臨床檢驗(yàn)定量項(xiàng)目線性性能驗(yàn)證方法的比較

陳若虹，蔡婧瑤，吳逢熙，胡敏

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)沙410011)

線性范圍是定量檢測(cè)系統(tǒng)除正確度、精密度之外的一項(xiàng)重要性能指標(biāo)，也是臨床實(shí)驗(yàn)室定量檢測(cè)系統(tǒng)性能驗(yàn)證的一項(xiàng)重要內(nèi)容。美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)發(fā)布的線性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為EP06文件，此標(biāo)準(zhǔn)歷經(jīng)多次修訂，歷史版本有EP06-P(1986年)、EP06-P2(2001年)和EP06-A(2003年)[1]，目前最新版本為EP06-Ed2(2020年)[2]。我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)(原衛(wèi)生部、原衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì))也發(fā)布了多個(gè)與之相關(guān)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，如針對(duì)血液學(xué)專業(yè)的WS/T 406—2012《臨床血液學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量要求》[3]和針對(duì)分子生物學(xué)專業(yè)的GB/T 37871—2019《核酸檢測(cè)試劑盒質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[4]，以及針對(duì)所有定量項(xiàng)目的WS/T 408—2012《臨床化學(xué)設(shè)備線性評(píng)價(jià)指南》[5]、WS/T 420—2013《臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)商品定量試劑盒分析性能的驗(yàn)證》[6]等。雖然這些評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)采用的樣本基本相似，但統(tǒng)計(jì)處理方法卻存在較大差異，導(dǎo)致評(píng)價(jià)結(jié)論也可能出現(xiàn)不一致的情況，各臨床實(shí)驗(yàn)室可能面臨著選擇困難。本研究以2種直接膽紅素(direct bilirubin，D-Bil)檢測(cè)試劑為例，采用4種生化和免疫定量項(xiàng)目常用的標(biāo)準(zhǔn)(EP06-A、EP06-Ed2、WS/T 408—2012、WS/T 420—2013)對(duì)其進(jìn)行線性驗(yàn)證，演示驗(yàn)證過(guò)程，比較各方法的差異，為臨床實(shí)驗(yàn)室選擇合適的線性驗(yàn)證方法提供參考。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 7600型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)；校準(zhǔn)合格的移液器(德國(guó)eppendorf公司)；A、B 2種不同品牌D-Bil試劑盒及配套校準(zhǔn)品、質(zhì)控品。

1.2實(shí)驗(yàn)樣本 收集檢測(cè)結(jié)果靠近線性范圍上、下限的中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院患者血清各1份，每份2 mL，無(wú)溶血、乳糜等干擾物。

1.3線性范圍驗(yàn)證

1.3.1樣品組制備和檢測(cè) 由于各標(biāo)準(zhǔn)均可以采用真實(shí)濃度不確定但已知相互關(guān)系的樣品組，因此本研究采用同一個(gè)用高、低值濃度按比例混合的樣品組進(jìn)行驗(yàn)證。收集接近聲明線性范圍濃度的高(H)、低(L)值混合血清2份，將L和H樣品按L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、H的比例混勻，得到6份樣品用于此次實(shí)驗(yàn)。WS/T 408—2012要求的檢測(cè)次數(shù)最少為3次，EP06-Ed2、EP06-A、WS/T 420—2013要求的檢測(cè)次數(shù)為2次，為方便比較，本研究將每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。檢測(cè)前保證儀器狀態(tài)正常，采用配套校準(zhǔn)品校準(zhǔn)儀器后檢測(cè)雙水平質(zhì)控品，質(zhì)控均在控再開始檢測(cè)，所有檢測(cè)在同一批次完成。檢測(cè)完成后，分別用EP06-Ed2、EP06-A、WS/T 408—2012、WS/T 420—2013中介紹的方法對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理并作出評(píng)價(jià)。EP06-Ed2發(fā)布后，理論上EP06-A應(yīng)不再被推薦使用，但EP06-A是存在時(shí)間較長(zhǎng)、使用范圍較廣的標(biāo)準(zhǔn)，因此，同時(shí)采用新舊2個(gè)版本進(jìn)行比較以展示其改進(jìn)內(nèi)容。

1.3.3EP06-A統(tǒng)計(jì)方法 首先需計(jì)算數(shù)據(jù)組的合成SD(SDr)或合成CV(CVr)，檢驗(yàn)其精密度是否符合要求， 然后以均值為因變量，稀釋度為自變量，進(jìn)行二元一次、二次和三次多項(xiàng)式回歸分析，判斷非線性系數(shù)b2和b3與0比較差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，若無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則認(rèn)為存在線性關(guān)系；若有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則說(shuō)明存在非線性，需要評(píng)價(jià)非線性度。通過(guò)比較回歸標(biāo)準(zhǔn)差(Sy,x)(Sy,x越小，說(shuō)明該模型越適合)，確定最佳擬合模型后，計(jì)算該模型每一個(gè)樣品的DL，即非線性模型與線性模型在每個(gè)濃度點(diǎn)的差值。當(dāng)每個(gè)濃度點(diǎn)的DL均小于實(shí)驗(yàn)室設(shè)定的允許誤差范圍時(shí)，該組數(shù)據(jù)線性驗(yàn)證通過(guò)。若有任意濃度點(diǎn)的DL超過(guò)允許誤差范圍時(shí)，驗(yàn)證失敗。

1.3.5WS/T 420—2013統(tǒng)計(jì)方法 對(duì)均值和稀釋度作普通最小二乘法(ordinary least squares，OLS)回歸，若回歸系數(shù)r2>0.995，則可初步判斷線性范圍符合要求，然后根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出每個(gè)樣品的預(yù)期濃度并計(jì)算實(shí)測(cè)濃度與預(yù)期濃度的偏差，若偏差均在設(shè)定的允許誤差范圍內(nèi)，則認(rèn)為線性范圍可接受；若有任意點(diǎn)偏差超過(guò)允許誤差范圍時(shí)，則認(rèn)為線性范圍不可接受。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用Excel和Medcalc對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果

2.1線性驗(yàn)證樣品檢測(cè)結(jié)果 用2種D-Bil試劑檢測(cè)6個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，結(jié)果見(jiàn)表1。作測(cè)定值與稀釋度的散點(diǎn)圖，目測(cè)無(wú)離群值。

表1 線性驗(yàn)證樣品檢測(cè)結(jié)果的均值、SD和CV

2.2EP06-Ed2 統(tǒng)計(jì)方法 表1顯示，A、B 2組數(shù)據(jù)的SD均隨著濃度升高有逐步增加的趨勢(shì)，適合WLS回歸。由于1號(hào)樣品的CV遠(yuǎn)大于其他樣品，因此不被納入精密度輪廓，1號(hào)樣品用實(shí)際SD計(jì)算權(quán)重。用2～6號(hào)樣品作為精密度輪廓，計(jì)算各樣品權(quán)重。繪制WLS回歸散點(diǎn)圖，計(jì)算回歸方程，分別為y=390.765x+1.690、y=417.642x+1.460。以CLIA′88允許總誤差(allowable total error，TEa)的1/2為D-Bil的ADL，即3.42 μmol/L或10%(取高值)。A試劑的2號(hào)樣本DL及其90%CI均在ADL范圍之外，說(shuō)明其線性不可接受；B試劑的所有樣品的DL及其90%CI均在ADL范圍內(nèi)，說(shuō)明其線性范圍可以接受。2種試劑線性驗(yàn)證的數(shù)據(jù)分析分別見(jiàn)表2和表3。圖1顯示了DL及90%CI和ADL的關(guān)系。

表2 A試劑EP06-Ed2線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析

表3 B試劑EP06-Ed2線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析

注：A,A試劑；B，B試劑；紅圈所示的2號(hào)樣品的DL及其90%CI落在陰影區(qū)域(10%ADL)之外。圖1 線性驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)分析(EP06-Ed2)

2.3EP06-A統(tǒng)計(jì)方法 設(shè)定D-Bil的允許不精密度誤差范圍為CLIA′88的1/3TEa，即2.28 μmol/L或8.33%(取高值)。A、B 2種試劑的SDr分別為1.471和1.511，均符合要求。多項(xiàng)式回歸分析顯示A試劑數(shù)據(jù)組最佳擬合模型為三階。B試劑數(shù)據(jù)組最佳擬合模型為二階，回歸曲線及方程見(jiàn)圖2。計(jì)算數(shù)據(jù)組的DL(μmol/L)和DL(%)，結(jié)果顯示2種試劑的1號(hào)樣品的DL(μmol/L)和DL(%)均超過(guò)ADL(見(jiàn)表4)，2種試劑的線性驗(yàn)證均不通過(guò)。

注：A,A試劑；B，B試劑。圖2 多項(xiàng)式回歸模型與線性模型

表4 線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析

2.4WS/T 408—2012統(tǒng)計(jì)方法 WS/T 408—2012建議用Grubbs法判斷重復(fù)檢測(cè)數(shù)據(jù)中是否存在離群值，經(jīng)檢驗(yàn)，A、B 2組數(shù)據(jù)均無(wú)離群值。多項(xiàng)式回歸方法與EP06-A相同，但WS/T 408—2012使用平均DL評(píng)價(jià)非線性度。經(jīng)計(jì)算，2組數(shù)據(jù)的回歸不精密度均小于界值，說(shuō)明2組數(shù)據(jù)的精密度好，可作線性評(píng)價(jià)。同時(shí)2組數(shù)據(jù)的平均DL均小于臨界值，說(shuō)明2組數(shù)據(jù)均有臨床可接受的非線性，A、B 2種試劑的線性驗(yàn)證均通過(guò)。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。

表5 線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析(WS/T 408—2012)

2.5WS/T 420—2013統(tǒng)計(jì)方法 WS/T 420—2013建議單個(gè)數(shù)據(jù)超過(guò)均值±4SD被判斷為離群值，經(jīng)計(jì)算,2組數(shù)據(jù)均無(wú)離群值。對(duì)2組數(shù)據(jù)作OLS回歸，得到的回歸系數(shù)分別為0.995 2、0.997 5，均大于0.995，可初步判斷線性范圍符合要求。繼續(xù)計(jì)算數(shù)據(jù)組平均值與預(yù)期值的差值，結(jié)果顯示2種試劑的1號(hào)樣品的DL(μmol/L)和DL(%)均超過(guò)允許誤差范圍，說(shuō)明2種試劑的線性驗(yàn)證均不通過(guò)。見(jiàn)表6。

表6 線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析(WS/T 420—2013)

2.64種驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)的簡(jiǎn)單比較 簡(jiǎn)單歸納了4種驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)的差異，見(jiàn)表7。對(duì)于A、B 2種試劑，4種線性驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)的判定結(jié)果存在差異。

表7 4種線性驗(yàn)證方法的比較

3 討論

各標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品類別的要求基本一致，在選擇樣品濃度時(shí)，各標(biāo)準(zhǔn)大多建議在聲明的線性范圍內(nèi)或者靠近線性范圍上、下限的濃度選擇樣品，EP06-Ed2首次詳細(xì)介紹了怎樣根據(jù)定量(線性)上、下限的精密度來(lái)調(diào)整高、低值樣品的濃度。在本研究中2種試劑聲明的線性范圍分別為1～393 μmol/L、1～410 μmol/L，濃度最高樣品的檢測(cè)值均未超過(guò)聲明線性范圍。

確定ADL是線性驗(yàn)證的關(guān)鍵步驟。實(shí)驗(yàn)室在設(shè)定ADL時(shí)，應(yīng)基于測(cè)量程序的臨床用途，EP06-Ed2認(rèn)為雖然ADL和TEa之間沒(méi)有明確的關(guān)系，但ADL大于1/2TEa是不正常的。制造商聲明的線性偏差也是制定ADL的重要參考，前提是聲明的偏差應(yīng)滿足臨床用途。ADL可以是固定值，也可以是相對(duì)值，或二者的組合取高值，如本研究設(shè)定的ADL為3.42 μmol/L或10%(取高值)。

WS/T 408—2012更側(cè)重于對(duì)臨床是否滿足需要的判斷，本研究結(jié)果顯示，2種試劑的線性驗(yàn)證均獲通過(guò)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)最寬松，但散點(diǎn)圖(圖1)顯示在高濃度處A試劑的數(shù)據(jù)與B試劑數(shù)據(jù)相比明顯向下彎曲，平均DL的統(tǒng)計(jì)方法可能掩蓋了某些濃度點(diǎn)出現(xiàn)較大偏差的情況；同時(shí)，WS/T 408—2012的判斷界值均采用PctBnd=5%的標(biāo)準(zhǔn)，與檢測(cè)系統(tǒng)的性能及驗(yàn)證項(xiàng)目的生物學(xué)變異等特性無(wú)關(guān)?？傮w來(lái)說(shuō)，WS/T 408—2012是基于內(nèi)部統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行全局通過(guò)或失敗的評(píng)估，不能提供任何偏離線性的位置、大小和意義的信息。

EP06-A和WS/T 420—2013判定2種試劑線性驗(yàn)證均失敗，失敗的原因均是最低濃度樣品的線性偏差超出允許誤差范圍，二者的線性模型均采用OLS回歸，這在樣品組的重復(fù)性SD保持恒定時(shí)是合適的，但當(dāng)SD明顯依賴于濃度時(shí)，低、高濃度樣品對(duì)直線與線性數(shù)據(jù)的擬合產(chǎn)生的影響將不成比例，低濃度樣品很有可能由于較高的相對(duì)偏差而超過(guò)允許誤差范圍，此時(shí)增加低濃度處特別是醫(yī)學(xué)決定水平處的樣本數(shù)重新驗(yàn)證，有可能降低高濃度樣品對(duì)回歸模型的影響，更簡(jiǎn)單的方法是采用WLS回歸。WLS回歸可減少因偶然誤差導(dǎo)致驗(yàn)證失敗的情況，這也是EP06-Ed2強(qiáng)烈推薦采用WLS回歸的原因。從實(shí)際應(yīng)用來(lái)看，在本研究中WLS回歸使低濃度樣本的DL明顯變小，從而使B試劑的線性獲得通過(guò)，同時(shí)又不使線性稍差的A試劑驗(yàn)證通過(guò)，這種判斷尺度最合理。

用EP06-Ed2的方法分析時(shí)，2種試劑均未出現(xiàn)DL在ADL之外而90%CI與ADL相交叉的情況，因此A試劑驗(yàn)證失敗和B試劑驗(yàn)證通過(guò)的結(jié)論是確定的。90%CI的加入使EP06-Ed2作出結(jié)論時(shí)變得更靈活。當(dāng)出現(xiàn)這種交叉的情況時(shí)，EP06-Ed2的解釋為：線性在統(tǒng)計(jì)上是可以接受的，如果整體性能特征足以滿足臨床要求，實(shí)驗(yàn)室有理由接受線性研究的結(jié)果；當(dāng)整體性能特征不足以滿足臨床要求(如超過(guò)TEa要求)時(shí)，不應(yīng)接受該線性。

從計(jì)算的復(fù)雜程度來(lái)看，WS/T 420—2013的統(tǒng)計(jì)分析最簡(jiǎn)單；EP06-A、WS/T 408—2012的多項(xiàng)式回歸統(tǒng)計(jì)分析步驟較繁瑣， EP06-Ed2放棄了EP06-A的多項(xiàng)式回歸算法，更接近WS/T 420—2013的計(jì)算方法，但比WS/T 420—2013增加了加權(quán)回歸以及90%CI的計(jì)算步驟，計(jì)算量適中。

查閱近5年的資料發(fā)現(xiàn)，國(guó)外文獻(xiàn)在評(píng)估生化免疫類檢測(cè)系統(tǒng)線性時(shí)，大多采用EP06-A。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)采用EP06-A[7]和WS/T 408—2012[8]的較多，采用WS/T 420—2013的較少，近年來(lái)已逐漸有采用EP06-Ed2驗(yàn)證的文獻(xiàn)發(fā)表[9]。還有部分文獻(xiàn)采用了其他驗(yàn)證方法，如《臨床檢驗(yàn)質(zhì)量管理技術(shù)基礎(chǔ)》[10]、CNAS-GL037《臨床化學(xué)定量檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》中介紹的方法。

本研究主要從用戶體驗(yàn)方面入手，對(duì)4種線性驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了簡(jiǎn)單比較，詳細(xì)演示了這些標(biāo)準(zhǔn)的驗(yàn)證過(guò)程，希望對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室掌握其驗(yàn)證步驟及計(jì)算方法有所幫助。對(duì)于同一組線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)，不同標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)論可能不一致，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際用途以及數(shù)據(jù)組的特點(diǎn)選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗(yàn)證。EP06-Ed2是目前最新、最全面、最合理(對(duì)于本研究數(shù)據(jù)而言)的線性驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)，值得推薦，EP06-A不應(yīng)再被使用。實(shí)驗(yàn)室也可先采用計(jì)算最簡(jiǎn)單的WS/T 420—2013的方法，當(dāng)驗(yàn)證不通過(guò)時(shí)，再采用EP06-Ed2或WS/T 408—2012的方法繼續(xù)統(tǒng)計(jì)分析，前者采用WLS回歸分析以及90%CI可減少因偶然誤差導(dǎo)致驗(yàn)證失敗的情況，后者側(cè)重于臨床標(biāo)準(zhǔn)以及數(shù)據(jù)組的平均DL，更容易通過(guò)，最后再考慮縮小范圍重新驗(yàn)證。WS/T 420—2013、WS/T 408—2012均已發(fā)布10年，我國(guó)新版的定量驗(yàn)證程序即將發(fā)布，屆時(shí)將為臨床實(shí)驗(yàn)室提供更全面的指導(dǎo)。