小尾寒羊GHRH基因的多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

樊紅燈 ，王龍威 ，白俊艷 *，韓志松 ，何豫涵 ，李靜云 ，盧小寧 ，陳夢柯 ，曾凡林 ，王建華

（1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.洛陽市動物遺傳育種重點實驗室，河南 洛陽471023；3.遼寧省沙地治理與利用研究所，遼寧 阜新 123000；4.內(nèi)蒙古赤峰市元寶山區(qū)平莊鎮(zhèn)人民政府，內(nèi)蒙古 赤峰 024076）

生長激素釋放激素 (growth hormone releasing hormone，GHRH)具有促進(jìn)動物生長發(fā)育，提高新陳代謝的功效[1]，而且GHRH還可以促進(jìn)肌肉生長、分解體內(nèi)脂肪[2]。GHRH基因已被證明與家畜的生理活動、生長性狀等有顯著關(guān)聯(lián)性，是影響家畜生長性能等的重要基因之一。GHRH基因多態(tài)性已被證明與豬的背膘厚、日增重、胴體肉含量、肉色和保水能力有關(guān)[3]。作為中國獨有的品種——小尾寒羊，其皮毛精美，肉質(zhì)鮮嫩可口，營養(yǎng)豐富，深受國內(nèi)外市場青睞[4]。本研究以我國小尾寒羊為研究對象，對GHRH基因的多態(tài)性以及小尾寒羊GHRH基因的多態(tài)性與其生長性狀關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，檢測GHRH基因的InDel多態(tài)性，并與小尾寒羊生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以此來探討GHRH基因?qū)π∥埠蛏L性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取了遼寧省沙地治理與利用研究某牧業(yè)公司阜新市種羊場的小尾寒羊164只，所有羊只均在相同環(huán)境下飼養(yǎng)。對頸靜脈采集的10mL小尾寒羊血液樣本進(jìn)行ACD枸櫞酸抗凝處理并置于冰盒中 [血液與ACD 的比例為 5∶1(V/V)]，-20 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 生長性狀指標(biāo)測定。利用常規(guī)方法對小尾寒羊的生長性狀指標(biāo)進(jìn)行測定，測定指標(biāo)包括羊的宰前活重、宰后胴體重、體高、體長、胸寬、胸圍、管圍、尻高、臀端高、前肢高、頭長、尻長、頸長、額寬、腰角寬、臀端寬、胸深、頭深、腹圍、腿臀圍和背高。

1.2.2 基因組DNA提取。取出綿羊血樣解凍后，按照全血基因組DNA試劑盒說明書提取綿羊血液DNA，用超微量核酸濃度測定儀檢測DNA的濃度和純度，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。根據(jù)DNA樣品純度和濃度將DNA稀釋至100ng/μL，分裝至EP管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計。引物信息參考Wu等[5]論文里的引物序列，由鄭州鼎國生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.2.4 GHRH基因PCR擴增。PCR擴增體系15μL；上下游引物各 1 μL，DNA2 μL，2×Tap PCR Master Mix7.5μL，ddH2O4.5μL。PCR擴增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測圖

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。利用SPSS26.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析不同基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)性，最后將關(guān)聯(lián)結(jié)果以圖的形式列出。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，共檢測到兩種基因型，分別為II(165bp)基因型和DD(159bp)基因型。其中DD基因型頻率為0.4375，II基因型頻率為0.5625。

2.2 GHRH基因與小尾寒羊生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

小尾寒羊GHRH基因的不同基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表2。由表2可知，DD基因型小尾寒羊的尻高、前肢高和頸長顯著大于II基因型(P<0.05)；II基因型小尾寒羊的胸圍和腹圍顯著大于DD基因型(P<0.05)。小尾寒羊群體DD基因型和II基因型個體羊的宰前活重、宰后胴體重、體高、體長、胸寬、管圍、臀端高、頭長、尻長、額寬、腰角寬、臀端寬、胸深、頭深、腿臀圍和背高雖然有差異，但是差異不顯著(P>0.05)。

表2 GHRH基因與小尾寒羊生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

3.1 GHRH基因是動物生長發(fā)育相關(guān)的重要功能候選基因

Meng等[6]的研究表明，可以通過外部注射GHRH表達(dá)質(zhì)粒的方法來提高羊的生長速率和增重。褚曉紅等[7]的試驗結(jié)果表明，豬的GHRH基因與豬的采食有遺傳連鎖關(guān)系，GHRH基因是影響豬采食及生長的重要候選基因。為了探討GHRH基因去除(GHRH敲除，GHRHKO)導(dǎo)致的GHRH缺乏對小鼠情緒行為的影響，Sheila等[8]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，GHRHKO小鼠探索性活動增強；在開闊場試驗(P<0.005)、亮暗箱試驗(P<0.005)和高架加迷宮試驗(P<0.05)中，GHRHKO小鼠焦慮相關(guān)行為減少；此外，與對照組相比，GHRHKO小鼠在強迫游泳試驗和尾懸試驗中靜止時間顯著減少(P<0.0001)。這些結(jié)果表明，雄性小鼠GHRH缺乏會增加體力活動，減少焦慮和抑郁相關(guān)行為。Zhang等[9]采用PCR-SSCP和測序技術(shù)檢測秦川牛和南陽牛的GHRH基因突變，秦川牛和南陽牛C等位基因頻率分別為 0.8778 和 0.8476，新突變 1 個(C>T)。Iwona等[10]使用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng) (PCR-RFLP)技術(shù)共對242頭波蘭荷斯坦牛和185頭純種澤西牛進(jìn)行基因分型，并對波蘭荷斯坦州奶牛和澤西島奶牛的產(chǎn)奶特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，基因型中含有1～2個GHRH等位基因的奶牛其生產(chǎn)的牛奶中脂肪含量更高。

3.2 GHRH基因與綿羊生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

袁曉峰等[11]研究了薩?？搜蚺c哈薩克羊雜交成年母羊GHRH基因位點的多態(tài)性及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示，GHRH基因2個SNP位點多態(tài)性對哈×薩羊的雜交成年母羊生長性能具有一定的影響，可以作為輔助育種的候選基因。肖禮華等[12]研究表明，GHRH-R基因可以作為黔北地區(qū)麻羊體重篩選的分子標(biāo)記。本研究表明，II基因型小尾寒羊的胸圍、腹圍顯著大于DD基因型(P<0.05)；DD基因型小尾寒羊的前肢高、尻高和頸長顯著大于II基因型(P<0.05)。結(jié)果證實了GHRH基因與小尾寒羊生長發(fā)育的相關(guān)性，可以作為本土小尾寒羊遺傳雜交改良的重要功能候選基因。