無瓣海桑葉斑病及其病原菌的生物學特性研究*

黃 華 馮金艷 陸建康 張良軍劉幸兒 田龍艷

（1. 肇慶市封開縣林業(yè)局森林病蟲害防治檢疫站，廣東 肇慶 526500；2.廣東省森林培育與保護利用重點實驗室/廣東省林業(yè)科學研究院，廣東 廣州 510520）

擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis由Steyaert 命名，他將廣義盤多毛孢屬中分生孢子具5 個細胞、中間具有3 個深色細胞的種歸入Pestalotiopsis屬[1]。按照最新的分類系統(tǒng)擬盤多毛孢屬屬于子囊菌門，盤菌亞門，糞殼菌綱，炭角菌亞綱，黑盤孢目，被毛孢科[2]。這類真菌在熱帶和亞熱帶地區(qū)分布最為廣泛，寄主專一性不高，適應能力強，可引起多種植物病害，是一類重要的植物病原菌[3-4]。

無瓣海桑Sonneratia apetala屬于桃金娘目海?？坪Ｉ俚募t樹樹種[5]。天然分布于孟加拉國、印度等國家。由于無瓣海桑具有生長快、適應性強、能改善灘涂立地條件、加快灘涂綠化等特點，1985 年被首次引種到我國海南島，在20 世紀90年代又從海南引種到廣東、廣西、福建等地[6]。目前已成為我國華南沿海生態(tài)保護與恢復中最重要的紅樹樹種[7-8]。

無瓣海桑在我國蟲害危害較為嚴重[9-10]，病害危害較輕，有關無瓣海桑病害的研究尚鮮有報道[11]。前期研究發(fā)現無瓣海桑病葉組織分離到菌株WBHS-YB-2A，為擬盤多毛孢屬新種Pestalotiopsis sonneratiae（未發(fā)表數據）。為了進一步確定無瓣海桑葉斑病的病原菌，本研究采用柯赫氏法則測定WBHS-YB-2A 的致病性、進行形態(tài)學觀察和生物學特性等研究，以期明確無瓣海桑葉斑病及其病原菌的生物學特性，為無瓣海桑葉斑病的識別及防治提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Pestalotiopsis sonneratiae： 菌 株WBHS-YB-2A，保藏于中國林業(yè)科學研究院，保藏號CFCC 57390。PDA 培養(yǎng)基：去皮土豆200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂粉15 g·L-1，pH 調至7.0。察氏培養(yǎng)基：KH2PO42.0 g·L-1，MgSO41.0 g·L-1，KNO32.0 g·L-1，葡萄糖20.0 g·L-1，瓊脂20.0 g·L-1，pH 調至7.0。

1.2 試驗方法

在PDA 平板上活化菌株WBHS-YB-2A，轉接后培養(yǎng)5 d，備用。取新鮮健康的葉片清洗2次，用70%的酒精進行表面消毒，無菌水清洗2次，晾干后置于鋪有潤濕濾紙的培養(yǎng)皿中，備用。在菌株WBHS-YB-2A 菌落邊緣用打孔器取直徑5 mm 菌餅，接種于葉片上，以空白PDA 培養(yǎng)基作對照，設置8 個重復。放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（25 ℃，12 h 光照培養(yǎng)；22 ℃，12 h 暗培養(yǎng)），每日觀察發(fā)病情況，記錄病斑大小與發(fā)病率。采用離體接種方法進行致性測定[12-13]。

1.3 形態(tài)學特征

將活化的菌株WBHS-YB-2A 接種于直徑9 cm的PDA 平板上，(25±1)℃恒溫培養(yǎng)10 d。每隔2 d 觀察菌落培養(yǎng)形態(tài)，待產孢后，挑取分生孢子于顯微鏡下觀察形態(tài)特征。

1.4 生物學特性分析

1.4.1 碳源試驗 以察氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，其中碳源葡萄糖以可溶性淀粉、玉米粉、麥芽糖、蔗糖、果糖等量替換，配制成含糖量相同碳源不同的培養(yǎng)基[14-15]，滅菌后倒平板，接入5 mm 菌餅，以基礎培養(yǎng)基為對照，每個處理3 個重復。置于(25±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中，每2 d 觀察產孢、菌絲致密度等情況，同時測量菌落直徑，記錄生長速率。

1.4.2 氮源試驗 以察氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，其中的氮源KNO3以酵母浸粉、谷氨酸、尿素、蛋白胨等量替換，配制成含氮量相同氮源不同的培養(yǎng)基。接種、培養(yǎng)與數據統(tǒng)計與碳源試驗處理一致。

1.4.3 溫度試驗 以PDA 培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，將5 mm 菌餅接種到PDA 平板培養(yǎng)基中央，分別放入10、15、20、25、30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種、培養(yǎng)與數據統(tǒng)計與碳源試驗處理一致。

1.4.4 pH 試驗 以PDA 培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，用0.1 mol·L-1NaOH 和0.1 mol·L-1HCl，將培養(yǎng)基pH 分別調為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。按碳源試驗的方法進行培養(yǎng)基的配制、接種、觀察與測量。

1.5 數據分析

利用軟件Microsoft Office Excel 2010 和SPSS 25.0 進行Duncan 氏新復極差差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 致病性

由圖1 可知，接種3 d 后，無瓣海桑新鮮健康的葉片出現褐色點狀病斑；6 d 后，表現為黑褐色圓形病斑；10 d 后病斑中心產生黑色的分生孢子堆，病斑可擴散至整個葉片。對照和老葉均未發(fā)病，接種感病癥狀與田間癥狀相似。對接種后發(fā)病的葉片進行分離，獲得的菌株菌落形態(tài)、孢子形態(tài)、以及ITS 序列與菌株WBHS-YB-2A 一致。結果表明，菌株WBHS-YB-2A 對無瓣海桑有致病性，確定P. sonneratiae為無瓣海桑葉斑病的病原菌。

圖1 室內離體接種癥狀Fig.1 Symptom of inoculation in vitro

2.2 無瓣海桑葉斑病危害癥狀

由P. sonneratiae引起的無瓣海桑葉斑病，在老葉和幼嫩的葉片均可發(fā)生，發(fā)病初期表現為褐色小點，病斑邊緣有黃色的暈圈；隨著病菌擴展，病斑逐漸擴大呈圓形或橢圓形或不規(guī)則，病斑外緣有黃色的暈圈，病斑外圈呈黑褐色，中心壞死褪色呈淺咖色，葉片不脫落。

2.3 無瓣海桑葉斑病菌形態(tài)特征

在PDA 上，無瓣海桑葉斑病菌菌落平展近圓形，產生白色絮狀氣生菌絲，菌絲發(fā)達致密，同時產生大量的分生孢子堆，呈墨色濃稠粘液，菌落同時伴有產生淺黃色至褐色沉淀（圖2 A 和C）。在察氏培養(yǎng)基上，菌落不規(guī)則，菌落形態(tài)類似花瓣，菌絲較致密，菌落伴有產生淺棕色沉淀，未形成分生孢子堆（圖2B）。分生孢子梗透明，光滑，柱狀至壺狀，環(huán)生。分生孢子梗不明顯，常退化（圖2D）。分生孢子紡錘形，直或稍彎曲，有4 隔膜，中間細胞3 個，棕色；頂端中間處附屬物單2～3（圖2E）。

圖2 菌株培養(yǎng)形態(tài)Fig.2 Morphology of the cultured strain

2.4 無瓣海桑葉斑病菌的生物特性

2.4.1 不同碳源對無瓣海桑葉斑病菌的影響 由表1 可知，在不同碳源條件下，無瓣海桑葉斑病菌均可生長。在不同碳源培養(yǎng)基上菌絲生長速率依次為：葡萄糖＞麥芽糖=蔗糖＞淀粉＞玉米粉＞果糖，前四者和后兩者之間差異顯著，不同碳源培養(yǎng)基上均產生黃色色素，菌絲均較致密，無明顯差異；在缺碳培養(yǎng)基上菌絲稀疏，生長速度最慢。由此可知該病原菌的最佳碳源為葡萄糖。

表1 不同碳源對菌株WBHS-YB-2A 的影響Table 1 Effects of different carbon sources on strain WBHS-YB-2A

2.4.2 不同氮源對無瓣海桑葉斑病菌的影響 由表2 可知，不同氮源培養(yǎng)基上菌株WBHS-YB-2A均可生長，但菌落形態(tài)、菌絲致密度差異較大，生長速率顯著不同。其生長速率依次為：蛋白胨＞酵母膏＞谷氨酸＞KNO3＞尿素；以蛋白胨為氮源時，菌絲較致密，生長速度最快可達1.21 cm·d-1；以尿素為氮源時，菌絲致密，但生長最緩慢，生長速度僅為0.75 cm·d-1。

表2 不同氮源對菌株WBHS-YB-2A 的影響Table 2 Effects of different nitrogen sources on strain WBHS-YB-2A

2.4.3 不同溫度對無瓣海桑葉斑病菌的影響 由表3 可知，不同溫度對菌株菌株WBHS-YB-2A生長影響極顯著（P＜0.01）。菌絲生長速率依次為：25 ℃＞20 ℃＞30 ℃＞15 ℃＞10 ℃。當溫度≥30 ℃或≤15 ℃時，菌絲生長速率顯著下降，其最適宜生長溫度為20～30 ℃。

表3 不同溫度對菌株WBHS-YB-2A 的影響Table 3 Effect of different temperature on strain WBHS-YB-2A

2.4.4 不同pH 對無瓣海桑葉斑病菌的影響 由表4 可知，菌株WBHS-YB-2A 在不同pH 培養(yǎng)基上生長速率依次為6.0＞5.0＞7.0=4.0＞8.0。該菌偏好于酸性的生長環(huán)境。

表4 不同pH 對供試菌株WBHS-YB-2A 的影響Table 4 Effect of different pH on strain WBHS-YB-2A

3 討論與結論

擬盤多毛孢屬的很多成員是重要的植物病原菌，能夠造成農林作物減產和嚴重的經濟損失。有報道表明，該類病原菌可在草莓、葡萄、蘋果、紅毛丹樹、茶、蓮霧等多種植物上引起病害.其中，葉斑病是其危害中最為常見的病害類型[16]。一般情況下，擬盤多毛孢的寄主專化性較弱，很多病原菌具有廣泛的寄主[17]。在前期研究中，我們從無瓣海桑葉片和枝干病組織分離到的4 株擬盤多毛孢屬菌株，形態(tài)學觀察無明顯差異，基于多片段構建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定菌株WBHSYB-2A 為擬盤多毛孢屬新種P. sonneratiae（未發(fā)表數據）。本文系統(tǒng)研究了P. sonneratiae菌株的致病性與生物學特性，發(fā)現葉片中分離得到的菌株WBHS-YB-2A 對新鮮幼嫩葉片具有較強的致病性，確定為無瓣海桑葉斑病的病原菌。同時，從無瓣海桑枝干上分離的P. sonneratiae菌株對葉片也具有致病性。但是，P. sonneratiae對無瓣海桑枝干是否具有致病性仍待進一步研究。

本研究針對無瓣海桑葉斑病菌的生物學特性進行了分析，明確了該菌對不同的碳源、氮源的利用情況，確定該菌最適碳源為葡萄糖、最適氮源為蛋白胨，在10～30 ℃均能生長，較適宜偏酸性環(huán)境條件，說明無瓣海桑葉斑病菌具有較強的適應能力，這與引起蓮霧軟腐病的異色擬盤多毛孢P.versicolor類似[18]。目前，國內外有關無瓣海桑葉斑病以及病原菌的報道較少，有關該類病害的致病機制、發(fā)生流行規(guī)律及其防治技術等尚不清楚，亟待開展相關研究。