長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINP1抑制DNA損傷促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌電離輻射抗性

張春婷 梁梟婷 王樂(lè) 周良

南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（廣東省熱帶病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）毒理學(xué)系（廣州 510515）

肺癌是對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，死亡率僅次于心臟病，在所有腫瘤中發(fā)病率和病死率最高[1-2]，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型，約占肺癌發(fā)病率的85%[3]。目前，肺癌的治療手段主要是手術(shù)、放療、化療等。由于早期NSCLC患者癥狀隱匿，確診時(shí)大多已是晚期，病情發(fā)展迅速、預(yù)后差，無(wú)法施行手術(shù)治療，因此較依賴于放射治療[4]。直接或者間接造成DNA損傷從而消滅腫瘤細(xì)胞是放射治療的主要?dú)麢C(jī)制，然而大多數(shù)晚期肺癌對(duì)放射治療具有較高的抗性，患者5年生存率很低[5-6]。因此，如何減弱NSCLC患者放療抗性是目前肺癌治療中亟需解決的重要課題，研究影響NSCLC放射治療下DNA損傷效應(yīng)的因素，尋找更有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)降低NSCLC患者電離輻射抗性、促進(jìn)NSCLC的臨床治療提供新思路具有重要意義。

近年來(lái)，生物靶向治療日益成熟，其與放射治療的聯(lián)合運(yùn)用的研究也受到廣泛關(guān)注[7-8]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，LncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸、不具備蛋白編碼能力的RNA分子[9-10]。異常的LncRNA表達(dá)可能參與誘導(dǎo)或抑制癌癥的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和化學(xué)抗性的產(chǎn)生[11-12]。非同源末端連接途徑長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 1（lncRNA in non?homologous end joining pathway 1，LINP1）與多種腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，其表達(dá)和功能受p53和表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)調(diào)節(jié)[13-15]。沉默LINP1會(huì)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)乳腺癌放療的敏感性[16]。在胰腺癌中，LINP1能夠通過(guò)調(diào)節(jié)microRNA?491?3p來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，從而影響患者的淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率和預(yù)后[17]。在食管鱗狀細(xì)胞癌中[13]，敲減 LINP1 可以抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展，且LINP1能作為其預(yù)后指標(biāo)。在甲狀腺癌中[18]，高表達(dá)的LINP1通過(guò)抑制AMPK信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖并阻抑其凋亡。目前，LINP1對(duì)肺癌進(jìn)展尤其是對(duì)肺癌放療抗性的影響尚未明確。

本研究比較了NSCLC細(xì)胞在模擬放射治療條件下電離輻射照射后LINP1表達(dá)水平的變化，分析了在電離輻射條件下，敲減LINP1對(duì)肺癌細(xì)胞H1299的活力和DNA損傷效應(yīng)的影響。通過(guò)研究LINP1在放射治療中對(duì)NSCLC的DNA損傷和電離輻射抗性的影響，為NSCLC的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料H1299細(xì)胞購(gòu)自上海啟達(dá)生物科技有限公司。1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），小牛血清（上海依科賽生物有限公司），磷酸鹽緩沖液（PBS），胰蛋白酶（美國(guó) Gibco公司）；結(jié)晶紫（美國(guó)Roche公司）；蛋白酶抑制劑（美國(guó)Roche公司）；CCK?8試劑盒（北京TransGen Biotech公司）；EL轉(zhuǎn)染試劑（北京TransGen Biotech公司）；ECL顯色液（德國(guó)Merck Millipore公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)H1299細(xì)胞5% CO2，37℃條件下，用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用siRNAs（siNC，siLINP1?1，siLINP1?2）和轉(zhuǎn)染試劑EL敲減LINP1。細(xì)胞培養(yǎng)到匯合度達(dá)到70% ～80%時(shí)，用siNC，siLINP1?1，siLINP1?2分別與EL按操作手冊(cè)的要求混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞照射將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，貼壁24 h后進(jìn)行siRNA的轉(zhuǎn)染，使用siRNAs（siNC，siL?INP1?1，siLINP1?2）和EL敲減LINP1。細(xì)胞培養(yǎng)到匯合度達(dá)到70% ～ 80%時(shí)，用siNC，siLINP1?1，siL?INP1?2分別與EL混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后換液，液面深度為5 mm，上蓋1 cm玻璃厚補(bǔ)償物，使用Elekta Precise醫(yī)用直線加速器radiation type X ray，Energy 6 MV，Dose Rate 300 MU/min，0 °照射，劑量為8.0 Gy。

1.2.4 CCK?8法檢測(cè)細(xì)胞增殖采用上述成功轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，按照按每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中，每孔100 μL的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行電離輻射（8.0 Gy）照射，分別在照后0、12、24、48、72 h各時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μL的 CCK?8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，測(cè)定450 nm的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)取上述成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞使用胰酶消化后計(jì)數(shù)，每孔5.0×102個(gè)細(xì)胞接種培養(yǎng)在6孔板中，24 h后進(jìn)行電離輻射（8.0 Gy）的照射，培養(yǎng)12～14 d，中間更換兩次培養(yǎng)基?？寺〖涑霈F(xiàn)后，用PBS洗滌兩次，在4%多聚甲醛中固定15 min，最后0.1%結(jié)晶紫染色15min后觀察，評(píng)估LINP1表達(dá)水平變化對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響。

1.2.6 Western blot蛋白檢測(cè)2 500 rpm離心收集細(xì)胞，用加有 1×Protease Inhibitor Cocktail（Roche）的RIPA緩沖液制備細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白。每孔加20 μg等量蛋白，電泳后轉(zhuǎn)（PVDF）膜上，3%BSA室溫封閉1 h，特異性一抗結(jié)合靶蛋白4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗后辣根過(guò)氧化酶（horse?radish peroxidase，HRP）偶聯(lián)的二抗用于化學(xué)發(fā)光成像檢測(cè)，ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。

1.2.7 單細(xì)胞凝膠電泳細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后換液，24 h后進(jìn)行電離輻射（8.0 Gy）的照射，4 h后使用胰酶將細(xì)胞消化后用PBS將細(xì)胞重懸，將細(xì)胞懸液和0.8%低熔點(diǎn)瓊脂糖按照1∶4混合均勻，鋪在預(yù)處理后的載玻片上，4℃下放置1 h。將鋪好膠的載玻片放入裂解液中裂解4 h。裂解后用PBS清洗，將載玻片放入現(xiàn)配現(xiàn)用的電泳緩沖液中，變性解旋 20 min，電泳 20 min（20 V，300 mA）。用中和緩沖液中和15 min，全程避光進(jìn)行。將載玻片置于EB中染色20 min后洗脫10 min，使用熒光倒置顯微鏡拍照后，用分析軟件Image J進(jìn)行圖像分析。

1.2.8 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT?PCR）檢測(cè)qRT?PCR參照 HAN 等[19]的方法，用 TRIzol試劑（Life Tech?nologies）按說(shuō)明書(shū)操作提取總RNA，采用Nanodrop 2000（ThermoFisher Scientific）定量RNA的濃度，取1 μg總RNA使用Honor II 1st cDNA Synthesis Super?mix for qPCR（Novogene）按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所得cDNA稀釋10倍用于后續(xù)反應(yīng)。按每孔混合 3 μL 稀釋后的 cDNA、0.2 μL 引物和 5 μL Unique Apatamer qPCR SYBR Green Master Mix（No?vogene）并加ddH2O至體積10 μL配制反應(yīng)體系，置于qPCR儀LightCycler 480 PCR System（Roche），按程序（預(yù)變性：94℃ 3 min；擴(kuò)增：94℃ 10 s，56℃15 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min；12 ℃保溫）進(jìn)行qRT?PCR檢測(cè)和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均數(shù)的比較采用方差分析的Dunnett?t檢驗(yàn)，兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電離輻射條件下肺癌細(xì)胞中LINP1的表達(dá)水平為了探索LINP1在NSCLC電離輻射抗性中的作用，首先分別收集了0、2.0、4.0、8.0、16.0 Gy照射后的H1299細(xì)胞，并通過(guò)qRT?PCR檢測(cè)電離輻射條件下肺癌細(xì)胞中LINP1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：照射后LINP1的表達(dá)均明顯升高，提示LINP1可能在NSCLC的電離輻射抗性中發(fā)揮作用。且在8.0 Gy電離輻射照射下，細(xì)胞中LINP1的表達(dá)量最高（圖1），因此后續(xù)選擇8.0 Gy作為照射劑量。

圖1 qRT?PCR檢測(cè)電離輻射條件下H1299細(xì)胞中LINP1的表達(dá)水平Fig.1 Expression of LINP1 in H1299 cells under ionizing radiation assessed by qRT?PCR

2.2 敲減LINP1抑制電離輻射條件下H1299細(xì)胞的增殖能力本研究使用RNA干擾在H1299細(xì)胞中沉默LINP1，并采用qRT?PCR驗(yàn)證了敲減效率（圖2）。為了研究LINP1對(duì)電離輻射條件下非小細(xì)胞肺癌增殖能力的影響，對(duì)轉(zhuǎn)染24 h后的H1299細(xì)胞進(jìn)行8.0 Gy電離輻射照射，采用CCK?8方法和克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)其增殖能力進(jìn)行分析，其結(jié)果顯示：8.0 Gy照射后H1299細(xì)胞的增殖能力明顯下調(diào)，且敲減組相比siNC組增殖能力（圖3A）和克隆形成能力（圖3B）進(jìn)一步降低。以上結(jié)果表明敲減LINP1抑制電離輻射條件下H1299細(xì)胞的增殖。

圖2 qRT?PCR檢測(cè)H1299細(xì)胞中LINP1的敲減效率Fig.2 Expression of LINP1 in H1299 cellsafter LINP1 knockdown assessed by qRT?PCR

圖3 電離輻射條件下敲減LINP1后對(duì)H1299細(xì)胞增殖能力和克隆形成的影響Fig.3 Effect of LINP1 knockdown on proliferation and clone formation of H1299 cells under ionizing radiation

2.3 敲減LINP1促進(jìn)電離輻射下肺癌細(xì)胞的DNA損傷本研究通過(guò)彗星電泳和Western blot蛋白檢測(cè)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白γ?H2AX來(lái)觀察肺癌細(xì)胞H1299中DNA損傷的變化情況。彗星電泳結(jié)果顯示：8.0 Gy照射組的彗星拖尾更長(zhǎng)，Tail DNA%、Tail Length、Comet Length、Tail Moment、Olive Tail Moment這5個(gè)特異指標(biāo)明顯升高（表1），DNA損傷明顯增加；且電離輻射條件下，與轉(zhuǎn)染siNC的H1299細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染siLINP1?1和siLINP1?2的H1299細(xì)胞5個(gè)特異指標(biāo)明顯進(jìn)一步升高，DNA損傷進(jìn)一步增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖4）。Western blot結(jié)果顯示8.0 Gy電離輻射條件下γ?H2AX蛋白表達(dá)明顯增加；在電離輻射條件下敲減LINP1進(jìn)一步提高了γ?H2AX的表達(dá)（圖5）。以上結(jié)果說(shuō)明敲減LINP1能進(jìn)一步增加電離輻射條件下H1299的DNA損傷。

表1 彗星電泳分析電離輻射條件下敲減LINP1后H1299細(xì)胞各指標(biāo)的影響Tab.1 Comet electrophoresis analysis of the effects of LINP1 knockdown on various indicators of H1299 cells under ionizing radiation ±s

表1 彗星電泳分析電離輻射條件下敲減LINP1后H1299細(xì)胞各指標(biāo)的影響Tab.1 Comet electrophoresis analysis of the effects of LINP1 knockdown on various indicators of H1299 cells under ionizing radiation ±s

注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P ＜0.001

組別0 Gy?siNC 0 Gy?siLINP1?1 0 Gy?siLINP1?2 8.0 Gy?siNC 8.0 Gy?siLINP1?1 8.0 Gy?siLINP1?2 Comet Length 257.56±9.82 305.80±6.23*301.13±9.76***412.65±9.95***376.41±10.43***412.90±10.58 Tail Length 12.73±10.67 30.17±10.20***30.15±7.73***63.48±9.60***81.75±8.80***75.11±9.28***Tail DNA Percent%5.01±2.94 11.02±9.06***13.90±8.91***13.61±7.00***20.59±7.02***25.99±8.28***Tail Moment 22.74±5.94 29.67±9.39*38.59±10.91***38.93±9.72***40.80±9.65 45.73±10.62**Olive Tail Moment 12.86±8.35 20.28±8.20***18.98±3.87**31.65±7.71***36.48±8.79*44.10±8.85***

圖4 彗星電泳檢測(cè)電離輻射條件下敲減LINP1后H1299細(xì)胞DNA損傷變化情況Fig.4 DNA damage of H1299 cells with LINP1 knockdown under ionizing radiation detected by Comet assay

圖5 Western blot檢測(cè)電離輻射條件下敲減LINP1后H1299細(xì)胞蛋白γ?H2AX的變化Fig.5 The changes of γ?H2AX of H1299 cells with LINP1 knockdown under ionizing radiation detected by Western blot

3 討論

放射治療是利用放射線如放射性同位素產(chǎn)生的射線和各類X線治療機(jī)或加速器產(chǎn)生的X線、電子束、質(zhì)子束及其他粒子束等治療疾病，是惡性腫瘤治療的重要方法之一，可用于治療幾乎所有類型的實(shí)體瘤，為腫瘤的治療提供了更簡(jiǎn)單更安全有效的治療方案。隨著特異性增強(qiáng)靶區(qū)劑量、減少周邊組織和器官非特異性損傷的放療技術(shù)的迭代更新，放療技術(shù)日趨完善，在臨床癌癥治療中得到了更廣泛的應(yīng)用[9]。然而晚期肺癌對(duì)放射治療不敏感，具有電離輻射抗性是一大問(wèn)題。而放射治療的主要作用靶點(diǎn)是癌細(xì)胞的DNA，引起DNA損傷，進(jìn)而殺死癌細(xì)胞，因此如何增加電離輻射對(duì)癌細(xì)胞的DNA損傷是研究如何減弱電離輻射抗性的關(guān)鍵。隨著近年來(lái)生物靶向治療結(jié)合放射治療受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注[20-21]，長(zhǎng)鏈非編碼RNA在DNA損傷和電離輻射抗性中發(fā)揮的作用也逐漸被揭示。

在本研究中首先通過(guò)梯度劑量照射處理后發(fā)現(xiàn)LINP1顯著升高，并且8.0 Gy電離輻射處理下最為明顯。LINP1作為一種在三陰性乳腺癌（TNBC）中促進(jìn)治療耐藥性的LncRNA首次被發(fā)現(xiàn)，研究表明LINP1能夠通過(guò)充當(dāng)Ku80和DNA?PKcs的連接支架來(lái)增強(qiáng)DNA雙鏈斷裂的修復(fù)，并且結(jié)合依賴ATP的DNA螺旋酶復(fù)合物Ku80?Ku70異質(zhì)二聚體，與斷裂的末端結(jié)合，形成一個(gè)鉗形復(fù)合體，將依賴DNA的蛋白激酶催化亞基DNA?PKcs招募至損傷部位，促進(jìn)斷端的連接修復(fù)，從而協(xié)調(diào)非同源末端連接（NHEJ）途徑[22]。此外，有研究在宮頸癌放射治療中，LINP1從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核結(jié)合Ku80和DNA?PKcs以促進(jìn)放療時(shí)的DNA損傷修復(fù)，敲減LINP1的表達(dá)則顯著增強(qiáng)電離輻射后細(xì)胞凋亡水平，進(jìn)而降低宮頸癌細(xì)胞對(duì)電離輻射的敏感性[23]。以上研究提示LINP1在DNA損傷及輻射抗性中可能發(fā)揮著作用，但目前關(guān)于LINP1與NSCLC DNA損傷以及輻射抗性的研究幾乎未見(jiàn)有，因此本文研究了LINP1對(duì)電離輻射下NSCLC DNA損傷效應(yīng)的影響，探索能夠增強(qiáng)NSCLC放射敏感性的治療方案。

本研究首先通過(guò)qRT?PCR檢測(cè)電離輻射對(duì)肺癌細(xì)胞中LINP1表達(dá)情況的影響，結(jié)果顯示，在電離輻射條件下肺癌細(xì)胞中LINP1的表達(dá)上調(diào)，提示電離輻射與LINP1的變化有明確的誘導(dǎo)關(guān)系。在通過(guò)siRNA敲減LINP1表達(dá)后，電離輻射條件下的NSCLC H1299的增殖能力和克隆形成能力進(jìn)一步下降，提示敲減LINP1能夠進(jìn)一步加強(qiáng)電離輻射對(duì)NSCLC增殖的抑制作用，這與LINP1在宮頸癌中的研究結(jié)果一致。

在明確LINP1能增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力后本研究對(duì)H1299細(xì)胞的DNA損傷和DNA損傷修復(fù)進(jìn)行了探索。彗星電泳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲減LINP1能夠增強(qiáng)電離輻射對(duì)NSCLC的DNA損傷作用。當(dāng)DNA發(fā)生內(nèi)源性或外源性損傷時(shí)，形成雙鏈斷裂（DS?Bs），組蛋白H2AX發(fā)生磷酸化。這種新磷酸化的蛋白質(zhì)γ?H2AX是招募和定位DNA修復(fù)蛋白的第一步。γ?H2AX病灶迅速形成，這些病灶以1∶1的方式代表DSB，可以用作損傷的生物標(biāo)志物[24-25]。Western blot結(jié)果表明在電離輻射條件下，敲減LINP1后γ?H2AX的表達(dá)增加，進(jìn)一步說(shuō)明LINP1可能通過(guò)DNA損傷和DNA損傷修復(fù)相關(guān)通路來(lái)抑制NSCLC細(xì)胞DNA損傷效應(yīng)從而導(dǎo)致電離輻射抗性的產(chǎn)生。

綜上所述，本研究探討了LINP1電離輻射條件下在NSCLC中的生物學(xué)作用，揭示了LINP1抑制NSCLC中DNA損傷增強(qiáng)其電離輻射抗性的作用，為NSCLC患者尤其是晚期患者的電離輻射治療與抑制LINP1的生物靶向治療的聯(lián)合應(yīng)用提供新的思路和科學(xué)依據(jù)，但目前本研究結(jié)論待體內(nèi)實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步充實(shí)，其具體是通過(guò)何種機(jī)制發(fā)揮DNA損傷抑制作用及電離輻射抗性作用有待更進(jìn)一步研究。