Let?7b靶向抑制樹突狀細(xì)胞Bach1通過激活HO?1調(diào)控腸黏膜的損傷修復(fù)

田元元 覃曉日 田閣 符雪婷 孫曉寧

1海南省人民醫(yī)院（海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院）消化內(nèi)科（?？?570311）；3海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院（?？?570216）；2北京市先農(nóng)壇體育運(yùn)動(dòng)技術(shù)學(xué)校科研科（北京 100050）；4海南醫(yī)學(xué)院（?？?571199）

炎癥性腸病（inflammatory bowel diseases，IBD）是一種由潛在的免疫失調(diào)誘導(dǎo)的特發(fā)性、慢性、復(fù)發(fā)性炎癥狀態(tài)，包括兩種主要的臨床形式：潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn′s disease，CD）[1-2]。IBD已成為一種全球性疾病，其發(fā)病率不斷增加，目前影響著北美、歐洲、南美、中東和亞洲越來越多的人群[1-3]。盡管已建立了標(biāo)準(zhǔn)的治療方法，例如抗腫瘤壞死因子抗體治療[3-4]，但目前尚未完全明確導(dǎo)致IBD的潛在因素和機(jī)制。仍需要進(jìn)一步的科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究來探索IBD發(fā)展機(jī)制，從而為IBD的新療法和藥物靶點(diǎn)提供新的視角。

血紅素加氧酶 1（heme oxygenase?1，HO?1）是一種抗氧化反應(yīng)元件依賴性基因，具有抗氧化和抗炎功能[5-6]。HO?1的轉(zhuǎn)錄被則被另一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TB和CNC同源性1（TB and CNC homology 1，Bach1）通過結(jié)合前者增強(qiáng)子中多個(gè)Maf識(shí)別元件所抑制[7]。而且，HO?1的表達(dá)則需要 Bach1失活或被抑制[8]。但Bach1是如何失活的仍不清楚。以前的研究報(bào)道，在IBD條件下，HO?1水平上調(diào)[5]。已知樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）是最重要的抗原提呈細(xì)胞。其在固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中都起到重要作用，能夠介導(dǎo)IBD炎癥反應(yīng)或者參與免疫耐受，而且Bach1/HO?1通路能夠密切調(diào)控 DCs[9]。然而，在 DCs中的 Bach1和HO?1如何參與調(diào)控IBD并不清楚。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類高度保守的小單鏈RNA，其長(zhǎng)度通常在21～25個(gè)核苷酸之間。眾所周知，miRNA通過使用種子序列靶向mRNA的 3′非翻譯區(qū)（3′?UTR）來抑制基因表達(dá)，最終導(dǎo)致靶向mRNA的降解或靶向蛋白質(zhì)的抑制[10-11]。因此，miRNAs在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用[12]。不僅如此，miRNA還廣泛參與多種生理和病理過程[13]。miRNA的失調(diào)導(dǎo)致包括IBD在內(nèi)的多種疾病的發(fā)展和進(jìn)展[14]。Let?7 miRNA家族是最早在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)miRNA之一，是第一個(gè)已知的人類miR?NA，由 Let?7a、b、c、d、e、f、g、i和 miR?98 miRNA 組成。Let?7家族已被發(fā)現(xiàn)可在人類腸道發(fā)育和腸癌、腸炎中發(fā)揮重要作用[15]。而且最新研究顯示Let?7b在CD中參與調(diào)控了巨噬細(xì)胞的免疫功能并抑制了炎癥[16]。由于Let?7、HO?1、Bach1在IBD發(fā)病機(jī)制中均扮演關(guān)鍵角色，因此，本研究旨在觀察DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠模型中HO?1和Bach1的表達(dá)，隨后利用生物信息學(xué)篩選了抗炎miRNA Let?7b作為DCs細(xì)胞中調(diào)控Bach1的關(guān)鍵上游基因。探討Let?7b是否介導(dǎo)DCs中Bach1的失活來促進(jìn)HO?1表達(dá)，是否對(duì)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的損傷修復(fù)發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠DCs細(xì)胞DC2.4購于長(zhǎng)沙豐暉生物。小鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞MCEC購于上海青旗生物技術(shù)有限公司。C57BL/6小鼠購自海南藥物研究所有限責(zé)任公司。胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司。DMEM培養(yǎng)基購于美國Invitrogen公司。Trizol試劑購于美國Sigma公司。TaqMan miRNA探針購于美國Applied Biosystems公司。SYBR Green染料購于美國Ambion公司。ChamQ SYBR qPCR Master Mix購于中國Vazyme公司。鹽酸表小檗堿（Epiber?berine Chloride，EC）和鋅原卟啉（zinc protoporphy?rin，ZnPP）購于美國sigma公司。PMSF和RIPA裂解緩沖液購于上海Beyotime公司。購于BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒購于美國Thermo Scientific公司。pMIR?report熒光素酶載體購自美國Ambion公司。EdU原位細(xì)胞增殖試劑盒購于美國RiboBio公司。Let?7b擬似物、Let?7b擬似物陰性對(duì)照、Let?7b 抑制劑、Let?7b抑制劑陰性對(duì)照購于上海吉瑪公司。蘇木素?伊紅（HE）染色試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。螢光素酶測(cè)定試劑盒購于美國Promega Madison公司。

1.2 方法

1.2.1 葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型和病理分析所有用于實(shí)驗(yàn)的12只6周齡C57BL/6小鼠均在無特定病原體條件下飼養(yǎng)，小鼠進(jìn)行自由攝入嚙齒類動(dòng)物食物并自由取水，本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批通過。為建立結(jié)腸炎小鼠模型，用隨機(jī)數(shù)字表法將12只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常組和模型組2組，每組6只。模型組的干預(yù)方法是在小鼠的飲用水中加入了3%葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS），小鼠自由飲水和攝食，持續(xù)飲水7 d。給予正常組小鼠正常飲水（飲水中不加入任何藥物），持續(xù)7 d。在整個(gè)造模期間每天監(jiān)測(cè)模型組和正常組小鼠的體重。疾病活動(dòng)度（disease activity index，DAI）評(píng)分按照DAI=體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)＋大便性狀分?jǐn)?shù)＋便血情況分?jǐn)?shù)）/3進(jìn)行計(jì)算。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠。收集這2組腸道組織，即選取模型組中清潔后的病變明顯的新鮮腸組織約1.0 cm，正常組則按照模型組取樣位置取同節(jié)段的新鮮腸組織1.0 cm。2組中剪0.5 cm組織用于 Let?7b的表達(dá)分析和Bach1及 HO?1蛋白表達(dá)的分析。其余腸組織置于4%甲醛溶液中固定，然后進(jìn)行石蠟包埋及切片，最后根據(jù)HE染色試劑盒提供的說明進(jìn)行結(jié)腸組織HE染色分析其病理情況。組織病理學(xué)評(píng)分=上皮損傷＋損傷程度。

1.2.2 小鼠DCs細(xì)胞的培養(yǎng)、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以及蛋白抑制劑處理37℃溫度下，在含5% CO2的濕潤(rùn)空氣環(huán)境中將DC2.4細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)充有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，并同時(shí)添加青霉素（100 U/mL）和鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)1～2 d更換新鮮培養(yǎng)基，3 d傳代1次，DC2.4細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于Bach1強(qiáng)效抑制藥鹽酸表小檗堿（epiberberine chloride，EC）、HO?1特異性抑制劑鋅原卟啉（zinc protopor?phyrin，ZnPP）的干預(yù)，以及 Let?7b 擬似物或 Let?7b抑制劑的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

將DC2.4細(xì)胞共分為Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組、Ⅶ組，共7組：（Ⅰ）空白對(duì)照組（細(xì)胞不進(jìn)行任何藥物干預(yù)）；（Ⅱ）Let?7b擬似物陰性對(duì)照組（用Lipofectamine 2000試劑，將2 nmol/L的Let?7b擬似物陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h）；（Ⅲ）Let?7b擬似物轉(zhuǎn)染組（用Lipofectamine 2000試劑，將2 nmol/L的Let?7b擬似物轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h）；（Ⅳ）Let?7b抑制劑陰性對(duì)照組（用Lipofectamine 2000試劑，將2 nmol/L的Let?7b抑制劑陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h）；（Ⅴ）Let?7b抑制劑轉(zhuǎn)染組（用 Lipofect?amine 2000試劑，將 2 nmol/L 的 Let?7b抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h）；（Ⅵ）Let?7b抑制劑聯(lián)合EC干預(yù)組（將2 nmol/L的 Let?7b抑制劑序列和 20 μg的 EC聯(lián)合處理DCs 24 h）；（Ⅶ）Let?7b抑制劑、EC、ZnPP三種藥物共處理干預(yù)組（將2 nmol/L的Let?7b抑制劑序列、20 μmol/L 的 EC、6 μmol/L 的 ZnPP 聯(lián)合處理DCs 24 h）。細(xì)胞干預(yù)結(jié)束，收集各組DCs和培養(yǎng)物上清液用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 RNA分離和定量RT?PCR（qRT?PCR）用Trizol試劑分離1.2.1中留取的腸組織中的總RNA以及1.2.2中各組DC2.4細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的總RNA。使用SYBR Green以及特異性引物定量各組腸組織和各組DC2.4細(xì)胞中的Let?7b，并定量DC2.4細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的Bach1和HO?1 mRNA。使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR和定量RT?PCR（qRT?PCR）。在qRT?PCR反應(yīng)后，循環(huán)閾值（CT）數(shù)據(jù)被標(biāo)準(zhǔn)化，miRNA的內(nèi)參基因?yàn)閁6和，mRNA的內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。計(jì)算公式包括：△△CT=（CT miRNA-CT U6）觀察組-（CT miRNA-CT U6）對(duì)照組；△△CT=（CT mRNA-CT GAPDH）觀察組-（CT mRNA-CT GAPDH）對(duì)照組，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 蛋白提取和蛋白免疫印跡（Western blot，WB）使用補(bǔ)充有苯甲基磺酰氟（phenylmethane?sulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA裂解緩沖液提取1.2.1中留取的腸組織中的總蛋白以及1.2.2中各組DC2.4細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的總蛋白，所有組的蛋白濃度使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒進(jìn)行定量。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodi?um dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS?PAGE）分離蛋白，通過濕轉(zhuǎn)法將電泳膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜上，膜在含5%脫脂奶粉和0.1%吐溫?20的PBS中封閉，然后與一抗在4℃孵育過夜。一抗稀釋倍數(shù)和抗體信息如下：Bach1（ab49657，1∶1 000，abcam），HO?1（#43966S，1∶1 000，Cell Signaling Technology），磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde?phosphate dehydrogenase，GA?PDH）（sc?25778，1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology）。然后將膜與IgG二抗（稀釋1∶10 000）孵育1 h。用柯達(dá)1DV3.6計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)進(jìn)行各條帶的相對(duì)灰度值測(cè)定，內(nèi)參蛋白為GAPDH。

1.2.5 螢光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)pMIR?report熒光素酶載體購自Ambion。將含有Let?7b結(jié)合位點(diǎn)的Bach1 3?′UTR并克隆到pMIR?report熒光素酶載體中以構(gòu)建野生型（WT）螢光素酶質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒的DC2.4細(xì)胞分別與Let?7b擬似物或Let?7b抑制劑共轉(zhuǎn)染。然后使用螢光素酶測(cè)定試劑盒測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.2.6 Edu法檢測(cè)小鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖利用48孔培養(yǎng)板觀察MCEC細(xì)胞的增殖。48孔板中首先分別加入1.2.2中Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組、Ⅶ組的DC2.4細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液各150 μL，隨后接種100 μL含2 × 105/mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCEC細(xì)胞，培養(yǎng)基為含10% FBS的DMEM。以觀察不同處理的DCs的培養(yǎng)液對(duì)MCEC細(xì)胞增殖的影響。培養(yǎng)體系置于溫度為37℃含5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。隨后去掉原培養(yǎng)基，將各組處理好的MCEC細(xì)胞按照試劑盒說明加入到EdU原位細(xì)胞增殖試劑中孵育2 h，按照方案說明，用熒光顯微鏡捕捉細(xì)胞的核，并測(cè)定Edu陽性細(xì)胞的比例。

1.2.7 小鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的傷口愈合試驗(yàn)利用48孔培養(yǎng)板觀察MCEC細(xì)胞的增殖。48孔板中首先分別加入1.2.2中Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組、Ⅶ組的DC2.4細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液各150 μL，隨后接種100 μL含2 × 105/mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCEC細(xì)胞，培養(yǎng)基為含10% FBS的DMEM。培養(yǎng)體系置于溫度為37℃含5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中，在培養(yǎng)6 h時(shí)在每個(gè)孔的中軸線上劃痕，并在劃痕后0 h和24 h拍攝后計(jì)算劃痕的寬度和傷口愈合率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本研究數(shù)據(jù)使用（）表示。用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)本研究中各組數(shù)據(jù)的分布和差異顯著性。初步分析的結(jié)果為正態(tài)分布。正常組和模型組2組中基因表達(dá)差異的分析使用t檢驗(yàn)。Ⅰ～Ⅶ組的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的差異使用單因素方差分析，存在差異后的兩兩比較采用LSD?t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3個(gè)批次，均得到一致的結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)包括每個(gè)處理組至少3個(gè)重復(fù)的樣本。

2 結(jié)果

2.1 Bach1和HO?1在IBD結(jié)腸炎炎癥組織中的表達(dá)通過給予小鼠3%DSS 7 d構(gòu)建了結(jié)腸炎小鼠模型，使用WB法檢測(cè)模型組和正常組中Bach1和HO?1的表達(dá)情況。結(jié)果，與正常組的腸組織相比，模型組中的Bach1顯著下調(diào)，而HO?1的表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A?C。

圖1 DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠炎癥組織中Bach1和HO?1的表達(dá)Fig.1 Expression of Bach1 and HO?1 in the inflammatory tissue of DSS?induced colitis mice

以DAI評(píng)分、HE染色、組織病理學(xué)評(píng)分綜合判斷小鼠IBD結(jié)腸炎模型是否建立成功。首先大體觀測(cè)發(fā)現(xiàn)正常組小鼠的狀態(tài)活躍且健康，體質(zhì)量未見減輕。而模型組所有小鼠欠活躍，體質(zhì)量持續(xù)減輕，而且給予3%DSS 3 d小鼠均出現(xiàn)肉眼便血和大便不成形現(xiàn)象，DSS 7 d模型組所有小鼠均出現(xiàn)無糞質(zhì)排便，而僅有鮮血。另外，正常組DAI評(píng)分7 d內(nèi)不高于1分。而模型組2～7 d DAI的評(píng)分依次達(dá)到（1.52±0.15）、（2.11±0.32）、（2.48 ± 0.22）、（2.72 ± 0.44）、（3.16 ± 0.30）、（3.73±0.17）。正常組和模型組的結(jié)腸組織的HE染色圖片在光鏡下對(duì)比明顯，正常組未見炎癥浸潤(rùn)的細(xì)胞，且組織結(jié)構(gòu)完好，上皮形態(tài)致密。模型組則出現(xiàn)黏膜水腫、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、隱窩扭曲且隱窩顯著減少，組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。而且模型組的組織病理學(xué)評(píng)分達(dá)到（8.48±0.57），正常組為（0.76±0.06）。表明DSS成功誘導(dǎo)IBD結(jié)腸炎小鼠模型，造模成功率100%，DSS誘導(dǎo)7 d內(nèi)小鼠病死率為0%。見圖1D-E。

2.2 DCs中過表達(dá)Let?7b抑制Bach1并促進(jìn)HO?1分泌DCs中過表達(dá)或沉默Let?7b后對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中Bach1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示Let?7b過表達(dá)明顯抑制DCs培養(yǎng)物上清液中Bach1蛋白表達(dá)水平，而Let?7b沉默促進(jìn)Bach1表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Let?7b過表達(dá)明顯促進(jìn)了細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中HO?1的表達(dá)而沉默則抑制了細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中HO?1的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A?C。還檢測(cè)了結(jié)腸炎小鼠腸組織中Let?7b的表達(dá)水平，與正常組（1.00±0.06）比，模型組（4.26 ± 0.39）Let?7b的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。應(yīng)用Pearson相關(guān)分析來研究Bach1和HO?1與Let?7b之間的關(guān)系。如圖所示，結(jié)腸炎小鼠中Let?7b的表達(dá)與Bach1呈負(fù)相關(guān)，而 Let?7b與 HO?1呈正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2D-E。

圖2 Let?7b對(duì)DCs培養(yǎng)物上清液中Bach1和HO?1表達(dá)的影響Fig.2 Effect of Let?7b on Bach1 and HO?1 expression in DCs culture supernatant

2.3 Let?7b通過直接與Bach1的3′?UTR結(jié)合通過生物信息學(xué)方法分析出Let?7b潛在的靶基因基因?yàn)锽ach1。因此，在這部分進(jìn)一步研究了Bach1是否被Let?7b靶向負(fù)調(diào)控。生物信息學(xué)分析揭示了Let?7b和 Bach1的 3′?UTR 處的潛在結(jié)合位點(diǎn)。為證明 Let?7b 在 Bach1 3′?UTR 處的直接結(jié)合，在DC2.4細(xì)胞過表達(dá)（Let?7的模擬物）和抑制Let?7的條件下進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定。發(fā)現(xiàn)熒光素酶活性是受Let?7過表達(dá)的負(fù)調(diào)控，受Let?7抑制的正調(diào)控。結(jié)果表明，Let?7b過表達(dá)時(shí)熒光素酶活性顯著降低，而Let?7b沉默組的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，見圖3。

圖3 Let?7b與Bach1的3′?UTR直接結(jié)合Fig.3 Direct binding of Let?7b to the 3′?UTR of Bach1

2.4 Let?7b通過抑制Bach1并促進(jìn)HO?1分泌增加結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖和傷口愈合見圖4和表2，DCs中過表達(dá)Let?7b顯著抑制培養(yǎng)物上清液中Bach1的mRNA水平，并提高了培養(yǎng)物上清液HO?1 mRNA水平和結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的Edu陽性率（P＜ 0.05），當(dāng)沉默Let?7b時(shí)培養(yǎng)物上清液中Bach1的mRNA水平增加（P＜0.05），而結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的Edu陽性率明顯降低（P＜0.05）。另外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，沉默Let?7b可促進(jìn)靶基因Bach1的表達(dá)，而在此基礎(chǔ)上抑制Bach1則可大幅度恢復(fù)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的Edu陽性率（P＜0.05），而繼續(xù)加入HO?1抑制劑則Edu陽性率又降低（P＜0.05），而研究結(jié)果還顯示，HO?1抑制劑明顯抑制了HO?1 mRNA（P＜0.05），而Bach1的mRNA水平不受HO?1抑制劑的影響（P＞0.05）。

圖4 Let?7b體外抑制Bach1調(diào)控HO?1的分泌促進(jìn)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖Fig.4 Let?7b inhibits Bach1 and regulates HO?1 secretion to promote proliferation of colonic mucosal epithelial cells in vitro

表2 Let?7b抑制Bach1的分泌從而促進(jìn)HO?1分泌增加MCEC細(xì)胞的Edu陽性率Tab.2 Let?7b inhibited Bach1 secretion and promoted HO?1 secretion to increase Edu positive rate of MCEC cells±s

表2 Let?7b抑制Bach1的分泌從而促進(jìn)HO?1分泌增加MCEC細(xì)胞的Edu陽性率Tab.2 Let?7b inhibited Bach1 secretion and promoted HO?1 secretion to increase Edu positive rate of MCEC cells±s

注：與Ⅰ組比，aP ＜0.05；與Ⅱ組比，bP ＜0.05；與Ⅳ組比，cP ＜0.05；與Ⅴ組比，dP ＜0.05；與Ⅵ組比，eP ＜0.05

組別Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組Ⅴ組Ⅵ組Ⅶ組F值P值Edu陽性率（%）84.63±4.05 85.02±3.63 92.25±2.38ab 85.13±4.72 26.43±2.71ac 71.02±5.24ad 27.14±4.06ae 85.663 0.021 Bach1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平1.00±0.03 0.99±0.08 0.14±0.01ab 1.00±0.03 8.39±1.22ac 0.09±0.02ad 0.10±0.01ad 208.211＜0.001 HO?1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平1.00±0.02 0.99±0.05 13.58±1.27ab 0.99±0.08 0.35±0.02ac 14.04±0.74ad 0.07±0.01ade 352.450＜0.001

進(jìn)一步研究DCs中 Let?7b調(diào)控Bach1 和 HO?1在培養(yǎng)物上清液中的表達(dá)從而對(duì)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞傷口愈合率的影響。結(jié)果如圖5顯示，Let?7b過表達(dá)提高結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞傷口愈合率，而當(dāng)沉默Let?7b時(shí)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的傷口愈合率明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。另外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與單獨(dú)沉默 Let?7b組比，沉默Let?7b聯(lián)合Bach1抑制劑則可明顯恢復(fù)傷口愈合，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而繼續(xù)加入HO?1抑制劑傷口愈合率則被抑制（P＜0.05），表明，Bach1是Let?7b調(diào)控結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞增殖和傷口愈合的直接調(diào)控靶點(diǎn)，HO?1是 Let?7b/Bach1軸調(diào)控結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞增殖和傷口愈合的下游靶點(diǎn)。

圖5 Let?7b抑制Bach1從而調(diào)控HO?1的分泌促進(jìn)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的傷口愈合Fig.5 Let?7b inhibits Bach1 and regulates HO?1 secretion to promote wound healing in colonic mucosal epithelial cells

3 討論

本研究中，觀察了DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠模型中HO?1和Bach1的表達(dá)。利用生物信息學(xué)篩選出一種靶向Bach1的關(guān)鍵抗炎miRNA Let?7b。為研究Let?7b簇對(duì)HO?1的潛在調(diào)節(jié)作用，綜合使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、基因表達(dá)檢測(cè)、沉默和過表達(dá)目標(biāo)miRNA等策略結(jié)合蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖和傷口愈合實(shí)驗(yàn)。最終證實(shí)Let?7b恰好通過與Bach1的3′?UTR的結(jié)合來抑制Bach1的表達(dá)。在體外進(jìn)一步證實(shí)Let?7b/Bach1/HO?1這一條潛在調(diào)控軸。最后使用DCs培養(yǎng)物上清液和結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，經(jīng)過Edu細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)得出，Let?7b在結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞增殖和損傷修復(fù)中的保護(hù)作用?？傊狙芯拷沂綥et?7b/Bach1/HO?1軸的差異表達(dá)在保護(hù)腸黏膜炎癥不受損傷中起到重要作用，并為IBD治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

IBD是一種與強(qiáng)烈氧化應(yīng)激損傷相關(guān)的自身免疫性疾病[17]。由腸上皮屏障驅(qū)動(dòng)的腸黏膜免疫失衡可能是IBD的病因之一。IBD的主要免疫調(diào)控角色是DCs、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。其中DCs是免疫系統(tǒng)中最有效的抗原呈現(xiàn)細(xì)胞，然而DCs在IBD條件下是如何發(fā)揮作用，以及受何種機(jī)制調(diào)控并不十分明確。已知DCs在IBD黏膜中會(huì)表現(xiàn)出顯示促炎特性，從而推動(dòng)IBD疾病進(jìn)展[18]。另外，HO?1已被證實(shí)可以抑制DCs的成熟和促炎功能，Bach1可以抑制該功能[19-21]，暗示DCs在IBD中很可能也通過Bach1/HO?1軸發(fā)揮促炎和免疫調(diào)控功能。本研究中證實(shí)了IBD中Bach1的蛋白表達(dá)明顯升高，而HO?1的表達(dá)水平降低，而且在DCs中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的機(jī)制即Let?7b可以靶向Bach1，導(dǎo)致DCs培養(yǎng)物上清液中Bach1的表達(dá)被抑制，反而促進(jìn)了DCs培養(yǎng)物上清液中HO?1的表達(dá)。已知在IBD模型中，通過激活DCs促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，而姜黃素可以通過抑制DCs活性來改善實(shí)驗(yàn)性腸炎的炎癥[22]。作為響應(yīng)氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)程序的主要調(diào)節(jié)劑，通過激活HO?1等細(xì)胞保護(hù)酶對(duì)結(jié)腸炎具有顯著的保護(hù)作用[23]。研究表明，HO?1在結(jié)腸炎的活動(dòng)性炎癥結(jié)腸中顯著升高，并保護(hù)腸黏膜屏障免受炎癥損傷和氧化應(yīng)激，而且降低小鼠HO?1的水平可以增加對(duì)結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌的易感性[8，24]。然而，在炎癥過程中調(diào)節(jié)的機(jī)制仍然難以捉摸。正如本研究前言部分提到的，HO?1激活需要Bach1的失活[8]。因此目前需要闡明Bach1失活的原因。

miRNA是一類重要的轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控因子，主要通過翻譯調(diào)控和mRNA的失穩(wěn)發(fā)揮作用。在哺乳動(dòng)物中，miRNAs被預(yù)測(cè)調(diào)節(jié)超過60%的蛋白編碼基因。Bach1是HO?1基因表達(dá)的重要抑制因子，而且 Bach1 的 3′?UTR（3313 nt）較長(zhǎng)，這為推測(cè)miRNA結(jié)合提供了更大的機(jī)會(huì)。本研究中利用雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明了Let?7b與Bach1的3′?UTR的多個(gè)堿基結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄后水平直接抑制Bach1 mRNA和蛋白分泌到細(xì)胞外，隨后緩解Bach1介導(dǎo)的HO?1抑制。另一方面，在Let?7b誘導(dǎo)Bach1表達(dá)減少的前提下，可以直接刺激HO?1的啟動(dòng)子啟動(dòng)HO?1轉(zhuǎn)錄[8]。通過這兩種功能途徑，Let?7b/Bach1/HO?1 調(diào)節(jié)軸則極大增強(qiáng)了IBD炎癥過程中HO?1的表達(dá)水平。Let?7b過表達(dá)后的DCs培養(yǎng)物上清液可提高結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖活性和細(xì)胞傷口愈合，這歸功于Let?7b過表達(dá)抑制Bach1的分泌從而導(dǎo)致HO?1分泌增加或者大幅度激活。因?yàn)榕cLet?7b抑制劑單獨(dú)處理組比，Let?7b抑制劑聯(lián)合Bach1抑制劑共處理DCs后的培養(yǎng)物上清液能增強(qiáng)MCEC的增殖活性和傷口愈合能力，但 Let?7b、Bach1、HO?1三者抑制劑共處理DCs后的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液則抑制了結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖活性并減弱了細(xì)胞傷口愈合能力。另外，還觀察到DCs細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中Bach1水平不受HO?1抑制劑影響，但是Bach1抑制劑可以明顯促進(jìn)DCs細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中HO?1的水平。這進(jìn)一步證實(shí)，HO?1是Let?7b/Bach1軸調(diào)控結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞增殖和傷口愈合的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)，Let?7b則是Bach1表達(dá)減少的直接上游調(diào)控靶點(diǎn)。

然而，這項(xiàng)研究仍存在一些局限性。例如，考慮到實(shí)驗(yàn)操作的可行性，只通過體外實(shí)驗(yàn)開展DCs細(xì)胞培養(yǎng)物上清液對(duì)MCEC細(xì)胞增殖和傷口愈合實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證預(yù)測(cè)的結(jié)果，而沒有涉及動(dòng)物體內(nèi)的機(jī)制探討。在IBD的過程中，炎癥破壞了黏膜屏障，腸腔內(nèi)的DCs等遞送抗原激活免疫細(xì)胞，進(jìn)一步加劇了黏膜屏障的破壞。眾所周知，IBD的特點(diǎn)是腸黏膜上皮細(xì)胞的愈合能力受損，例如增殖和遷移功能受損[25]。本研究中DCs通過分泌關(guān)鍵基因從而影響了結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖和遷移功能，因?yàn)橛^察到DCs中過表達(dá)Let?7b可通過抑制Bach1的分泌而促進(jìn)HO?1在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的表達(dá)，從而促進(jìn)了結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖和遷移，這表明Let?7b參與了IBD進(jìn)展中的腸黏膜損傷修復(fù)，涉及到DCs細(xì)胞和結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞形成的細(xì)胞環(huán)境系統(tǒng)。因此在本課題的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將深入探討IBD體內(nèi)外環(huán)境中Let?7b/Bach1/HO?1軸在DCs?腸黏膜上皮系統(tǒng)中的關(guān)鍵調(diào)控作用和機(jī)制。

總之，在本研究中確定了DCs細(xì)胞中Let?7b靶向抑制Bach1并激活HO?1的分泌從而保護(hù)腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖活性和傷口愈合活性。本研究擴(kuò)展了Bach1/HO?1軸調(diào)節(jié)IBD過程的理解，并強(qiáng)調(diào)了Let?7b在IBD中的促再生和損傷修復(fù)作用。本研究將為IBD治療提供新的治療靶點(diǎn)。