重癥監(jiān)護(hù)室患者胃腸道產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌ST11株的分布調(diào)查及遺傳相關(guān)性分析*

胡金曹，曹小利，萬會(huì)林，周輝，周萬青，李陽

(1.南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院a.檢驗(yàn)科，b.醫(yī)院感染管理科，南京210008；2.南京市高淳人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 211300)

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院獲得性感染包括呼吸道、尿道及血流感染等的重要病原菌[1]。流行病學(xué)研究顯示，該菌是主要的碳青霉烯類耐藥腸桿科細(xì)菌(carbapenem resistant Enterobacteriaceae, CRE)，碳青霉烯酶KPC的產(chǎn)生是主要的耐藥機(jī)制[2]。在亞太地區(qū)，特別是中國，ST11菌株是主要的流行克隆菌株[3]，約占碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)的60%。研究報(bào)道，肺炎克雷伯菌主要定植在胃腸道[4]，和感染密切相關(guān)。本研究旨在分析產(chǎn)KPC-2 CRKP ST11在南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室(Intensive Care Unit，ICU)住院患者胃腸道的定植情況，并分析blaKPC-2陽性肺炎克雷伯菌ST11菌株之間的遺傳相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1儀器和試劑 麥康凱粉劑(BD公司)，2×PCR mix(擎科生物公司)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(法國生物梅里埃公司)，脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀、成像儀(Bio-Rad公司)，Bionumeric 7.6軟件購自上海一貝科技有限公司，藥敏紙片(Oxiod公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)菌株篩選 取2018年12月25—28日南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院6個(gè)ICU病區(qū)(心胸外科ICU、呼吸ICU、神經(jīng)內(nèi)科ICU、神經(jīng)外科ICU、全院ICUA和ICUB)住院2 d以上患者的肛拭子樣本共125份。樣本接種至含有0.5 μg/mL美羅培南的麥康凱培養(yǎng)基上[5]，37 ℃過夜培養(yǎng)，篩選CRKP菌株，使用經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)鑒定，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 8739。

1.3藥物敏感性試驗(yàn) 對(duì)于篩選到的肺炎克雷伯菌，使用K-B法測(cè)定下列藥物的敏感性：氨芐西林/舒巴坦、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢哌酮/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/舒巴坦、亞胺培南、左氧氟沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、米諾環(huán)素、替加環(huán)素、阿米卡星。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。依據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI) M100 2019版標(biāo)準(zhǔn)判定藥物的敏感性[6]。替加環(huán)素的藥敏結(jié)果判讀依據(jù)Eucast(www.eucast.org)的判讀指南。

1.4blaKPC-2基因檢測(cè) 煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA。使用PCR法檢測(cè)blaKPC基因[7]。引物序列設(shè)計(jì)如下。KPC-F：5′-CGTCTAGTTCTGCTGTCTTG-3′，KPC-R: 5′-CTTGTCATCCTTGTTAGGCG-3′，產(chǎn)物大小為798 bp。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括2×Taq Mix 25 μL，10 μmol/L上、下游引物濃度各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物行12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，將PCR陽性產(chǎn)物送擎科生物公司純化測(cè)序(儀器：ABI 3730測(cè)序儀，Sanger測(cè)序法)，測(cè)序結(jié)果提交NCBI對(duì)比，確定基因型。

1.5ST11菌株的確定 依據(jù)網(wǎng)站提供的肺炎克雷伯菌多位點(diǎn)序列分型引物及條件(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)[8]，合成7個(gè)管家基因rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，50 ℃(rpoB、mdh、pgi、phoE、infB)/60 ℃(gapA)/45 ℃(tonB) 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送擎科生物公司測(cè)序(儀器：ABI 3730測(cè)序儀，Sanger測(cè)序法)，并提交網(wǎng)站進(jìn)行菌株的序列分型(https://bigsdb.pasteur.fr/cgi-bin/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef&page=sequenceQuery)。

1.6脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed field electrophoresis, PFGE) 取新鮮培養(yǎng)的菌落，混勻于細(xì)胞懸液緩沖液制成菌懸液，加入蛋白酶K，制成膠塊。經(jīng)XbaⅠ酶切后，14 ℃、6.0 V/cm電泳19 h，夾角為120°，轉(zhuǎn)換時(shí)間由2.2 s增加到54.2 s，梯度為6 V/cm，EB染色20 min后成像，Bionumerics7.6軟件分析。采用基于帶容限為1.5%的均值關(guān)聯(lián)不加權(quán)配對(duì)群法(UPGMA)的骰子相似系數(shù)，80%為菌株遺傳相關(guān)性的判定折點(diǎn)[9]。

2 結(jié)果

2.1CRKP篩選結(jié)果 共收集肛拭子125份，在0.5 μg/mL美羅培南麥康凱平板上篩選到耐碳青霉烯菌株共計(jì)41株，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定為CRKP 30株，鮑曼不動(dòng)桿菌9株，銅綠假單胞菌1株，皮爾士不動(dòng)桿菌1株。CRKP在胃腸道的定植率為24.2% (30/125)。在各ICU的分布情況見表1。

2.2藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 30株CRKP對(duì)氨芐西林/舒巴坦、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢哌酮/舒巴坦、阿莫西/克拉維酸、哌拉西林/舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星和亞胺培南的耐藥率為100%，對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥率為96.7%，對(duì)米諾環(huán)素和替加環(huán)素的耐藥率分別為63.3%和0%。

2.3碳青霉烯耐藥基因的分布 PCR擴(kuò)增顯示，30株CRKP中，27株(90.0%)細(xì)菌攜帶blaKPC基因，經(jīng)DNA測(cè)序分析顯示，均為blaKPC-2基因。

2.4多位點(diǎn)序列分型 結(jié)果顯示，30株CRKP中，26株(86.7%)肺炎克雷伯菌為ST11。

表1 碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌在各病區(qū)重癥監(jiān)護(hù)室中的分布情況

2.5細(xì)菌遺傳相關(guān)性分析 PFGE結(jié)果顯示，依據(jù)80%的判定折點(diǎn)[9]，產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌ST11株可以分為6個(gè)PFGE簇，分為A、B、C、D、E和F。最大的簇A由19株細(xì)菌組成，除2個(gè)菌株組成B簇，其余4株細(xì)菌均單獨(dú)成簇，分別為C、D、E和F簇。見圖1。

注：樹狀圖基于Dice相似系數(shù)由UPGMA算法生成，根據(jù)脈沖場(chǎng)凝膠電泳譜80%的相似性定義了6個(gè)PFGE簇(A、B、C、D、E和F簇)。ICU，重癥監(jiān)護(hù)室。圖1 25株產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌ST11株脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖譜的樹狀圖

3 討論

CRKP作為一種超級(jí)細(xì)菌可導(dǎo)致醫(yī)院感染，而ICU患者醫(yī)院獲得性感染的風(fēng)險(xiǎn)增加，特別是獲得CRKP的風(fēng)險(xiǎn)增加。目前已知，CRKP容易定植在人體的胃腸道，其胃腸道定植和醫(yī)院感染關(guān)系密切[1]。相關(guān)研究表明，肺炎克雷伯菌在住院患者的胃腸道定植率最高，達(dá)77%[1]。研究發(fā)現(xiàn)，人體的胃腸道不僅可以動(dòng)態(tài)定植CRKP，而且CRKP在胃腸道的定植是其腸外感染的重要步驟[10]，胃腸道的定植率與隨后的感染顯著相關(guān)[4]。但產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌ST11作為CRKP最流行的克隆，在ICU患者胃腸道的定植情況有待于進(jìn)一步明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，我院ICU患者胃腸道CRKP的定植率為24.2%，顯著高于以色列醫(yī)院患者的定植率(5.4%)[11]和ICU患者定植率(10.5%)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，在ICU患者分離的CRKP定植菌中，90.0%為ST11菌株，這與河南省人民醫(yī)院ICU入住患者分離的CRKP中84.4%為ST11陽性基本一致[13]，也與產(chǎn)KPC-2的CRKP-ST11菌株在醫(yī)院內(nèi)的播散情況一致[3]，表明ST11菌株是ICU住院患者胃腸道定植CRKP最主要的流行克隆。值得注意的是，本研究中分離出來的CRKP中，86.7%菌株產(chǎn)KPC-2，稍微低于浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院ICU中患者胃腸道中CRKP的KPC-2陽性率(95.3%)[10]和河南省人民醫(yī)院的 KPC-2陽性率(98.6%)[13]，但總體而言，blaKPC-2基因在ICU患者肺炎克雷伯菌定植菌中的存在廣泛，表明ICU患者胃腸道定植肺炎克雷伯菌主要為CRKP，其對(duì)臨床多種抗菌藥物耐藥，這可能與該基因主要位于質(zhì)粒[14]，容易在細(xì)菌中播散有關(guān)。

此外，我們發(fā)現(xiàn)，CRKP-ST11不僅對(duì)臨床檢測(cè)到的大部分抗菌藥物都高度耐藥，而且有很高的遺傳同源性，表明該類細(xì)菌在我院不同ICU病區(qū)中存在著克隆播散，需要加強(qiáng)醫(yī)院內(nèi)感染防控措施的實(shí)施，以預(yù)防該類細(xì)菌在醫(yī)院內(nèi)，特別是ICU里面的播散和定植，以防爆發(fā)流行。

總之，產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌ST11在我院ICU住院患者的胃腸道中定植廣泛，感染風(fēng)險(xiǎn)大，而且對(duì)臨床用抗菌藥物廣泛耐藥，需要加強(qiáng)院內(nèi)感染控制措施，以預(yù)防其播散。