國外大豆種質(zhì)資源對大豆花葉病毒株系3（SMV3）的抗性評價

齊廣勛 董嶺超 張 偉 袁翠平 劉曉冬王英男 董英山 王玉民 趙洪錕

（1吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所，130033，吉林長春；2吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，136100，吉林公主嶺）

大豆花葉病毒（soybean mosaic virus，SMV）病是大豆生產(chǎn)中的主要病毒性病害之一[1]。病害導(dǎo)致豆莢數(shù)量減少、百粒重降低、籽粒斑駁、蛋白質(zhì)和脂肪含量降低，嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。流行年份可造成減產(chǎn)15%～50%，嚴(yán)重時可達70%以上，甚至絕產(chǎn)[2-4]。減少種子攜帶病毒傳播、噴灑化學(xué)藥劑等措施均不能有效防治。因此，培育抗病品種是最經(jīng)濟、有效、安全的防治方法，而篩選抗性材料是培育抗性新品種的前提和基礎(chǔ)。自2003年起，我國已將大豆對花葉病毒的抗性作為品種審定的重要指標(biāo)之一[5]。近年來培育的大豆新品種對SMV的抗性有一定程度的提高。

東北地區(qū)是我國大豆的主產(chǎn)區(qū)，大豆花葉病毒病發(fā)生嚴(yán)重。病毒株系主要有SMV1、SMV2和SMV3，其中SMV3致病性強、抗原少，為強毒株系[6-9]。近20年來，國內(nèi)學(xué)者在SMV3抗性鑒定方面做了大量研究工作。鄭翠明等[10]從348份大豆種質(zhì)資源中鑒定出113份高抗資源，其中，從77份國外種質(zhì)資源中鑒定出17份高抗資源。徐剛等[11]從107份栽培大豆和130份野生大豆資源中分別鑒定出3和4份高抗資源。李文福等[12]從556份大豆資源中鑒定出成株和籽粒斑駁均表現(xiàn)抗性的資源76份。李開盛等[13]從108份野生大豆和83份栽培大豆中分別鑒定出4和13份高抗資源。滕衛(wèi)麗等[14]從103份大豆資源中鑒定出33份高抗資源。張偉等[15]對來自吉林省的54份資源材料進行抗性鑒定，其中有17份表現(xiàn)高抗。高賽男等[16]從46份農(nóng)家種大豆資源中篩選出6份高抗資源。張子戌等[4]從主要來源于東北地區(qū)的349份大豆種質(zhì)資源中鑒定出6份高抗資源。陳愛國等[17]從來自遼寧省的120份野生大豆資源中鑒定出6份抗性資源。盡管國內(nèi)學(xué)者篩選出一批抗花葉病毒的大豆資源，但由于我國大豆遺傳基礎(chǔ)狹窄，綜合性狀突出的資源不能滿足大豆抗花葉病毒育種工作的需求。因此，篩選綜合性狀突出的優(yōu)異資源仍是培育新品種工作的關(guān)鍵。

國外大豆種質(zhì)資源與我國大豆種質(zhì)資源存在明顯的遺傳差異，國外優(yōu)異種質(zhì)資源的引進是拓寬我國大豆遺傳基礎(chǔ)的重要基因來源[18]，引進的優(yōu)異資源在提高我國大豆品種生態(tài)適應(yīng)性、產(chǎn)量、抗性和改善品質(zhì)等方面具有重要意義[19-20]。本研究以222份國外大豆種質(zhì)資源為試驗材料，接種我國東北地區(qū)強毒株系SMV3進行鑒定評價，旨在篩選高抗種質(zhì)資源，為抗大豆花葉病毒遺傳改良提供優(yōu)異資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的222份國外大豆資源來源于美國、俄羅斯和日本等11個國家，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。感病對照品種為九農(nóng)9號，抗病對照品種為中黃35。大豆花葉病毒株系為東北地區(qū)強毒株系SMV3，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供。

1.2 試驗設(shè)計

鑒定試驗于2017年和2018年的7月在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所（吉林公主嶺，124°48′E，43°31′N）試驗田進行。2017年對供試材料進行SMV3初步鑒定，2018年對2017年篩選的高抗資源進行重復(fù)鑒定。試驗設(shè)計為隨機區(qū)組排列，行長3m，1行區(qū)，穴距15cm，等距點播。

采用人工摩擦接種的方法將-80℃超低溫冰箱冷凍的典型病葉接種在高感品種九農(nóng)9號植株上繁殖，癥狀明顯后采集典型新鮮葉片并剪碎，按照1:20比例加入0.1mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液，于冷凍條件下研磨成勻漿作為接種菌液。

待第1片三出復(fù)葉充分展開時，將接種菌液（含2%粒徑22μm的金剛砂）搖勻，用短毛刷人工摩擦微創(chuàng)傷葉面，并接種SMV3菌液。以九農(nóng)9號為感病對照，中黃35為抗病對照，檢測環(huán)境條件和接種操作對鑒定試驗的穩(wěn)定性。

1.3 抗病評價

接種20～30d后，待病害特征明顯、癥狀穩(wěn)定時對每份材料進行單株調(diào)查。單株病情分級標(biāo)準(zhǔn)參照張子戌等[4]的鑒定方法，將病情級別劃分為6級：0級、1級、3級、5級、7級和9級（表1），記錄病情級別和調(diào)查的總株數(shù)，計算病情指數(shù)（DI）。根據(jù)病情指數(shù)按5級劃分，確定抗感類型（表2）。

表1 大豆抗花葉病毒病鑒定病情級別及癥狀Table 1 Disease level and symptoms in resistance evaluation to soybean mosaic virus

表2 對大豆花葉病毒病抗性評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Evaluation criteria for soybean resistance to mosaic virus disease

式中，DI為病情指數(shù)，s為病情級別的代表數(shù)值，n為病情級別的植株數(shù)，N為調(diào)查總株數(shù)，S為最高病情級別的代表數(shù)值。

1.4 農(nóng)藝性狀調(diào)查

供試材料的農(nóng)藝性狀調(diào)查參照《大豆種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[21]進行。分別于2017年和2018年的4月30日在吉林公主嶺繁殖圃種植，盛花期調(diào)查花色和茸毛色，成熟期調(diào)查株高和生育日數(shù)，收獲后調(diào)查種子有關(guān)性狀。種質(zhì)資源來源地和播種類型等參照《中國大豆品種資源目錄》[22-23]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019和SPSS 19軟件對數(shù)據(jù)進行整理、病情指數(shù)分布、單變量一般線性模型對病情指數(shù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引進種質(zhì)資源對SMV3抗性初步鑒定

由圖1可知，鑒定結(jié)果表明，供試材料病情指數(shù)呈連續(xù)分布，變化范圍為12.82%～92.59%，抗性差異明顯。從表3可知，20份材料表現(xiàn)高抗，占供試材料的9.01%，其中10份來自美國，5份來自日本，3份來自韓國，2份來自加拿大；抗性材料有6份，占供試材料的2.70%；中抗材料有36份，占供試材料的16.22%；感病材料有155份，占供試材料的69.82%；高感材料有5份，占供試材料的2.25%。高抗資源集中分布在北美洲的美國和加拿大、東亞的日本和韓國。來自俄羅斯、巴西、德國和尼日利亞等國家的資源抗性級別均在中抗以下。來自意大利、泰國和朝鮮的資源均為感病級別。

圖1 國外222份大豆種質(zhì)資源病情指數(shù)分布Fig.1 Disease index distributions of 222 introduced soybean germplasm resources

表3 國外大豆種質(zhì)資源對SMV3抗性的統(tǒng)計Table 3 Resistance statistics to SMV3 of introduced soybean germplasm resources

2.2 高抗種質(zhì)資源重復(fù)鑒定

2018年對上年鑒定的20份高抗資源進行重復(fù)鑒定，2年均表現(xiàn)穩(wěn)定高抗的種質(zhì)資源有10份，占供試材料的4.51%。由表4可知，其中4份（WDD01215、WDD02286、WDD02292和WDD02355）來自日本，占日本材料（17份）的23.53%；3份（WDD00412、WDD01622和WDD03001）來自美國，占美國材料（159份）的1.89%；2份（WDD03137和WDD03156）來自加拿大，占加拿大（5份）材料的40.00%。其中，WDD03137和WDD03156在重復(fù)鑒定中病情指數(shù)均處于最低，表明對SMV3具有較強的抗性，WDD03137資源2年鑒定的平均病情指數(shù)最低，為7.40；1份（WDD02178）來自韓國，占韓國（4份）材料的25.00%。

表4 10份高抗資源病情指數(shù)及性狀特征Table 4 Disease index and characteristics of ten high resistance resources

對重復(fù)鑒定表現(xiàn)高抗資源進行方差分析（表5）表明，10份高抗資源間抗性較穩(wěn)定，差異不顯著（F=1.138，P＞0.05）。不同年份間方差分析結(jié)果表明，2年鑒定結(jié)果差異顯著（F=9.505，P＜0.05），2017年與2018年不同資源間的平均病情指數(shù)分別為15.49%和10.94%。穩(wěn)定高抗的10份資源可用于對SMV3抗性遺傳機制的研究，同時可為抗花葉病毒病新品種的培育提供親本材料。

表5 重復(fù)鑒定高抗資源抗性方差分析Table 5 Variance analysis of high resistance resources in repeated identification

2.3 高抗種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀分析

對10份高抗種質(zhì)資源的生育期、株高和百粒重等數(shù)量性狀及種皮、種臍、花色和茸毛色等質(zhì)量性狀調(diào)查（表4）表明，株高變幅為38.34～132.06cm，生育日數(shù)范圍為105～130d，百粒重變幅為12.20～23.88g，其變異系數(shù)分別為45.50%、8.48%和21.83%。其中，來源美國的3份資源百粒重普遍較?。?5.88、12.20、13.34g），平均13.81g；來源日本的4份資源百粒重最大（16.26、21.40、23.88、23.36g），平均21.23g。日本材料的株高最矮（57.58、45.34、48.78、38.34cm），平均 47.51cm；來自加拿大的2份材料株高最高（112.00、132.06cm），平均122.03cm。播種類型分為春播和夏播，春播類型有4份，占40%，分別來自加拿大2份、美國1份、日本1份；夏播類型的有6份，占60%，分別來自日本3份、美國2份、韓國1份。種皮顏色有黑和黃2種，黑種皮1份來自美國，占10%，黃種皮9份，占90%?；ㄉ譃榘谆ê妥匣ǎ谆?份均來自美國，占20%，紫花8份，占80%。種臍顏色分為黑、褐、黃3種，其中，黑臍2份，占20%，褐臍5份，占50%，黃臍3份，占30%。10份高抗資源的農(nóng)藝性狀遺傳變異豐富。

3 討論

本研究結(jié)果表明，國外大豆種質(zhì)資源在人工接種SMV3鑒定后，病情指數(shù)變異幅度較大，各個抗性級別均有種質(zhì)資源分布，說明在SMV3株系抗性上存在豐富的遺傳多樣性。2年重復(fù)鑒定出的穩(wěn)定高抗種質(zhì)資源占比總鑒定資源的4.51%，低于國內(nèi)其他學(xué)者[10,13-16]報道的研究結(jié)果。已有研究主要是選用國內(nèi)資源對東北大豆花葉病毒強毒株系SMV3進行鑒定，推測原因是國內(nèi)品種審定單位提高了對SMV3抗性品種選育標(biāo)準(zhǔn)，使得國內(nèi)品種對花葉病毒SMV3的抗性有所提高。而在國外，SMV3并不是流行株系，這些引進資源來源地分布不均勻，具有一定的地域性。且尚未見對我國東北強毒株系SMV3抗性鑒定評價的報道，可能缺少抗性基因所致。

精準(zhǔn)鑒定是合理利用的前提，抗大豆花葉病毒鑒定方法主要有田間蚜蟲感染、網(wǎng)室人工接種和田間人工接種等[24-26]。田間蚜蟲感染法易于操作、省時省力、貼近大田環(huán)境，但病毒數(shù)量及蚜蟲傳播均勻程度是影響鑒定結(jié)果的關(guān)鍵因素，且易受田間環(huán)境的影響。網(wǎng)室人工接種是最常見的鑒定方法，最大限度地保證了人工操作環(huán)境的一致性，但也是自然條件限制程度最大的方法。田間人工接種法最大限度地保證接種的均勻性，又能在自然環(huán)境下鑒定，同樣蚜蟲群體的傳播也是影響鑒定結(jié)果的因素。本試驗采用田間人工接種法鑒定，2年重復(fù)鑒定高抗種質(zhì)資源的平均病情指數(shù)分別為15.49%和10.94%，相對比較穩(wěn)定。從病情指數(shù)上分析，2017年田間人工接種鑒定發(fā)病情況重于2018年。但2017年鑒定出的20份高抗種質(zhì)資源在第2年的重復(fù)鑒定中有10份表現(xiàn)高抗（HR）級別，其余10份材料病情指數(shù)在22.81%～33.33%，均表現(xiàn)為抗性級別，推測花葉病毒發(fā)病的輕重與不同年份大田氣候條件的影響有關(guān)。

國外大豆種質(zhì)資源為我國的大豆遺傳改良做出了重要貢獻。據(jù)統(tǒng)計，我國在1923-1995年共育成了651個大豆品種，其中有224個品種具有國外大豆血緣，如合豐25、東農(nóng)36和冀豆7號等[19]。基于分子標(biāo)記的遺傳多樣性分析表明，美國和日本的大豆品種與我國大豆品種間存在明顯遺傳差異，是重要的優(yōu)異基因來源[18]。本試驗重復(fù)鑒定的10份高抗種質(zhì)資源來自日本、美國、加拿大和韓國，來源廣泛，且在播種類型和農(nóng)藝性狀方面存在豐富的遺傳變異。這些高抗種質(zhì)資源有利于拓寬我國大豆種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)，為下一步的抗SMV3的機理研究及對我國東北生態(tài)區(qū)抗SMV3新品種培育提供基礎(chǔ)材料。

4 結(jié)論

本研究通過田間人工接種的方法對國外引進的222份大豆種質(zhì)資源進行了SMV3的抗性鑒定。重復(fù)鑒定出10份高抗資源，占供試材料的4.51%，分別來自東亞的日本和韓國，北美洲的美國和加拿大。10份高抗資源的株高為38.34～132.06cm，生育日數(shù)為105～130d，百粒重為12.20～23.88g，其變異系數(shù)分別為45.50%、8.48%和21.83%。在種皮、種臍、花色和茸毛色等性狀及播種類型方面存在明顯差異。