǎng)水機(jī)池塘以藻類(lèi)分泌物為營(yíng)養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)菌豐度較高，如NS3a marine group[26-27]和極地桿菌屬[28]，而以大型藻類(lèi)分泌物為營(yíng)養(yǎng)屬細(xì)菌[29]豐度較低，比對(duì)照組低了3.7～6.5倍，除此以外，屬的細(xì)菌也比對(duì)照組低了4.2～5.5倍，這都與養(yǎng)水機(jī)池塘浮游藻類(lèi)豐度高，尤其是硅藻高，而大型藻類(lèi)豐度低是一致的，而優(yōu)勢(shì)亞硫酸桿菌屬細(xì)菌在養(yǎng)水機(jī)和對(duì)照池塘豐度差異極小，這可能與該屬能利用的機(jī)質(zhì)物較復(fù)雜有關(guān)[30]。

3.4　養(yǎng)水機(jī)對(duì)池塘水菌群多樣性的影響

養(yǎng)水機(jī)池塘水細(xì)菌-菌群多樣性和均一性最高，而對(duì)照微孔曝氣池塘僅在5月份細(xì)菌多樣性和均一性高于對(duì)照自然納潮池塘，其余時(shí)間均最低，細(xì)菌多樣性和均一性高，對(duì)穩(wěn)定水質(zhì)、不易受外界環(huán)境干擾具有重要作用[31-33]，說(shuō)明養(yǎng)水機(jī)池塘水質(zhì)狀況良好[34]、且穩(wěn)定，這有利于刺參的養(yǎng)殖。

3.5 細(xì)菌菌群豐度與環(huán)境因子的關(guān)系

根據(jù)細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)生將細(xì)菌分成不同的類(lèi)群，在高層次類(lèi)群中，如門(mén)，其成員生態(tài)位復(fù)雜，某門(mén)豐度很難與某一環(huán)境因子有直接的關(guān)聯(lián)，但也有些門(mén)豐度與某些環(huán)境有密切的關(guān)聯(lián)，而被用來(lái)作為指示生物，如擬桿菌門(mén)的豐度可以用來(lái)指示土壤的利用情況[35]，因此，人們希望利用某類(lèi)群豐度變化預(yù)警某一環(huán)境變化，以便能及早矯正不良環(huán)境，但是，因?yàn)榄h(huán)境條件的復(fù)雜性和細(xì)菌生態(tài)位的多樣性，至今尚無(wú)某門(mén)與某環(huán)境因子在各種環(huán)境條件下的統(tǒng)一關(guān)系，如有些報(bào)道變形菌門(mén)喜歡生活在低溶氧、有機(jī)物豐富的水域[7-8]，但也有研究表明，變形菌門(mén)與水溶氧呈正相關(guān)[20]，Ji等[36]報(bào)道變形菌門(mén)可以生活在各種溶氧條件下，本文并沒(méi)有觀(guān)測(cè)到變形菌門(mén)Proteobacteria豐度與溶氧的關(guān)系，而是與池塘鹽度呈正相關(guān)；擬桿菌門(mén)Bacteroidetes主要用來(lái)降解生物圈中復(fù)雜有機(jī)物，尤其喜歡降解海洋中的多糖和碳?xì)浠衔颷35]，其豐度與pH值呈負(fù)相關(guān)[35,37-38]，與PO43--P含量呈正相關(guān)[38-39]，本文顯示擬桿菌門(mén)與TP呈負(fù)相關(guān)，與NH4+-N、NO2--N呈正相關(guān)，可見(jiàn)在不同生態(tài)環(huán)境里，影響優(yōu)勢(shì)門(mén)的外界環(huán)境條件不一，但影響擬桿菌門(mén)豐度的環(huán)境因子均與營(yíng)養(yǎng)鹽N和P有關(guān)，有些文獻(xiàn)報(bào)道擬桿菌門(mén)對(duì)外界環(huán)境條件敏感[35]，可以作為環(huán)境的指示生物，本文也證實(shí)了這點(diǎn)，其豐度如何與水質(zhì)關(guān)聯(lián)，尚需大量的試驗(yàn)。本文測(cè)定厚壁菌門(mén)桿菌綱Bacilli與O2具有正相關(guān)，這與該門(mén)的生理特點(diǎn)相符，希望本文對(duì)變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)與水質(zhì)的關(guān)系，為今后三門(mén)的生態(tài)研究有所幫助。

3.6 養(yǎng)水機(jī)對(duì)池塘水細(xì)菌菌群功能的影響

目前，有關(guān)刺參養(yǎng)殖池塘細(xì)菌功能的文獻(xiàn)較少[39]，且采用的方法與本文不同，難以進(jìn)行比較。本試驗(yàn)表明，水質(zhì)調(diào)控方式影響了刺參池塘細(xì)菌功能菌的豐度，但通過(guò)FAPROTAX和PICRUS level1檢測(cè)的功能菌豐度差異不顯著，這可能與各池塘在冬季幾乎不運(yùn)轉(zhuǎn)，導(dǎo)致3、5月差異較小所致，但到11月份各水質(zhì)調(diào)控方式下各池塘功能菌有較明顯的差異，特別是養(yǎng)水機(jī)池塘有利于抑制大型植物病害菌的生長(zhǎng)，這有利于避免大型藻類(lèi)過(guò)度生長(zhǎng)，有利于刺參生長(zhǎng)和避免過(guò)多有機(jī)物的積累提供了生物基礎(chǔ)。比自然納潮池塘和微孔曝氣池塘分別提高了32、50和159、216倍；硝酸鹽還原菌豐度明顯降低。

4 結(jié) 論

1）不同水質(zhì)調(diào)控方式對(duì)分類(lèi)層級(jí)高的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群組成影響較小，對(duì)分類(lèi)層級(jí)低的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群影響較大。

2）NS3a_marine_group、極地桿菌屬兩屬菌可作為刺參池塘水質(zhì)較好的指示菌。

3）養(yǎng)水機(jī)提高了池塘水菌群-多樣性、厚壁菌門(mén)豐度和植物致病菌豐度，這導(dǎo)致了養(yǎng)水機(jī)池塘水質(zhì)穩(wěn)定、有機(jī)質(zhì)少，植物生長(zhǎng)緩慢，有利于刺參池塘水質(zhì)和刺參生長(zhǎng)。

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Effects of three water treatments on the structure of bacterial flora of sea cucumber breeding pond water in spring and autumn

Zhang Dongsheng1,2, Zhou Wei1※

(1.,,116023,; 2.&,,116023,)

Sea cucumber is an important species cultivated in seawater ponds in Liaoning and Shandong provinces of China in the past 30 years. However, the current conventional techniques for improving pond water quality, such as water exchange by spring tides (WEST) and submerged aerator (SA), are not very ideal. The ponds can still form thermohaloclines in February and June, and a large number of macroalgae will be produced in summer and autumn. Jet Water Mixer (JWM) is a new water quality control device for sea cucumber pond. In order to explore the effect and mechanism of water quality improvement of sea cucumber breeding pond by JWM, we measured the annual changes of water quality and the changes of bacterial flora and function in spring and autumn by 16SrRNA high-throughput sequencing technology under the three water quality control methods. Nine adjacent ponds of the same size and shape were selected for the experiment. Three ponds with JWM were used as the experimental group, and the other six ponds were used as the control group, among which 3 ponds were used as SA control group and 3 ponds were used as WEST control group. The results showed that the contents of NH4+-N, NO2--N and NO3--N in the pond water with JWM were decreased, and the contents of O2, PO43--P, TN, TP, chlorophyll and suspended matter were increased, But except that the content of chlorophyll in the pond water with JWM was significantly higher than that in the control pond, there was no significant difference in other water quality indexes. The effect of water quality regulation on the composition of dominant bacterial groups in pond water showed that the higher the classification level, the smaller the effect, while the lower the classification level, the greater the effect. The composition of the top 10 dominant phyla and the top 3 dominant classes in the pond water with JWM were basically the same as that in the control ponds. The first and second dominant phyla are Proteobacteria and Bacteroidetes. The first three dominant classes were Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, and Flavobacteria, but the composition of the dominant genus varied greatly in different ponds. Lefse analysis showed that JWM significantly increased the abundance of Firmicutes-Bacilli-Lactobacillales in the pond water (LDA SCORE > 4), and t-test showed that WEST significantly increased the abundance of Alteromonadaceae and SA significantly increased the abundance ofin the pond water. FAPRTAX analysis showed that the main functional bacteria in each pond were chemoheterotrophy, aerobic chemoheterotrophy, sulfur oxidation, sulfur respiration, nitrate reduction, fermentation and plant pathogens. There was no significant difference in the annual mean abundance of the same functional bacteria among the ponds, but at the late stage of the experiment, there were large difference in the abundance of some functional bacteria between ponds. JWM increased the abundance of fermentation and plant pathogen bacteria and decreased the abundance of nitrate reduction bacteria. SA increased the abundance of nitrate reduction bacteria and decreased the abundance of plant pathogenic bacteria. The-diversity of microbiota was the highest in the water of pond with JWM, and the lowest in that of pond with SA. The main environmental factors affecting the structure of bacterial flora were the contents of TP, NH4+-N and NO2--N in pond water. In conclusion, JWM significantly increased the abundance of Lactobacillales and plant pathogenic bacteria, and increased the-diversity of bacterial flora in pond water. The former inhibited the growth of macroalgae, while the latter was beneficial to water quality stability.

aquaculture; flora composition; water quality regulation; Jet Water Mixer; functional bacteria; FAPRTAX; sea cucumber pond

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.19.022

S96; Q939.1

A

1002-6819(2022)-19-0202-10

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2022-06-15

2022-09-15

遼寧省科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目（2018104009）；遼寧省“興遼英才”項(xiàng)目（XLYC1008029）；大連市2020年度科技特派團(tuán)項(xiàng)目；大連市重點(diǎn)領(lǐng)域創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目（2019RT11）；大連市第二批領(lǐng)軍人才項(xiàng)目聯(lián)合資助。

張東升，教授，研究方向?yàn)樗蛭⑸鷳B(tài)。Email：zhangds0415@126.com

周瑋，教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)健康養(yǎng)殖技術(shù)。Email：zhouwei@dlou.edu.cn