新型冠狀病毒核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)臨床應(yīng)用江蘇專家共識

江蘇省醫(yī)學(xué)會檢驗學(xué)分會，江蘇省臨床檢驗中心

核酸檢測是新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019, COVID-19)人群篩查、確診、出院隨訪和流行病學(xué)調(diào)查的最重要依據(jù)[1-2]。新型冠狀病毒核酸全自動聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)檢測系統(tǒng)(簡稱新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng))是集樣本識別和轉(zhuǎn)移、核酸提取和純化、體系構(gòu)建、基因擴(kuò)增和檢測功能為一體或組合為一體的高度自動化核酸檢測系統(tǒng)；其利用機(jī)械自動化代替常規(guī)核酸檢測中的手工操作過程，實現(xiàn)取樣后直接在封閉或半封閉的檢測系統(tǒng)中完成整個測定。與傳統(tǒng)新冠核酸檢測系統(tǒng)相比，全自動PCR檢測系統(tǒng)具有流程簡化、精確度高、生物安全風(fēng)險低和緩解人力資源緊張等優(yōu)勢，部分種類的全自動PCR檢測系統(tǒng)還實現(xiàn)了樣本隨到隨檢，不需要樣本等待時間；可適用于急診、發(fā)熱門診、常規(guī)以及大規(guī)模核酸檢測等多種應(yīng)用場景；極大地降低了大規(guī)模篩查時人員不足的壓力，避免了復(fù)雜人工操作導(dǎo)致的差錯和結(jié)果不準(zhǔn)確，同時也減少了實驗中輔助設(shè)施設(shè)備的需求，有助于核酸檢測能力和效率的全面提升。因此，新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)備受關(guān)注。

然而新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)的應(yīng)用也給臨床實驗室?guī)砹艘恍┬碌膯栴}和疑惑，如是否需要在生物安全二級實驗室開展檢測、是否需要專業(yè)人員操作、實驗室如何設(shè)置、如何保證儀器的良好運(yùn)行、如何進(jìn)行質(zhì)量控制、如何進(jìn)行復(fù)檢等。為規(guī)范新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)在臨床中的應(yīng)用，減輕人員壓力并保證實驗室檢測效率和檢驗質(zhì)量，江蘇省醫(yī)學(xué)會檢驗分會和江蘇省臨床檢驗中心組織省內(nèi)檢驗醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域的相關(guān)專家共同制定本專家共識。

1 定義、分類、術(shù)語

1.1定義 新型冠狀病毒核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)是指樣本識別和轉(zhuǎn)移、核酸提取和純化、體系構(gòu)建、基因擴(kuò)增和檢測全流程自動化的核酸檢測系統(tǒng)。

1.2分類 該系統(tǒng)目前主要有以下3種模式。(1)一體化隨機(jī)處理式：檢測系統(tǒng)一體化，樣本隨到隨檢，具備處理單管樣本的功能；(2)一體化批處理式：檢測系統(tǒng)一體化，樣本分批集中處理和檢測，無需實驗人員手動操作；(3)組合型批處理式：檢測系統(tǒng)非一體化，通常由配套或推薦的全自動分杯處理系統(tǒng)、全自動核酸提取工作站和熒光定量擴(kuò)增儀組合而成，樣本分批集中處理和檢測，部分步驟需要人員參與手工操作。

1.3術(shù)語與解釋 下列術(shù)語與解釋專用于本共識。

1.3.1樣本識別和轉(zhuǎn)移 包含自動化條碼識別和信息錄入、樣本管開蓋和關(guān)蓋以及樣本吸取和加樣的過程。

1.3.2核酸提取和純化 包含樣本裂解釋放核酸，核酸被結(jié)合進(jìn)行洗滌、純化和洗脫的過程。

1.3.3體系構(gòu)建 包含PCR反應(yīng)體系的配制和分配以及核酸點樣的過程。

1.3.4基因擴(kuò)增和檢測 包含PCR反應(yīng)管封蓋或反應(yīng)板封膜、PCR擴(kuò)增以及熒光采集和檢測的過程。

1.3.5隨機(jī)處理式 單管式進(jìn)樣，每個樣本作為單獨(dú)的反應(yīng)管進(jìn)行處理和檢測的模式。

1.3.6批處理式 成批式處理樣本且每批樣本同時檢測的模式。

1.3.7檢測系統(tǒng)一體化 即一體化檢測系統(tǒng)，集樣本識別和轉(zhuǎn)移、核酸提取和純化、體系構(gòu)建、基因擴(kuò)增和檢測的全過程在一臺自動化儀器設(shè)備上完成。

1.3.8自動報告模式 新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)通過與實驗室信息管理系統(tǒng)(laboratory information management system，LIS)對接自動給出檢測結(jié)果報告；但該報告只能作為結(jié)果提示，需經(jīng)人工審核后才能簽發(fā)。

2 實驗室的資質(zhì)要求

共識1：使用新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)的實驗室應(yīng)具備開展常規(guī)新型冠狀病毒核酸檢測的資質(zhì)，符合生物安全要求。

實驗室應(yīng)符合《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法》及其工作導(dǎo)則《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗工作導(dǎo)則》(衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號)和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行第二版)》(聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制醫(yī)療發(fā)〔2020〕313號)的要求，并具備以下資質(zhì)：醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證及其相應(yīng)的二級診療科目“臨床細(xì)胞與分子遺傳學(xué)專業(yè)”、Ⅱ級或Ⅱ級以上生物安全實驗室備案證書、臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室技術(shù)驗收合格證(新冠專項或感染類)。

實驗室各崗位人員均應(yīng)在生物安全風(fēng)險評估的基礎(chǔ)上，采取適當(dāng)?shù)膫€體防護(hù)措施，包括手套、口罩、帽子、防護(hù)服和/或隔離衣等。

3 人員要求

共識2：實驗室檢測技術(shù)人員在數(shù)量上應(yīng)滿足開展該項目檢驗及工作量的需求，并參加必要的外部培訓(xùn)和充分的內(nèi)部培訓(xùn)，具備相應(yīng)資質(zhì)并通過相應(yīng)能力評估及授權(quán)后方可上崗。

實驗室檢測技術(shù)人員應(yīng)滿足《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行第二版)》(聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制醫(yī)療發(fā)〔2020〕313號)的基本要求。盡管新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)操作相對簡單，但仍須進(jìn)行性能驗證、設(shè)備維護(hù)、生物安全防控、質(zhì)量控制和結(jié)果分析判斷等。檢測技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)具備相關(guān)專業(yè)的大專以上學(xué)歷或具有初級及以上專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格；持有省級衛(wèi)生行政部門指定機(jī)構(gòu)頒發(fā)的臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室技術(shù)人員崗位培訓(xùn)合格證書(新冠專項或感染類)；經(jīng)過與所操作的檢測系統(tǒng)相關(guān)的實驗室內(nèi)部技術(shù)培訓(xùn)且考核合格，掌握儀器使用、參數(shù)及程序設(shè)定、樣本裝載、試劑準(zhǔn)備、日常維護(hù)和質(zhì)量控制等常規(guī)操作技能；完成有關(guān)生物安全的培訓(xùn)和考核。報告簽發(fā)人員還應(yīng)同時具備檢驗專業(yè)技術(shù)資格證書。

4 實驗室的設(shè)置

共識3：采用全自動一體化檢測系統(tǒng)進(jìn)行新冠病毒核酸檢測時，實驗室可進(jìn)行區(qū)域的適當(dāng)合并；如果該系統(tǒng)與傳統(tǒng)新冠病毒核酸檢測系統(tǒng)并存，則應(yīng)單獨(dú)分區(qū)，且試劑和耗材應(yīng)儲存在清潔區(qū)。

實驗室設(shè)置應(yīng)符合《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗工作導(dǎo)則》和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行第二版)》(聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制醫(yī)療發(fā)〔2020〕313號)的要求，原則上應(yīng)設(shè)置3個在物理空間上完全分隔的進(jìn)行實驗活動的核心工作區(qū)：試劑配制區(qū)、樣本制備區(qū)和擴(kuò)增檢測區(qū)，且各區(qū)域均須設(shè)置緩沖區(qū)并確保良好的通風(fēng)以及人員、物品、樣本和廢棄物的單向流動。可根據(jù)全自動PCR檢測系統(tǒng)的組成和功能因地制宜進(jìn)行實驗室設(shè)置，如核酸提取和擴(kuò)增檢測一體化時，樣本制備區(qū)與擴(kuò)增檢測區(qū)可合并(圖1A)；如核酸提取、體系構(gòu)建、擴(kuò)增檢測一體化時，試劑配制區(qū)、樣本制備區(qū)和擴(kuò)增檢測區(qū)可合并(圖1B)；但均應(yīng)獨(dú)立于傳統(tǒng)新冠病毒核酸檢測的樣本制備區(qū)和擴(kuò)增檢測區(qū)(如果兩類檢測系統(tǒng)在實驗室同時存在)，單獨(dú)分區(qū)(圖1C或1D)。另外，試劑和耗材的儲存應(yīng)放置于庫房、試劑儲存區(qū)或試劑配制區(qū)，不應(yīng)放置在上述合并區(qū)域。

實驗室應(yīng)當(dāng)配備相適宜的輔助儀器設(shè)備，包括A2型生物安全柜、振蕩器、保存試劑和樣本的冰箱/冰柜、不間斷電源(uninterruptible power system，UPS)等。為防止核酸污染，高壓鍋不允許放置在進(jìn)行實驗的任何工作區(qū)。

注：A，標(biāo)本制備區(qū)與擴(kuò)增檢測區(qū)合并時；B，試劑配制區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)和擴(kuò)增檢測區(qū)合并時；C、D，新冠核酸全自動一體化檢測系統(tǒng)與傳統(tǒng)檢測系統(tǒng)共存時。圖1 新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)實驗室分區(qū)設(shè)計示意圖

5 儀器設(shè)備

5.1工作環(huán)境

共識4：新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)的工作環(huán)境應(yīng)能保證儀器設(shè)備的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，不影響檢驗結(jié)果的有效性，不對所要求的測定質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。主要環(huán)境指標(biāo)應(yīng)符合生產(chǎn)商使用說明書的要求，包括但不限于安裝空間、震動或電磁干擾、通風(fēng)、照明、溫濕度、電源的電壓/頻率/功率、用水質(zhì)量和排水要求等，應(yīng)使用適宜的UPS，保證儀器用電的質(zhì)量和安全。

實驗室應(yīng)監(jiān)測和記錄上述環(huán)境指標(biāo)，確保其符合常規(guī)檢測要求。

5.2驗證

共識5：實驗室應(yīng)基于生產(chǎn)商說明書，制定儀器設(shè)備使用前的性能驗證方案,用于對儀器性能的評估，確定其分析性能與生產(chǎn)商說明書規(guī)定參數(shù)的符合程度，包括機(jī)械臂定位、液面監(jiān)測、吸液量、移動力、溫度、儀器內(nèi)氣流控制、報警功能等。

實驗室使用的分析儀器或檢測系統(tǒng)應(yīng)取得國家藥品監(jiān)督管理局(National Medical Products Administration, NMPA)注冊文件。

5.3使用和維護(hù)

共識6：實驗室應(yīng)基于生產(chǎn)商說明書，制定儀器設(shè)備的常規(guī)使用、維護(hù)保養(yǎng)、清潔、去核酸污染處理等標(biāo)準(zhǔn)操作程序(standard operating procedure, SOP)；維護(hù)保養(yǎng)至少應(yīng)包括但不限于以下內(nèi)容：每天/批實驗結(jié)束后儀器加樣裝置和管道的沖洗、清潔、去核酸污染處理，洗液和廢棄物的及時清理；儀器的廢液管、濾膜、蠕動泵頭、紫外燈的定期更換，等等，并做相應(yīng)記錄。

生產(chǎn)商應(yīng)在說明書中明確描述儀器設(shè)備的使用及日常維護(hù)保養(yǎng)等要求；對于未提供但可能會影響檢驗結(jié)果質(zhì)量的任何操作，實驗室都應(yīng)與廠方工程師一起編寫相應(yīng)SOP，做好使用以及日、月、季、年的維護(hù)保養(yǎng)。

5.4校準(zhǔn)

共識7：實驗室應(yīng)基于生產(chǎn)商說明書，制定相應(yīng)的校準(zhǔn)程序，規(guī)定儀器設(shè)備或檢測系統(tǒng)的校準(zhǔn)方法、頻率、關(guān)鍵參數(shù)及其符合標(biāo)準(zhǔn)，主要內(nèi)容包括但不限于：加樣系統(tǒng)(吸液量準(zhǔn)確度和重復(fù)性、機(jī)械臂定位精度)、提取系統(tǒng)(溫度準(zhǔn)確度和均一性)、擴(kuò)增系統(tǒng)(熒光本底和熒光值精準(zhǔn)度、升降溫速度、溫度準(zhǔn)確度和均一性)、生物安全系統(tǒng)(紫外燈、HEPA過濾系統(tǒng))等，保證其滿足預(yù)期的性能。

儀器的良好運(yùn)行狀態(tài)是檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要保證。實驗室應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)商說明書和相關(guān)行業(yè)規(guī)范定期校準(zhǔn)儀器[3-5]，可根據(jù)儀器的使用頻率、發(fā)生異常情況的概率等酌情增加校準(zhǔn)次數(shù)或部分參數(shù)的校準(zhǔn)次數(shù)，并做好記錄。校準(zhǔn)周期內(nèi)，儀器還需要定期或不定期地進(jìn)行期間核查，通常由廠方工程師完成，以確保儀器性能狀態(tài)的穩(wěn)定性。

5.5常見故障原因、排除和處理

共識8：新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)在運(yùn)行過程中，任何一個零部件的故障都會影響最終的檢測結(jié)果和檢測效率。常見故障通常包括吸樣故障、機(jī)械臂故障、貼膜或封蓋故障、擴(kuò)增模塊故障、通訊故障等。一旦發(fā)現(xiàn)可能影響分析性能的儀器故障，需立即停止操作，分析故障原因并排除故障；故障修復(fù)后需驗證或校準(zhǔn)，證實恢復(fù)正常后方可使用[6]。

5.5.1吸樣故障 主要涉及樣本前處理、提取、擴(kuò)增等階段，出現(xiàn)空吸、堵針或吸液滴漏，常見原因通常有加樣軸氣密性差、樣本問題(空管、黏液過多或混采管棉簽過多等)、零部件(如注射泵、管道磨損、驅(qū)動板、電機(jī)板等)發(fā)生異常。因此，在操作之前，實驗室應(yīng)檢查吸樣頭與軸的氣密性，采樣管液體量和外觀是否符合要求，上樣管內(nèi)有無氣泡或黏液過多等；如出現(xiàn)上述零部件故障，應(yīng)聯(lián)系廠方工程師及時更換。

5.5.2機(jī)械臂故障 主要發(fā)生在加樣、提取、擴(kuò)增階段，常見原因是耗材不配套或放置不到位、移動過程中發(fā)生卡板、參數(shù)設(shè)置錯誤等。實驗室應(yīng)選擇檢測系統(tǒng)配套的耗材，核對設(shè)置參數(shù)，記錄發(fā)生機(jī)械臂故障時的儀器狀態(tài)等。如機(jī)械臂故障實驗室無法自行處理或頻繁發(fā)生時，應(yīng)及時聯(lián)系廠方工程師維修并定期維護(hù)和保養(yǎng)。

5.5.3貼膜或封蓋故障 主要為反應(yīng)板與封膜之間有縫隙或八聯(lián)管未密閉，常見原因是溫度傳感器或加熱模塊故障導(dǎo)致溫度低、參數(shù)設(shè)置錯誤。實驗室應(yīng)觀察和記錄貼膜或封蓋故障發(fā)生的情況、頻率等，聯(lián)系廠方工程師進(jìn)行相應(yīng)處理(如調(diào)整壓力、溫度、更換模塊等)和維護(hù)保養(yǎng)。

5.5.4擴(kuò)增模塊故障 包括溫度控制模塊故障及熒光采集模塊故障。發(fā)生溫度控制模塊故障時，實時溫度跟蹤界面會顯示異常變溫曲線，不升溫或者不降溫，檢測結(jié)果重復(fù)性差，常見原因為溫度控制電路板故障、加熱模塊故障或儀器散熱異常。熒光采集模塊故障主要表現(xiàn)為熒光曲線本底分層、無熒光值、熒光擴(kuò)增效率低或個別孔位熒光異常等，常見原因為熒光采集系統(tǒng)故障、孔位有雜質(zhì)等。廠方工程師應(yīng)定期對擴(kuò)增模塊的溫度、熒光采集及光路系統(tǒng)進(jìn)行維護(hù)或校準(zhǔn)，并定期清潔擴(kuò)增孔位。

5.5.5通訊故障 全自動PCR檢測系統(tǒng)使用過程中也可能會出現(xiàn)通訊故障，如軟件操作與儀器響應(yīng)異常、儀器軟件與LIS間通訊異?；騼x器不同組件間通訊異常，可能與網(wǎng)絡(luò)IP設(shè)置、網(wǎng)線連接等相關(guān)，可通過聯(lián)系廠方工程師和/或LIS工程師解決。

6 試劑耗材

6.1病毒采樣管

共識9：實驗室應(yīng)規(guī)范病毒采樣管的使用。原則上應(yīng)當(dāng)使用配套采樣管，若特殊情況需使用非配套采樣管，一是需廠方提供已經(jīng)確認(rèn)的推薦品牌及其相應(yīng)實驗數(shù)據(jù)，二是需實驗室在臨床使用前通過實驗比對證實非配套采樣管能滿足其檢測系統(tǒng)要求。

病毒采樣管包括采樣液和采樣拭子，目前基本為一類備案試劑，無國家或行業(yè)有關(guān)采樣液成分及配比等的標(biāo)準(zhǔn)。因采樣液的成分(如胍鹽/表面活性劑)濃度對后續(xù)核酸提取試劑的提取效率產(chǎn)生影響，實驗室應(yīng)當(dāng)使用新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)配套或推薦的采樣管。采樣管和拭子的規(guī)格、材質(zhì)以及采樣液種類和容量的要求應(yīng)符合《新冠病毒核酸10合1混采檢測技術(shù)規(guī)范》(聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制醫(yī)療發(fā)〔2020〕352號)和《新冠病毒核酸20合1混采檢測技術(shù)規(guī)范》(聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制醫(yī)療發(fā)〔2022〕21號)等的規(guī)定。

6.2試劑

共識10：應(yīng)使用與新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)配套或推薦的核酸提取試劑和擴(kuò)增檢測試劑，包括提取試劑與檢測試劑之間、提取或檢測試劑與相應(yīng)儀器之間的配套或推薦；且更換提取或檢測試劑品牌時，需進(jìn)行整個檢測系統(tǒng)的性能驗證或確認(rèn)。檢測試劑的分析靈敏度應(yīng)適宜于不同混采模式的要求。

實驗室使用的檢測試劑應(yīng)取得NMPA批準(zhǔn)文件，分析靈敏度以及檢測靶點和數(shù)量應(yīng)滿足國家發(fā)布的新冠病毒核酸檢測的相關(guān)要求，且與不同比例的混采模式相適宜；應(yīng)使用檢測試劑配套的或其說明書中推薦的核酸提取試劑，若特殊情況需使用非配套或非推薦提取試劑，實驗室應(yīng)在臨床應(yīng)用前通過實驗比對確認(rèn)非配套試劑能滿足其檢測要求。批號更換或同一批號貨號更換時，提取試劑和檢測試劑均需進(jìn)行實驗比對驗證。

6.3耗材

共識11：新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)使用的耗材主要包括各種規(guī)格的吸頭、擴(kuò)增反應(yīng)管或板、深孔板或提取條、磁棒套(適用時)等，應(yīng)配套使用；已放置在檢測系統(tǒng)內(nèi)的各類耗材，應(yīng)有防錯設(shè)計，避免加樣臂被污染或損壞；檢測系統(tǒng)應(yīng)具備“耗材是否放置正確和到位”的警示功能。

7 檢驗前過程

7.1樣本采集、運(yùn)輸和保存 同常規(guī)新冠病毒核酸檢測，樣本的采集、運(yùn)輸和保存應(yīng)遵照《新冠病毒樣本采集和檢測技術(shù)指南》[《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第九版)》(聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制醫(yī)療發(fā)〔2022〕71號)附件)]等的相關(guān)規(guī)定。

7.2樣本前處理

共識12：樣本條形碼的識別和信息采集依據(jù)各生產(chǎn)商說明書進(jìn)行設(shè)置。如樣本條形碼識別失敗，可選擇手動錄入或者外接掃碼槍手動掃描至相應(yīng)樣本孔位。如樣本管開蓋失敗，儀器會復(fù)位后重新開蓋(重復(fù)開蓋次數(shù)建議設(shè)置為≥2次)，一旦儀器仍無法開蓋應(yīng)選擇單步調(diào)試界面進(jìn)行操作，或根據(jù)儀器報警提示找到對應(yīng)樣本，進(jìn)行手工加樣(適用時)。

8 檢驗過程

8.1性能驗證

共識13：實驗室應(yīng)基于試劑和儀器生產(chǎn)商說明書，建立檢測操作全流程的SOP；且在開展臨床常規(guī)檢測前，對整個檢測系統(tǒng)(含配套或匹配的試劑、耗材、儀器和軟件等)進(jìn)行獨(dú)立的性能驗證；建議至少包括方法符合率、重復(fù)性、檢出限(分析靈敏度)、攜帶和交叉污染率[6-8]；實驗室可根據(jù)檢測系統(tǒng)的功能及其臨床預(yù)期用途，增加驗證內(nèi)容。

8.1.1方法符合率 依據(jù)生產(chǎn)商說明書及相關(guān)指南[7]，實驗室可以使用含有ORF1ab基因和N基因雙靶RNA序列的已知濃度的假病毒陽性質(zhì)控品和陰性臨床樣本進(jìn)行方法符合率驗證，陽性質(zhì)控品應(yīng)盡量與待測臨床樣本基質(zhì)接近且包含接近檢出限的濃度水平。方法符合率應(yīng)達(dá)到100%。

8.1.2重復(fù)性 當(dāng)重復(fù)測試同一樣本并引入多個變量時，應(yīng)評估檢測系統(tǒng)的可重復(fù)性。可由不同的操作人員在不同的日期運(yùn)行檢測系統(tǒng)，以評估可重復(fù)性。如果實驗室擁有多套檢測系統(tǒng)，需進(jìn)行檢測系統(tǒng)間結(jié)果可比性的評估；如果一套檢測系統(tǒng)中包含多臺擴(kuò)增儀或擴(kuò)增模塊，需進(jìn)行擴(kuò)增儀或模塊間結(jié)果可比性的評估。重復(fù)性或結(jié)果可比性應(yīng)滿足檢測試劑說明書中聲明的要求。

8.1.3檢出限(分析靈敏度) 檢出限提供對特定靶標(biāo)分析靈敏度的度量，是指可以準(zhǔn)確檢測并與陰性樣本明確區(qū)分的，且在≥95%的重復(fù)樣本中具有一致性的檢測能力。應(yīng)采用定值標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(如國際參考品、國家參考品、廠家參考品)，分別對至少ORF1ab基因和N基因雙靶標(biāo)進(jìn)行檢出限的驗證，且驗證結(jié)果數(shù)值應(yīng)不高于試劑使用說明書聲明的檢出限。

8.1.4攜帶或交叉污染率 交叉污染驗證的目的是檢驗核酸提取過程中的防污染能力。通常使用棋盤法，即高拷貝陽性質(zhì)控品和臨床陰性樣本交叉放置，按照設(shè)備最大提取通量進(jìn)行驗證，計算攜帶或交叉污染率。

8.2質(zhì)量控制

共識14：新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)涉及儀器類別或功能模塊多、環(huán)節(jié)繁雜且易受干擾，實驗室在參考生產(chǎn)商說明書進(jìn)行性能驗證的前提下，還應(yīng)針對部分關(guān)鍵環(huán)節(jié)設(shè)置性能參數(shù)，并對這些參數(shù)通過定期評審，分析其質(zhì)量控制的有效性。性能參數(shù)包括但不限于加樣失敗率、移液殘留率、機(jī)械臂定位誤差率、核酸提取效率、基因擴(kuò)增效率、假陽性率、假陰性率、內(nèi)標(biāo)污染率，以對檢測系統(tǒng)的全流程質(zhì)量控制提供保障。

在加樣、體系配制和移液環(huán)節(jié)，需要分析加樣失敗率、機(jī)械臂定位誤差率；在核酸提取環(huán)節(jié)，建議采用生產(chǎn)商推薦方法進(jìn)行核酸提取效率的評估，適用時可分析提取核酸的純度、濃度/提取產(chǎn)率、完整性；在基因擴(kuò)增環(huán)節(jié)，需要分析整體擴(kuò)增曲線的熒光值、基線和閾值線狀況等，間接評估擴(kuò)增效率[7]；在防污染環(huán)節(jié)，需在檢測系統(tǒng)內(nèi)部各區(qū)域(如加樣區(qū)、提取區(qū)、體系配制區(qū)、加模板區(qū)、擴(kuò)增區(qū)等)定期監(jiān)測“清潔液擦拭”和“紫外線照射”等防核酸/擴(kuò)增子污染措施的有效性。

共識15：建議對新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)制定室內(nèi)質(zhì)量控制措施，包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溯源性、外部室內(nèi)質(zhì)控品的選擇、批長度等。

8.2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溯源性 生產(chǎn)商需提供使用國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)“2019-nCoV核酸檢測試劑國家參考品(批號：370099-202001)”進(jìn)行分析系統(tǒng)正確性驗證的報告。

8.2.2外部室內(nèi)質(zhì)控品的選擇 應(yīng)設(shè)置外部陰、陽性室內(nèi)質(zhì)控品監(jiān)測擴(kuò)增效率，陽性質(zhì)控品至少覆蓋ORF1ab基因和N基因2個靶序列，其濃度分別為試劑盒各靶點檢出限的1～1.5倍；3個陰性質(zhì)控分別以放置在試劑配制區(qū)、樣本制備區(qū)和擴(kuò)增檢測區(qū)監(jiān)控環(huán)境核酸污染的生理鹽水/DEPC處理水為質(zhì)控品。

8.2.3批長度 實驗室按照每日或每批次檢測的樣本量及其檢測系統(tǒng)分析性能，設(shè)立室內(nèi)質(zhì)控批長度?！半S機(jī)處理式檢測系統(tǒng)”按工作組(即人員班次)設(shè)置，原則上每組不超過8 h；“批處理式檢測系統(tǒng)”按每批(即每反應(yīng)板)設(shè)置。

8.3室間質(zhì)量評價

共識16：實驗室應(yīng)常態(tài)化參加國家級或省級臨床檢驗中心組織的新冠病毒核酸檢測室間質(zhì)量評價。不按要求參加室間質(zhì)評或室間質(zhì)評結(jié)果不合格，不得開展檢測。對檢測量大以及承擔(dān)重點人群篩查等任務(wù)的實驗室，要適當(dāng)增加室間質(zhì)評的頻率。

室間質(zhì)評計劃應(yīng)針對靈敏度、特異性和重復(fù)性等關(guān)鍵性能指標(biāo)選擇質(zhì)控品組合進(jìn)行評價，100%符合為合格。

9 檢驗后過程

9.1質(zhì)控分析

共識17：同常規(guī)新冠核酸檢測系統(tǒng)，新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)也應(yīng)該高度重視基線和閾值線的調(diào)整，內(nèi)標(biāo)質(zhì)控以及外部陰、陽質(zhì)控品的分析和判斷。

9.1.1內(nèi)、外部質(zhì)控 內(nèi)部(內(nèi)標(biāo))質(zhì)控可監(jiān)控從采樣、提取到擴(kuò)增的整個檢測過程，對采樣質(zhì)量、樣本保存和運(yùn)輸情況以及實驗操作是否規(guī)范進(jìn)行總體分析。使用新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)的實驗室應(yīng)重視內(nèi)、外部質(zhì)控的狀況，全流程自動化雖可有效避免人工操作造成的隨機(jī)誤差，但吸取、移液、加樣、貼膜和轉(zhuǎn)板等機(jī)械系統(tǒng)的系統(tǒng)誤差需要通過內(nèi)標(biāo)曲線分析和陽性外部質(zhì)控品的連續(xù)監(jiān)測得到更好的監(jiān)控。

9.1.2外部質(zhì)控判斷規(guī)則 弱陽性質(zhì)控品測定為陽性，陰性質(zhì)控品全部測定為陰性，視為“在控”；反之，則為“失控”。如陽性質(zhì)控“失控”，則應(yīng)對所有陰性樣本進(jìn)行重新檢測；如陰性質(zhì)控“失控”，則應(yīng)對所有陽性樣本進(jìn)行重新檢測。

9.2結(jié)果分析

共識18：新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)的結(jié)果判讀規(guī)則應(yīng)在實驗室性能驗證滿足要求的基礎(chǔ)上，參照檢測試劑說明書進(jìn)行。通常半自動或人工操作時會對一些“翹尾”或“異常曲線”通過基線和/或閾值線的微調(diào)整進(jìn)行進(jìn)一步分析，新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)如為自動化判讀模式，實驗室應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎對待這些“翹尾”或“異常曲線”的結(jié)果判定，必要時轉(zhuǎn)換為手動模式進(jìn)行人工判讀。

封膜或封蓋后反應(yīng)體系的氣泡和液面監(jiān)測及預(yù)警是目前新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)亟需解決的技術(shù)難點之一，上述情況可能會引起灰區(qū)范圍內(nèi)出現(xiàn)異常曲線，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。實驗室應(yīng)在性能驗證基礎(chǔ)上，結(jié)合本實驗室全自動PCR檢測系統(tǒng)的技術(shù)特點和日常積累的實踐經(jīng)驗做出綜合判斷，降低結(jié)果錯報的風(fēng)險。

9.3結(jié)果審核及報告

共識19：新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)的結(jié)果報告規(guī)則，應(yīng)同常規(guī)新冠核酸檢測系統(tǒng)一致，無論系統(tǒng)是否設(shè)置自動報告程序，均需要經(jīng)人工判斷和審核后報告，必要時要對儀器自動設(shè)置的閾值線依據(jù)試劑盒陰陽性對照的擴(kuò)增曲線作手動調(diào)整。單靶擴(kuò)增和/或Ct灰區(qū)“陽性”必須啟用實驗室復(fù)檢規(guī)則，符合試劑盒說明書判斷規(guī)則后方能報告。

共識20：新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)應(yīng)充分發(fā)揮信息化、智能化和人性化的優(yōu)勢，提高檢測效率，縮短報告時間，降低生物安全風(fēng)險。

新冠核酸全自動PCR檢測系統(tǒng)可以通過與LIS對接做到結(jié)果回傳，避免了傳統(tǒng)工作流程中人工核對易發(fā)生錯誤的環(huán)節(jié)，提高工作效率，加快檢測速度和報告時間；可以實現(xiàn)操作人員在非實驗室區(qū)域通過網(wǎng)絡(luò)客戶端對儀器和軟件進(jìn)行遠(yuǎn)程共享控制，完成實時查看實驗進(jìn)度、分析實驗結(jié)果、傳輸實驗數(shù)據(jù)等操作，降低生物安全風(fēng)險；可設(shè)置樣本管理、信息追蹤等功能，與新冠結(jié)果上報系統(tǒng)、數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行無縫對接，減少人員工作量。

執(zhí)筆：趙建華、何軍、夏欣一、王琳、楊傳坤、楊陽、李世寶

共識倡議、終審：許斌

參與本共識修訂的人員及單位(按姓氏漢語拼音順序排列)：

何軍(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院)、胡偉鋒(鄭州安圖生物工程股份有限公司)、李世寶(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)、林曉成(廈門安普利生物工程有限公司)、陸根生(江蘇碩世生物科技股份有限公司)、汪俊軍(中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)、吳國球(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院)、王琳(蘇州市獨(dú)墅湖醫(yī)院)、王衛(wèi)萍(中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)、夏欣一(中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)、徐婷(江蘇省人民醫(yī)院)、俞楊(南京市第一醫(yī)院)、楊陽(中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)、楊傳坤(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院)、趙建華(江蘇省臨床檢驗中心)。

志謝：感謝江蘇碩世生物科技股份有限公司、廈門安普利生物工程有限公司、鄭州安圖生物工程股份有限公司提供技術(shù)支持。

利益沖突：作者均聲明與志謝廠家不存在利益沖突。