D-、L-和DL-蛋氨酸的太赫茲時(shí)域光譜研究

黃玉青 李 茜 李曉輝 賴小平 文岐業(yè)

（1.太赫茲科技應(yīng)用（廣東）有限公司，廣東 廣州 510000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510000；3.成都電子科技大學(xué)，四川 成都 610000）

0 前言

太赫茲波（Terahertz，THz）是指頻率為0.1 THz～10.0 THz、波長(zhǎng)為0.03 mm～3.00 mm的電磁輻射，其波段介于微波與紅外之間[1]。對(duì)比其他頻段的電磁波，THz 波光子能量低，穿透深度深；許多中藥在THz 的波段中具有特征吸收峰，因此可以直接對(duì)中藥進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

手性分子是在化學(xué)結(jié)構(gòu)上呈鏡像對(duì)稱而又不能完全重合的分子[2]，手性藥物對(duì)映體常具有不同的藥理活性及毒性，在體內(nèi)的代謝情況也不同[3]。當(dāng)前，藥物研究的發(fā)展趨勢(shì)是療效高、毒副作用小以及用藥量少，因此一般要求手性藥物以光學(xué)純的單一異構(gòu)體形式應(yīng)用于臨床。該研究利用太赫茲光譜技術(shù)區(qū)分蛋氨酸對(duì)映異構(gòu)體，并利用系統(tǒng)指紋定量法建立蛋氨酸濃度差與Pm的線性關(guān)系，將其用于定量分析。

1 試驗(yàn)材料

蛋氨酸購(gòu)于西亞化學(xué)科技（山東）有限公司，D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸的純度分別為99.5%、99.5%和99.2%；聚乙烯購(gòu)于上海陽(yáng)勵(lì)機(jī)電科技有限公司，分析純，型號(hào)為PE-18180。

2 試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)所用儀器如下：1）太赫茲時(shí)域光譜儀（CCT-1800型，太赫茲科技應(yīng)用（廣東）有限公司）。這是一種利用脈沖太赫茲（THz）波進(jìn)行光譜檢測(cè)的裝置，飛秒激光器輸出激光脈沖，經(jīng)過(guò)分光片后光速分為2 束，一束作為泵浦光，另一束作為探測(cè)光，泵浦光經(jīng)反射傳輸?shù)桨l(fā)射天線上，在偏置電壓的作用下產(chǎn)生太赫茲波，該太赫茲波經(jīng)透射或反射等方式接收攜帶的被測(cè)樣品的信息，分析得到頻域譜、吸收譜、折射率譜以及相位譜等光學(xué)物理參數(shù)。在測(cè)量中能夠同時(shí)獲得太赫茲（THz）脈沖的振幅和相位信息，對(duì)時(shí)間波形進(jìn)行傅里葉變換能直接得到樣品的吸收系數(shù)、折射率等光學(xué)參數(shù)，具有較高的探測(cè)靈敏度和較寬的探測(cè)帶寬。2）壓片機(jī)（HY-12 型，天津天光新光學(xué)儀器有限公司）。3）壓片模具（HF-2A 型，天津天光新光學(xué)儀器有限公司）。

3 試驗(yàn)步驟

稱取D-蛋氨酸（L-蛋氨酸、DL-蛋氨酸）粉末，按20%、40%、60%、80%以及100%的質(zhì)量比例與聚乙烯粉末進(jìn)行混合，聚乙烯粉提前烘干2 h，使用瑪瑙研缽將兩者混合均勻后置于壓片模具上，壓強(qiáng)設(shè)置為24 MPa，將其壓制成直徑13.0 mm、厚度1.1 mm～1.6 mm 的圓形薄片，每個(gè)比例制10 個(gè)片，共50 片。

儀器預(yù)熱20 min，因?yàn)樘掌潓?duì)水分敏感，所以需要提前通一段時(shí)間的氮?dú)猓耘懦龢悠穫}(cāng)的水分，太赫茲時(shí)域光譜儀透射光譜穿過(guò)樣品，獲得參考和樣品的時(shí)域信號(hào)，通過(guò)傅里葉變換來(lái)獲得頻域信息，根據(jù)Dorney 提出的THz光學(xué)參數(shù)提取模型，獲得樣品的吸收系數(shù)譜線。

4 結(jié)果分析

系統(tǒng)指紋定量法將雙定性相似度（SF與SF'）均值Sm稱為宏定性相似度（公式（1）），用其整體監(jiān)測(cè)化學(xué)指紋數(shù)量和分布比例；將雙定量相似度（C與P）均值Pm稱為宏定量相似度（公式（2）），其可以監(jiān)測(cè)化學(xué)指紋的整體含量；通過(guò)結(jié)合Sm、Pm和α來(lái)鑒定中藥質(zhì)量的方法稱為系統(tǒng)指紋定量法。據(jù)此將中藥質(zhì)量劃分為8 級(jí)（表1）。規(guī)定宏定性相似度大于0.9 為必要條件，任選一組宏定量相似度，將其控制在80%～120%，組內(nèi)相差不超過(guò)10%為合格。系統(tǒng)指紋定量法是對(duì)中藥系統(tǒng)指紋進(jìn)行整體定量鑒別，是對(duì)中藥質(zhì)量進(jìn)行整體量化評(píng)價(jià)的可靠、便捷且有效的方法。該方法找到了中藥質(zhì)量控制的核心技術(shù)，適合中國(guó)中藥的現(xiàn)代化質(zhì)量控制[4-6]。

表1 中藥質(zhì)量分級(jí)

式中：Xi為樣品峰面積，描述樣品指紋峰積分大小；yi為對(duì)照品峰面積，描述對(duì)照品指紋峰積分大小；SF為定性相似度，定性描述化學(xué)成分?jǐn)?shù)量和分布比例，大峰掩蔽小峰；為比率定性相似度，定性等權(quán)描述化學(xué)成分?jǐn)?shù)量和比例，大、小峰等權(quán)；Sm為宏定性相似度，雙定性相似度（SF與）均值；P為定量相似度，定量描述總化學(xué)成分宏觀含量，大、小峰等權(quán)；C為投影含量相似度，定量描述總化學(xué)成分宏觀含量，大峰掩蔽小峰；Pm為宏定量相似度，雙定量相似度（C與P）均值；α為相關(guān)系數(shù)，描述樣品和對(duì)照品的差異。

通過(guò)太赫茲時(shí)域光譜儀測(cè)得參考和樣品的時(shí)域信號(hào)，經(jīng)傅里葉轉(zhuǎn)換得到吸收系數(shù)譜。獲得D-蛋氨酸、L-蛋氨酸、DL-蛋氨酸在不同濃度（20%、40%、60%、80%以及100%）下的太赫茲吸收系數(shù)譜曲線，吸收系數(shù)譜除了包括樣品自身的信息外，還包括其他無(wú)關(guān)的信息和噪聲，例如點(diǎn)噪聲、樣品背景及雜散光等，考慮樣品的多重反射及高頻段噪聲帶來(lái)的影響，對(duì)吸收系數(shù)譜進(jìn)行預(yù)處理，并截取0.1 THz～4.0 THz 有效頻譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

取末指紋峰為參照物峰，計(jì)算各峰統(tǒng)一化相對(duì)時(shí)間，將其作為橫坐標(biāo)，取積分最大峰為另一參照物峰，計(jì)算各峰統(tǒng)一化相對(duì)積分，將其作為縱坐標(biāo)，所作圖稱為統(tǒng)一化色譜指紋圖譜。根據(jù)公式（2）計(jì)算得到相應(yīng)的Pm值，見表2。

表2 D-蛋氨酸、L-蛋氨酸、DL-蛋氨酸系統(tǒng)指紋定量法評(píng)價(jià)結(jié)果表

通過(guò)分析可以得到D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸的宏定量相似度（Pm值）隨濃度比例的變化均呈較好的線性關(guān)系（R2>95%），可用于對(duì)應(yīng)蛋氨酸的含量分析。其中，D-蛋氨酸的線性公式為y=1.329x+79.39（R2>0.9562），L-蛋氨酸的線性公式為y=1.251x+81.1（R2>0.9860），DL-蛋氨酸的線性公式為y=1.101x+86.95（R2>0.9420）。

從計(jì)算結(jié)果來(lái)看，用太赫茲光譜數(shù)據(jù)所得的Pm值擬合良好，可用于實(shí)際樣品含量的測(cè)定，為D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸的定量分析提供了新的手段。采取相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果顯示，線性公式擬合良好，預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果差異?。≧SD<0.2%）。

對(duì)D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸THz 吸收系數(shù)譜進(jìn)行對(duì)比，取0.1 THz～4.0 THz 的THz 吸收系數(shù)譜，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，3 個(gè)樣品的吸收光譜都有明顯的特征峰，DL-蛋氨酸在1.9 THz 處有特征峰，L-蛋氨酸在2.9 THz 處有特征峰，D-蛋氨酸在3.1 THz處有特征峰，三者有顯著差異。L-蛋氨酸和D-蛋氨酸為手性異構(gòu)體，它們的分子構(gòu)造相同且構(gòu)型互為鏡像關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果顯示，蛋氨酸手性異構(gòu)體的光譜圖有微小區(qū)別。同時(shí)，蛋氨酸手性異構(gòu)體與它們的外消旋化合物吸收峰的位置和吸收強(qiáng)度都存在明顯差別。該結(jié)果表明，可以利用太赫茲光譜技術(shù)有效地對(duì)蛋氨酸手性異構(gòu)體和它們的外消旋化合物進(jìn)行鑒別，從而為利用太赫茲技術(shù)分辨化合物結(jié)構(gòu)上的微小差異來(lái)檢測(cè)和分析物質(zhì)提供了新手段。對(duì)不含重原子的固體來(lái)說(shuō)，遠(yuǎn)紅外區(qū)的吸收主要是分子間的振動(dòng)，主要包括分子間的相互作用及晶格振動(dòng)，晶體內(nèi)部的分子或離子作為一個(gè)整體，其在晶格中的相對(duì)運(yùn)動(dòng)（平動(dòng)、扭動(dòng)或擺動(dòng)）所引起的振動(dòng)吸收。

圖1 同一濃度下D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸的對(duì)比圖

指紋圖譜是近年來(lái)中藥質(zhì)量控制的熱點(diǎn)，2009 年，孫國(guó)祥等人[6-7]提出采用系統(tǒng)指紋定量法對(duì)中藥（材）進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，其是在對(duì)指紋系統(tǒng)宏觀定性分析合格的基礎(chǔ)上，直接對(duì)系統(tǒng)指紋進(jìn)行整體定量分析，是對(duì)系統(tǒng)的宏觀量化評(píng)價(jià)，采取宏觀和綜合量化的手段控制其真實(shí)性、穩(wěn)定性和一致性的質(zhì)量控制模式，并結(jié)合復(fù)雜性科學(xué)理論和方法進(jìn)行控制。太赫茲波對(duì)生物大分子具有明顯的共振特性，使該技術(shù)在食品、藥品以及病毒微生物領(lǐng)域具有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。由于生物大分子振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)大多位于THz 波段，并表現(xiàn)出明顯吸收特性，因此生物有機(jī)分子間存在的弱相互作用（例如氫鍵）、大分子的振動(dòng)、偶極子的旋轉(zhuǎn)和振動(dòng)躍遷以及晶格低頻振動(dòng)均能響應(yīng)特征性太赫茲“指紋”波譜，不同的分子（例如單鏈或雙鏈的 DNA 分子）或同一分子不同的變異形公式（例如蛋白質(zhì)的不同構(gòu)形和構(gòu)象）在太赫茲光譜中顯示出不同的吸收率和折射率。

吉特等人[7]利用太赫茲技術(shù)鑒定D-青霉胺、L-青霉胺和DL-青霉胺在0.2 THz～1.8 THz 有顯著差異，陳濤等人[8]對(duì)L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖和DL-阿拉伯糖進(jìn)行太赫茲光譜研究，三者在0.4 THz～1.8 THz 有顯著差異，趙容嬌等人[9]對(duì)L-福多司坦和DL-福多司坦進(jìn)行太赫茲研究，兩者有顯著差異。手性藥物的檢查逐漸成為藥學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。對(duì)畜禽類來(lái)說(shuō)，其自身不能合成蛋氨酸，須從飼料中攝取氨基酸，DL-蛋氨酸是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)主要的甲基供體，對(duì)動(dòng)物體生理代謝有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用。與DL-蛋氨酸相比，日糧補(bǔ)充L-蛋氨酸對(duì)腸道氧化還原和發(fā)育具有更好的效果，生長(zhǎng)性能更高。L-蛋氨酸具有生物學(xué)效價(jià)高的優(yōu)勢(shì)，在生產(chǎn)實(shí)踐中可以直接減少日糧L-蛋氨酸的添加量，且L-蛋氨酸直接參與蛋白質(zhì)生物合成，有助于肉雞生長(zhǎng)。

5 結(jié)語(yǔ)

利用太赫茲光譜技術(shù)獲得D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸在0.1 THz～4.0 THz 波段的吸收譜，三者的特征峰存在顯著差異，這些差異可進(jìn)行有效定性鑒別。通過(guò)傅里葉轉(zhuǎn)換得到0.1 THz～4.0 THz 太赫茲吸收系數(shù)譜，D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸在不同濃度下所對(duì)應(yīng)的Pm值呈線性關(guān)系，R2>0.95，線性關(guān)系良好，可用于計(jì)算單一物質(zhì)的含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，太赫茲光譜技術(shù)對(duì)蛋氨酸對(duì)映異構(gòu)體和濃度差異均具有較高的敏感性，將成為手形藥物檢測(cè)和定量分析的新方法。

后續(xù)將對(duì)D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸混合樣品進(jìn)行含量測(cè)定試驗(yàn)，把純D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸太赫茲吸收光譜作為標(biāo)準(zhǔn)譜，對(duì)它們混合樣品的太赫茲吸收光譜進(jìn)行擬合，將得到D-蛋氨酸、L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸在混合樣品中的相對(duì)含量，太赫茲光譜技術(shù)對(duì)蛋氨酸對(duì)映異構(gòu)體有較高的敏感性，預(yù)估其可以成為一種手形藥物檢測(cè)和定量分析中的新手段。