微波輔助提取紫花苜?？傸S酮工藝的優(yōu)化

張佳睿，張丹丹，李佳樂，李晨陽，楊鎮(zhèn)才，李珊珊，劉麗杰，李波

（齊齊哈爾大學 1.生命科學與農(nóng)林學院，2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

紫花苜蓿（Medicago sativaL.）是豆科重要的牧草，其具有極強的適應能力及生態(tài)功能，對我國生態(tài)環(huán)境的建設及改善具有積極作用[1].我國對苜蓿的應用主要集中在上游產(chǎn)業(yè)，對其次生代謝產(chǎn)物的生物學功能活性研究相對較少.隨著研究人員對紫花苜蓿的深入研究，人們對其營養(yǎng)價值有了一定的了解，以苜蓿為原料的食品和保健品逐漸被人們所接受.作為畜牧業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)的優(yōu)質(zhì)飼草，紫花苜蓿在生長過程中會積累皂苷、黃酮類、香豆素等多種次生代謝產(chǎn)物[2]，主要儲藏在苜蓿的莖、葉、根等部位.在對紫花苜蓿的開發(fā)利用中，目前從中提取出的黃酮類化合物已高達50 余種，所表現(xiàn)出來的生理、藥理活性也與其含有較多的黃酮類化合物密切相關(guān)[3].

黃酮類化合物結(jié)構(gòu)復雜，種類較多，各種植物中的黃酮類物質(zhì)具有較大差異[4-5].依據(jù)黃酮類化合物的特點可選擇相應的提取方法，常用的提取方法有浸提法、回流提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等[6-8].其中，微波輔助提取法是微波與有機溶劑萃取相結(jié)合的產(chǎn)物，利用電磁加熱原理，使微波穿透有機溶劑，直接作用于萃取材料，提高植物活性物質(zhì)的萃取效率.微波輔助提取法提取效率高、速度快、對植物活性物質(zhì)的產(chǎn)物得率較高[9]，可有效保存食品、藥品及其它物料中的有效成分.微波提取過程受物料比、乙醇體積分數(shù)、微波功率、微波提取時間等不同因素的影響.本文以龍牧801 紫花苜蓿干粉為材料，設計單因素和正交實驗，優(yōu)化微波輔助提取苜蓿總黃酮工藝，為開發(fā)利用苜蓿提供理論依據(jù).

1 實驗材料、儀器與試劑

1.1 材料預處理

以龍牧801紫花苜蓿為原材料，于盛花期收割其地上部分，置于避光通風處自然陰干，篩去砂礫、草棒、枯草等雜質(zhì)，陰干后用高速多功能粉碎機將干草粉碎成草粉，置于密封盒內(nèi)避光備用.

1.2 儀器與試劑

高速多功能粉碎機（YB-1500A，永康市速鋒工貿(mào)有限公司）；紫外可見分光光度計（TU-1810，北京普析通用儀器有限責任公司）；微波爐（S7G88C，蘇州三星電子有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；全溫振蕩搖床（ZD-88，常州金壇中旺儀器制造有限公司）；循環(huán)水真空泵（SHZ-DⅢ，鞏義市予華儀器有限責任公司）.

蘆丁標準品（上海源葉生物科技有限公司）；石油醚（60～90℃，遼寧泉瑞試劑有限公司）；無水乙醇，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，九水硝酸鋁（天津市天力化學試劑有限公司）.以上試劑均為分析純（AR）.

2 實驗方法

2.1 標準曲線的繪制

以蘆丁為標準品，配制不同質(zhì)量濃度標準液，以NaNO2-Al（NO3）3為顯色劑，在λ=510 nm測定吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度為x軸，吸光度為y軸，通過繪制的標準曲線獲得回歸方程為A=13.893C-0.005 9（R2=0.997 3），總黃酮在質(zhì)量濃度為0.008～0.048 mg/mL時有良好的線性關(guān)系.

2.2 單因素和正交實驗設計

2.2.1 基本實驗條件 物料比1∶30，乙醇體積分數(shù)50%，微波功率800 W，微波提取時間30 s.

2.2.2 每個單因素設計 選取4 個單因素（物料比、乙醇體積分數(shù)、微波功率、微波提取時間），每個單因素設置5 個水平，其中物料比（g∶mL）為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50；乙醇體積分數(shù)為40%，50%，60%，70%，80%；微波功率為180，300，450，600，800 W；微波提取時間為10，20，30，40，50 s.每組單因素實驗獨立重復3 次.

2.2.3 正交實驗設計 依據(jù)單因素實驗結(jié)果，每個因素選擇3 個水平，按L9（34）正交實驗表進行設計（見表1），得出優(yōu)選因素組合，確定微波輔助法提取紫花苜?？傸S酮最優(yōu)工藝.

表1 正交實驗因素和水平

2.3 總黃酮的提取和含量測定

按照設定的物料比加入一定體積分數(shù)的乙醇，在室溫、120 r/min條件下震蕩浸泡1 h，使苜蓿中總黃酮類物質(zhì)充分溶出，浸泡完畢后進行微波處理.在微波爐轉(zhuǎn)盤中央放置一個裝有適量自來水的大燒杯用于吸熱，將裝有待提取樣本的三角瓶圍繞大燒杯周圍依次擺放，按照設定好的參數(shù)進行微波處理，每次微波處理10 s后將三角瓶取出，降至室溫后再進行下一次微波處理，直至達到規(guī)定時間，每組處理3次重復.過濾得浸提液，將浸提液加入等體積的石油醚萃取，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓蒸發(fā)至膏狀物，用體積分數(shù)60%的乙醇重新定容至50 mL，取5mL置容量瓶中，再按照標準曲線的繪制方法進行顯色和OD值測定.

依據(jù)回歸方程計算樣品中總黃酮提取量，Y=cVn m，其中：c為總黃酮的質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；V為總黃酮提取液的體積（mL）；n為提取液稀釋的倍數(shù)；m為苜蓿草粉的質(zhì)量（g）.

2.4 驗證性實驗

準確稱取1.00 g 備用苜蓿干粉4份，以最佳工藝進行驗證實驗，測其吸光度，并計算總黃酮提取量.

2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel2010對數(shù)據(jù)進行整理，SPSS19.0分析軟件對各測定數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA）.

3 結(jié)果與分析

3.1 微波輔助提取法各單因素對苜?？傸S酮提取量的影響

微波輔助提取法對苜蓿總黃酮的單因素實驗結(jié)果見圖1.由圖1可見，隨著物料比、乙醇體積分數(shù)、微波功率和微波提取時間的增加，苜?？傸S酮提取量均呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢.

圖1 微波輔助提取的4個因素對苜?？傸S酮提取量的影響

當物料比從1∶10 增加至1∶20 時，苜蓿總黃酮提取量快速上升，物料比超過1∶20時，總黃酮提取量趨于平緩，當物料比達到1∶30 時，苜?？傸S酮提取量最高，為2.245 mg·g-1.繼續(xù)增加物料比時，由于提取溶劑的增加降低了苜?？傸S酮的提取量，可能是細胞液對微波能量吸收減少，微波作用力變?nèi)鮗10]，導致細胞破裂不完全，總黃酮提取量下降.物料比1∶10，1∶50 苜?？傸S酮提取量與物料比1∶20，1∶30，1∶40之間苜蓿總黃酮提取量比較差異顯著（P＜0.05）.

在乙醇體積分數(shù)在40%～80%范圍內(nèi)，總黃酮提取量呈現(xiàn)先平穩(wěn)緩慢增長，后劇烈下降的趨勢.當乙醇體積分數(shù)小于60%時，總黃酮提取量無明顯差異，在乙醇體積分數(shù)為60%時，苜?？傸S酮提取量達最大值，為2.050 mg·g-1.繼續(xù)升高乙醇濃度，苜?？傸S酮提取量迅速下降，可能是過高的乙醇體積分數(shù)影響一些黃酮類成分的溶解性[11].40%，50%，60%與70%，80%苜蓿總黃酮提取量比較差異顯著（P＜0.05）.

微波功率在300～450 W 時，苜?？傸S酮提取量提高尤為明顯，總黃酮提取量峰值出現(xiàn)在微波功率450 W條件下，最高提取量為1.789 mg·g-1.當微波功率大于450 W 時，苜?？傸S酮提取量逐漸下降，微波功率過高，會導致某些黃酮類結(jié)構(gòu)的變性或者降解[12]，使總黃酮提取量降低.除微波功率為450 與600 W，180與800 W，300 與600 W 外，其它各處理間苜?？傸S酮提取量比較差異顯著（P＜0.05）.

當微波提取時間為10～30 s 時，隨著微波提取時間的延長，苜?？傸S酮的提取量迅速提高，在微波提取時間為30 s 時，苜蓿總黃酮提取量最高，為1.916 mg·g-1.但繼續(xù)延長微波提取時間，苜?？傸S酮提取量反而下降，可能是隨著微波提取時間的延長增加了其它非黃酮類化合物的溶出[13]，影響了總黃酮提取量.除20 與50 s 微波提取時間外，其它各微波提取時間內(nèi)苜?？傸S酮提取量比較差異顯著（P＜0.05）.

3.2 正交實驗優(yōu)化微波輔助提取條件

根據(jù)微波輔助提取法的單因素實驗結(jié)果進行正交實驗，結(jié)果見表2.極差（R）值越小該因素對苜?？傸S酮提取量的影響程度越小，R值越大該因素對苜?？傸S酮提取量的影響越大，影響苜蓿總黃酮提取量的4 因素R值大小依次為C＞D＞B＞A，即微波功率的影響最大，其次為微波提取時間、乙醇體積分數(shù)和物料比.由方差（K）值大小可知，當物料比為1∶30、乙醇體積分數(shù)為60%、微波功率為450 W 和微波提取時間40 s 時提取效果最好，從而得出最佳提取工藝為A2B3C2D3.綜合分析得出微波輔助法提取苜?？傸S酮最佳工藝水平組合為物料比1∶30、乙醇體積分數(shù)60%、微波功率為450 W、微波提取時間40 s.

表2 微波輔助法正交實驗結(jié)果分析

采用正交實驗分析軟件對正交實驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3.由表3 可見，物料比、乙醇體積分數(shù)、微波功率和微波提取時間對苜?？傸S酮提取量的影響均達到顯著水平.

表3 苜?？傸S酮提取量正交實驗方差結(jié)果分析

3.3 微波輔助提取苜?？傸S酮的穩(wěn)定性實驗

在正交實驗最佳組合提取工藝條件下進行4 次平行穩(wěn)定性實驗.準確稱取1 g 苜蓿干粉末，以物料比1∶30，乙醇體積分數(shù)60%，微波功率為450 W，微波提取時間40 s 進行微波輔助提取，測定結(jié)果見表4.在最佳組合工藝提取條件下，4 次驗證實驗結(jié)果接近，且高于單因素及正交實驗中的總黃酮提取量，苜?？傸S酮的平均提取量為2.179 mg·g-1，說明微波輔助法提取苜蓿中總黃酮的優(yōu)化工藝穩(wěn)定可靠.

表4 微波輔助提取法穩(wěn)定性實驗結(jié)果

4 討論

植物生長發(fā)育過程產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物大量存在于根、莖、葉等器官中，這些產(chǎn)物的含量直接影響對其開發(fā)和利用.黃酮類物質(zhì)屬于植物次生代謝產(chǎn)物的一種，近年來，關(guān)于植物中黃酮類化合物的提取研究得到了長足的發(fā)展，多采用微波輔助、超聲波輔助和響應面等提取法提高黃酮類化合物的提取效率[14].

前人在利用微波輔助提取黃酮類化合物時，對影響黃酮類化合物提取效率的各單因素進行了不同水平的比較，在此基礎上對各因素的互作效率進行正交實驗，優(yōu)化黃酮類化合物的提取工藝.有關(guān)苜?？傸S酮提取的工藝研究中，普遍認為微波輔助提取法提取紫花苜蓿總黃酮的提取效率較高，但不同研究者在物料比、乙醇體積分數(shù)、微波功率、微波提取時間等因素對黃酮提取量的影響研究上略有差異.張詠梅[15]等通過單因素實驗和正交實驗的方法，優(yōu)化微波輔助提取紫花苜?？傸S酮的提取工藝，認為影響提取量的主要因素是物料比和乙醇濃度，在最優(yōu)工藝下（1∶30物料比，40%乙醇體積分數(shù)，微波功率500 W，作用時間60 s）的總黃酮提取量為4.88 mg·g-1.與本文在微波輔助提取苜?？傸S酮的影響因素的結(jié)果存在差異，物料比、乙醇體積分數(shù)、微波功率、微波提取時間均顯著影響苜?？傸S酮提取量，其中微波功率的影響最大；但在最優(yōu)提取工藝上物料比和微波功率的篩選上基本一致，乙醇體積分數(shù)和微波處理時間上略有差異，導致本研究苜?？傸S酮量低的原因可能是材料的選擇和微波處理功率方面.實驗研究可為紫花苜蓿資源利用方面提供有價值的參考依據(jù).

5 結(jié)論

在微波輔助提取苜?？傸S酮時，物料比、乙醇體積分數(shù)、微波功率、微波提取時間均對苜?？傸S酮提取量產(chǎn)生顯著影響，微波功率＞微波提取時間＞乙醇體積分數(shù)＞物料比.最佳提取工藝為：物料比1∶30、乙醇體積分數(shù)60%、微波功率450 W、微波提取時間40 s，此工藝條件下苜蓿總黃酮提取量為2.179 mg·g-1，提取工藝穩(wěn)定.