血清蛋白醋酸纖維膜電泳緩沖液的篩選

趙澤鵬，張佳音，苑颯龍，白佳鵬，楊蕎瑀，張麗云

(河北北方學(xué)院 動物科技學(xué)院，河北 張家口 075000)

電泳技術(shù)在大分子物質(zhì)的定性、定量分析等方面具有重要地位，其中醋酸纖維膜電泳具有分離速度快、區(qū)帶清晰、樣品用量小等特點，在高校開出率很高，是高校生化實驗教學(xué)中最基本的教學(xué)項目之一[1]。血清蛋白電泳對于某種血清蛋白的異常變化推測發(fā)生了某些疾病意義重大，例如血清球蛋白水平對神經(jīng)介入術(shù)后急性缺血性腦卒中患者炎癥因子和神經(jīng)激素水平有一定影響[2]，多發(fā)性骨髓瘤會分泌異常單克隆免疫球蛋白(M蛋白)導(dǎo)致異常球蛋白增加，正常球蛋白合成減少[3-4]。近些年，醋酸纖維膜電泳常用的巴比妥緩沖液試劑不易購得，其他替代緩沖液分離血清蛋白效果又說法不一，因此，篩選適合該電泳的緩沖液對保障實驗質(zhì)量有重要意義?；趯嶒炘砑半娪揪彌_液的特點，選取幾種常用緩沖液進(jìn)行篩選試驗，為教學(xué)和科研提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

(1)成年家兔：由河北北方學(xué)院實驗動物科提供。

(2)電泳支持物：醋酸纖維膜，2.0 cm×8.0 cm，購自北京六一生物技術(shù)有限公司。

(3)主要試劑：Tris堿，鹽酸，磷酸，乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)，硼酸，四硼酸鈉，氯化鈉，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，巴比妥鈉，巴比妥，氨基黑10B，甲醇，冰乙酸，95%乙醇，天津市津東天正化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，均為分析純。

(4)主要儀器：JA3003分析天平，購自上海舍巖儀器有限公司；DYY-12型電泳儀、DYCP-38B型臥式電泳槽，購自北京六一生物科技有限公司；EOS 6D Mark II單反相機(jī)，購自佳能(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗準(zhǔn)備

(1)血清的制備

選取健康成年家兔，保定，使用10 mL真空負(fù)壓采血管(帶有枸櫞酸鈉)，從耳緣靜脈抽取靜脈血，靜置30 min，離心，2 000 rpm，10 min，取上清液，冷藏備用。

(2)制備濾紙橋

裁剪合適尺寸的濾紙條，4層附著在電泳槽的支架上，一端與支架的前沿對齊，另一端浸于緩沖溶液中，而后用緩沖溶液全部浸濕，驅(qū)趕濾紙與支架間的氣泡，使之緊貼于支架上。

(3)試劑的配制

①電泳緩沖溶液：6種電泳緩沖溶液按表1分別稱取試劑，放入燒杯加水溶解后，移至1 000 mL容量瓶，定容，混勻備用。

表1 6種緩沖溶液的成分

②染色液：稱取氨基黑10B 0.5 g，放入燒杯中，加40 mL蒸餾水溶解后，移至100 mL容量瓶，加入冰乙酸10 mL，用甲醇定容至刻度。

③漂洗液：量取95%乙醇45 mL、冰乙酸5 mL，在100 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度。

1.2.2 分組與薄膜的選擇處理

將選定的緩沖液編號分組，1～6組分別為Tris-鹽酸緩沖液、Tris-磷酸緩沖液、Tris-硼酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、巴比妥緩沖液。

取6套玻璃平皿，按照1～6的順序編號，依次加入對應(yīng)的緩沖液。每套平皿中浸泡12張標(biāo)記好的醋酸纖維膜，方法：辨別無光澤面，用鉛筆在膜的一端2 cm處作標(biāo)記，作為點樣位置，然后將無光澤面向下，浸泡于平皿內(nèi)緩沖液中，注意觀察薄膜觸及液面的瞬間，若瞬間全部浸濕說明薄膜質(zhì)量好，否則應(yīng)棄掉。使薄膜自然下沉，浸泡30 min。

1.2.3 最適電壓的篩選

根據(jù)薄膜的長度計算電壓[5]，設(shè)定60 V、70 V、80 V 3種電壓條件，觀察各種緩沖液分離血清蛋白效果，最佳電壓以圖譜蛋白區(qū)帶出現(xiàn)5條、條帶整齊、清晰為判定標(biāo)準(zhǔn)。電泳時間為50 min。試驗操作方法如下：

(1)點樣 將充分浸泡的薄膜取出，用濾紙吸干多余緩沖液，無光澤面向上平放于干凈的玻璃板上。取20 μL新鮮血清加在載玻片上，傾斜載玻片使血清分散，用點樣器沾取血清，在纖維膜標(biāo)記的位置垂直點樣，并隨之提起。

(2)電泳 將點樣的醋酸纖維膜無光澤面向下，點樣端靠近負(fù)極，兩端緊貼電泳槽上的濾紙橋，拉直放好，每個電泳槽放置12條，蓋好蓋子，平衡10 min，選擇電壓和電泳時間，通電(3臺電泳儀同時電泳，每臺電泳儀連接2個電泳槽，電泳槽按照1-6編號，槽內(nèi)是對應(yīng)編號的緩沖液)。

(3)染色及漂洗 將纖維膜放入氨基黑染液染色5 min，取出，再漂洗3～5次，至背景清晰，記錄試驗結(jié)果。

1.2.4 緩沖溶液穩(wěn)定性試驗

(1)使用頻次：每種緩沖液120張醋酸纖維膜，在最適電壓下，觀察各緩沖液分離血清蛋白圖譜效果，操作方法同上，重復(fù)操作5次(24條/次)。根據(jù)有效纖維膜的蛋白區(qū)帶出現(xiàn)條數(shù)及概率判定使用頻次對緩沖液穩(wěn)定性的影響。

(2)使用時間：室溫放置6個月的緩沖液分離血清蛋白，重復(fù)上述操作1次(即每種緩沖液24條纖維膜)，試驗條件、操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn)同上，觀察放置一定時間對緩沖液穩(wěn)定性的影響。

1.2.5 各種緩沖液電泳結(jié)果的比較

(1)電泳圖譜蛋白質(zhì)分離效果的比較

比較各種電泳緩沖液分離血清蛋白的效果，根據(jù)蛋白區(qū)帶出現(xiàn)條數(shù)、概率以及分辨力對緩沖液進(jìn)行評價。

(2)蛋白質(zhì)區(qū)帶分散程度定量分析

分別選擇各種緩沖液電泳效果較好的圖譜，測量各組蛋白間距，計算并取均值，根據(jù)膜條擴(kuò)展的總距離(從點樣區(qū)到清蛋白最遠(yuǎn)端的距離)、點樣區(qū)距第一條帶遠(yuǎn)端、最遠(yuǎn)區(qū)帶與最近區(qū)帶的距離對緩沖液進(jìn)行評價。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

用IBM SPSS Statistics 25對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。緩沖液的區(qū)帶分散程度定量分析比較采用配對樣本t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適電壓的篩選結(jié)果

在60 V電壓時，Tris-鹽酸、Tris-磷酸、磷酸鹽、巴比妥緩沖液的電泳圖譜均出現(xiàn)4條蛋白質(zhì)區(qū)帶，其中第3條為α2-球蛋白和β-球蛋白合并，稱為α2、β-球蛋白(下同)，從正極到負(fù)極依次為清蛋白、α1-球蛋白、α2、β-球蛋白、γ-球蛋白；硼酸鹽緩沖液出現(xiàn)3條蛋白質(zhì)區(qū)帶，其中第2條為α1、α2、β-球蛋白合并。70 V電壓時，Tris-鹽酸、Tris-磷酸、磷酸鹽、巴比妥緩沖液圖譜出現(xiàn)5條區(qū)帶，從正極到負(fù)極依次為清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白，硼酸鹽緩沖液的電泳圖譜則均出現(xiàn)4條區(qū)帶。80 V電壓時，Tris-鹽酸、Tris-磷酸、巴比妥緩沖液的電泳圖圖譜均出現(xiàn)5條區(qū)帶，磷酸鹽、硼酸鹽緩沖液的電泳圖譜均出現(xiàn)4條(表2)。Tris-硼酸緩沖液在3個電壓梯度下圖譜均出現(xiàn)8條區(qū)帶。70v時各緩沖液電泳圖譜區(qū)帶數(shù)量出現(xiàn)最多，且區(qū)帶整齊、分辨力高、位置較適中，為最佳電壓。

表2 不同梯度電壓各種緩沖液電泳圖譜最多區(qū)帶數(shù)統(tǒng)計(n=12)

2.2 穩(wěn)定性測試試驗結(jié)果

2.2.1 使用頻次

除去薄膜質(zhì)量、操作失誤等問題導(dǎo)致結(jié)果無效的，在使用頻次穩(wěn)定性試驗中有效薄膜及區(qū)帶數(shù)量見表3。第1次試驗中，Tris-鹽酸、Tris-磷酸和巴比妥緩沖液中圖譜出現(xiàn)5條區(qū)帶概率分別為8.33%、66.66%、65.22%；第5次試驗中，Tris-鹽酸、Tris-磷酸、磷酸鹽和巴比妥緩沖液中圖譜出現(xiàn)5條區(qū)帶概率分別為8.33%、68.18%、62.50%，出現(xiàn)5條區(qū)帶概率相差不大。Tris-硼酸和硼酸鹽緩沖液電泳圖譜均未出現(xiàn)5條蛋白質(zhì)區(qū)帶。

表3 各種緩沖液使用頻次穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.2.2 使用時間

緩沖液放置6個月穩(wěn)定性電泳試驗結(jié)果見表4，Tris-鹽酸、Tris-磷酸和巴比妥緩沖液圖譜出現(xiàn)5條區(qū)帶概率分別為8.69%、62.50%、58.33%，與使用頻次穩(wěn)定性試驗中首次電泳結(jié)果相比差異較小。

表4 緩沖液放置6個月電泳穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.3 各種緩沖液電泳圖譜的比較結(jié)果

2.3.1 電泳圖譜蛋白質(zhì)分離效果的比較

選擇的是70 V電壓、50 min條件下各種緩沖液具有代表性的圖譜，并根據(jù)蛋白質(zhì)泳動速度和分散距離分類比對，見圖1～3。圖1為Tris-鹽酸、Tris-磷酸和巴比妥緩沖液，這3種緩沖液雖然分散有所程度不同，但圖譜居中；與其他兩種緩沖液不同的是，Tris-鹽酸4條蛋白質(zhì)區(qū)帶居多；圖2為硼酸鹽和磷酸鹽緩沖液，二者區(qū)帶數(shù)及位置基本相同。圖3為Tris-硼酸緩沖液，圖譜有9條區(qū)帶。可見在相同試驗條件下，Tris-磷酸和巴比妥緩沖液圖譜效果優(yōu)于其他緩沖液。

注：1.清蛋白；2.α1-球蛋白；3.α2-球蛋白；4.β-球蛋白；5.γ-球蛋白圖1 Tris-鹽酸、Tris-磷酸和巴比妥緩沖液電泳圖譜分離效果的比較

注：1.清蛋白；2.α1-球蛋白；3.α2β-球蛋白；4.γ-球蛋白圖2 硼酸鹽和磷酸鹽緩沖液電泳圖譜分離效果的比較

注：因不能確定圖譜蛋白區(qū)帶名稱故沒有進(jìn)行標(biāo)記圖3 Tris-硼酸緩沖液電泳圖譜分離效果

2.3.2 區(qū)帶分散程度定量分析

每種緩沖液選取50張醋酸纖維膜，分別統(tǒng)計薄膜蛋白區(qū)帶分布距離，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果見表5。膜條擴(kuò)展的總距離，Tris-鹽酸、Tris-磷酸和巴比妥緩沖液三者間差異不顯著(P>0.05)，與磷酸鹽和硼酸鹽緩沖液間差異極顯著(P<0.01)；點樣區(qū)距第一條帶遠(yuǎn)端的距離和最遠(yuǎn)區(qū)帶與最近區(qū)帶的距離，Tris-磷酸與巴比妥緩沖液二者間無顯著差異(P>0.05)，與Tris-鹽酸差異顯著(P<0.05)、與磷酸、硼酸鹽緩沖液差異極顯著(P<0.01)，Tris-鹽酸與其他4種緩沖液均差異顯著(P<0.05)；最遠(yuǎn)區(qū)帶與最近區(qū)帶的距離，磷酸鹽緩沖液與硼酸鹽緩沖液間差異顯著(P<0.05)。Tris-硼酸圖譜均出現(xiàn)超過5條區(qū)帶的現(xiàn)象，此處不做分析。

表5 各種緩沖液電泳圖譜蛋白區(qū)帶分散程度分析

3 討 論

3.1 電泳電壓的選擇

影響質(zhì)點遷移率的因素有多種，包括帶電質(zhì)點的性質(zhì)、電場強(qiáng)度、緩沖液的黏度、溫度、pH值和離子強(qiáng)度以及固體支持物的電滲現(xiàn)象等。由于醋酸纖維薄膜電滲很小，如果緩沖液性質(zhì)穩(wěn)定，此時影響質(zhì)點遷移的主要因素便是電場強(qiáng)度。電泳速度與電場強(qiáng)度和電流強(qiáng)度成正比，電壓增加，電流也相應(yīng)增大，從而加速電泳。但電流過大時，血清蛋白運(yùn)動快但區(qū)帶卻分不開，產(chǎn)生的熱效應(yīng)足夠高的話甚至?xí)寡宓鞍鬃冃远荒芊蛛x[6]。此外，還應(yīng)根據(jù)室溫對電壓適當(dāng)調(diào)整[7，8]，因此選擇合適的電壓是電泳試驗良好效果的重要環(huán)節(jié)。

通過對60 V、70 V、80 V 3種電壓梯度的對比，60 V時區(qū)帶緊密不易分離，隨著電壓的增大，移動的距離越遠(yuǎn)，區(qū)帶整體向正極方向移動的距離增加；80 V時蛋白區(qū)帶整體明顯偏向正極，導(dǎo)致緩沖液圖譜的清蛋白泳動到濾紙橋邊緣，造成蛋白丟失，且電壓過高導(dǎo)致Tris-硼酸的清蛋白出現(xiàn)了“蝴蝶狀”。說明電壓過高，蛋白質(zhì)各組分之間展開距離短，出現(xiàn)擠壓，導(dǎo)致區(qū)分困難，并且極易造成蛋白質(zhì)區(qū)帶過度移動；電壓過低，樣品泳動速度慢且易擴(kuò)散，所呈現(xiàn)的圖譜常有“拖尾”現(xiàn)象不利于圖譜的觀察。

3.2 電泳緩沖液的穩(wěn)定性

除了離子強(qiáng)度和電場強(qiáng)度，使用頻次和放置時間也是影響電泳緩沖液穩(wěn)定性的主要因素。試驗表明，圖譜出現(xiàn)各種蛋白質(zhì)區(qū)帶數(shù)量首次比末次(第5次)相比較，Tris-磷酸、Tris-硼酸、磷酸鹽、硼酸鹽和巴比妥緩沖液基本一致，說明使用頻次5次以內(nèi)，各緩沖液圖譜區(qū)帶數(shù)量和清晰度變化不大；Tris-鹽酸緩沖液圖譜出現(xiàn)4條和3條蛋白質(zhì)區(qū)帶的薄膜數(shù)量前后相差2張，說明重復(fù)使用5次對該緩沖液電泳效果有一定影響。放置了6個月的緩沖液圖譜出現(xiàn)各種蛋白質(zhì)區(qū)帶數(shù)量與頻次穩(wěn)定試驗中首次數(shù)量對比，各種緩沖液相差不明顯，出現(xiàn)5條的占比率有所下降，其中Tris-磷酸緩沖液比放置前降低了4.16%，巴比妥緩沖液降低了4.17%，可見放置6個月時間的電泳緩沖液的電泳圖譜區(qū)帶占比率總體是下降的，但下降幅度不大，可以繼續(xù)使用，表明室溫下放置6個月時間對緩沖液穩(wěn)定性影響較小。含Tris堿的電泳緩沖溶液對溫度比較敏感，在溫度改變10攝氏度時，電泳緩沖液的pH會發(fā)生明顯的改變[9]，因本試驗溫度在20～25 ℃，故不存在這種可能性。電泳槽中緩沖溶液經(jīng)6次使用后不應(yīng)簡單地采取交換電極的方法，而是將緩沖液取出重新混合過濾后再進(jìn)行使用，一般用4個周期后需更換新溶液[10]。

3.3 區(qū)帶分離效果及分散程度

電泳圖譜和各蛋白分散程度分析是驗證優(yōu)質(zhì)電泳緩沖液的兩個重要條件。選擇適合電泳的電極緩沖液是蛋白分離圖譜質(zhì)量的保障，不僅可以提高區(qū)帶分辨力和清晰度，還能降低拖尾和吸附現(xiàn)象。通過緩沖液對比試驗發(fā)現(xiàn)，以Tris堿制成的有機(jī)電泳緩沖溶液比無機(jī)緩沖溶液出現(xiàn)的試驗結(jié)果好。原因可能為Tris緩沖溶液穩(wěn)定，與血清的相容性好，Tris-硼酸緩沖溶液與鈣、鎂離子不會形成沉淀；相反，硼酸鹽與鈣、鎂離子會產(chǎn)生沉淀，當(dāng)相同pH、相同濃度的Tris-硼酸緩沖溶液的離子強(qiáng)度比硼酸鹽緩沖溶液的離子強(qiáng)度低，這對血清蛋白測定尤為重要[9]。

Tris-磷酸與巴比妥緩沖液的電泳圖譜不僅出現(xiàn)5條蛋白質(zhì)帶比率相當(dāng)，而且區(qū)帶清晰、整齊、易分辨，說明這2種緩沖液分離血清蛋白的效果相當(dāng)；同樣的磷酸和硼酸鹽緩沖液圖譜蛋白質(zhì)出現(xiàn)4條，且結(jié)構(gòu)緊密，泳動距離短，用于醋酸纖維膜電泳效果較差；Tris-磷酸與巴比妥緩沖液、磷酸鹽和硼酸鹽緩沖液的膜條擴(kuò)展的總距離、點樣區(qū)距第一條帶遠(yuǎn)端的距離、最遠(yuǎn)區(qū)帶與最近區(qū)帶的距離均相差不大，雖然Tris-鹽酸上述3項指標(biāo)都優(yōu)于巴比妥，但Tris-鹽酸出現(xiàn)4條區(qū)帶比率較大，且蛋白區(qū)帶有擴(kuò)散現(xiàn)象，綜合考慮效果不如巴比妥緩沖液。

綜上所述，采用醋酸纖維膜電泳分離家兔血清蛋白，在電壓條件為70 V時，各種緩沖液電泳分離血清蛋白圖譜均達(dá)到最佳，其中Tris-磷酸、巴比妥、Tris-鹽酸緩沖液均出現(xiàn)5條清晰區(qū)帶；各緩沖液穩(wěn)定性在使用5次以內(nèi)、室溫條件放置6個月后影響不大；圖譜區(qū)帶數(shù)量、清晰度、分散程度分析表明Tris-磷酸、巴比妥緩沖液效果最好，Tris-鹽酸緩沖液次之，磷酸鹽、硼酸鹽緩沖液較差；Tris-硼酸緩沖液為何出現(xiàn)的多于5條蛋白質(zhì)區(qū)帶、每條區(qū)帶是什么蛋白質(zhì)，尚待進(jìn)一步研究探討。

4 結(jié) 論

6種電泳緩沖液在電壓為70 V、電泳時間為50 min試驗條件下分離血清蛋白，圖譜區(qū)帶清晰、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定。以圖譜分離5條蛋白質(zhì)區(qū)帶為準(zhǔn)，Tris-磷酸緩沖液與巴比妥緩沖液效果相當(dāng)，可以替代巴比妥緩沖液用于血清蛋白纖維膜電泳。