尿液10項(xiàng)腎損傷標(biāo)志物檢測試劑的性能評價

張嬋媛，徐珊珊，王學(xué)晶

(1.民航總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100123；2.北京利德曼生化股份有限公司技術(shù)服務(wù)部，北京 102600)

腎損傷標(biāo)志物對于腎臟損傷的早期診斷、鑒別診斷和病情評估非常重要，尿清蛋白(albumin，u-Alb)是應(yīng)用最廣泛的腎損傷標(biāo)志物[1]，其在不同檢測系統(tǒng)間的一致性在中間濃度范圍內(nèi)(20～400 mg/L)較為理想[2]。此外，還有其他臨床常用的尿液標(biāo)志物，如有反映腎小球?yàn)V過屏障損傷的尿液轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，u-Trf)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，u-IgG)，反映腎小管細(xì)胞損傷的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，u-NGAL)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-Acetyl-β-D-glucosaminidase，u-NAG)，反映腎小管重吸收功能損傷的α1微球蛋白(α1-microglobulin，u-α1MG)、視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protein，u-RBP)、β2微球蛋白(β2-microglobulin，u-β2MG)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(cystatin C，u-CysC)等。尿液物質(zhì)濃度個體間差異非常大，可達(dá)上萬倍，故準(zhǔn)確檢測需要了解檢測試劑的線性范圍以制定科學(xué)的前處理方法。此外，腎臟疾病常出現(xiàn)血尿等干擾檢測的情況，故驗(yàn)證抗血紅蛋白干擾的性能也非常重要。截至目前，較為全面系統(tǒng)的評價尿液常見標(biāo)志物性能的研究報(bào)道尚不多[3-4]。此外，檢測系統(tǒng)間的可比性研究也較少。隨著標(biāo)志物在泌尿系統(tǒng)疾病診斷、監(jiān)測和評估中的作用越來越重要，制定基于這些標(biāo)志物的臨床共識或指南也迫在眉睫，這就需要檢測結(jié)果的可比性及互認(rèn)性。

本研究擬系統(tǒng)評估北京利德曼公司尿液10項(xiàng)腎損傷標(biāo)志物檢測系統(tǒng)的性能，觀察其臨床適用性及與另外較為公認(rèn)檢測系統(tǒng)的一致性。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源

1.1.1性能評估 收集2021年7月至12月民航總醫(yī)院患者和體檢健康者新鮮尿液標(biāo)本。

1.1.2比對 收集2021年7月至12月民航總醫(yī)院無血、膿的新鮮尿液標(biāo)本40份。

1.2儀器與試劑 7600全自動生化分析儀(日本日立公司)上裝載u-α1MG、u-TP、u-IgG、u-Alb、u-NGAL、u-CysC、u-RBP、u-β2MG、u-NAG、u-Trf(北京利德曼公司)和u-NAG(柏定生物工程公司)檢測試劑。IMMAGE 800特種蛋白分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)上裝載u-α1MG、u-IgG、u-Alb、u-Trf檢測試劑。校準(zhǔn)品和質(zhì)控品均為與試劑配套產(chǎn)品。

1.3性能驗(yàn)證

1.3.1正確度 依據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI) EP15-A3文件[5]所提供方案，通過檢測參考物質(zhì)的偏倚來評價各試劑的正確度。復(fù)融ERM-DA470k、ERM-DA471、B2M-NIBSC等參考物質(zhì)及純度物質(zhì)(見表1)，重復(fù)檢測3次，計(jì)算偏倚。

表1 尿液10項(xiàng)腎損傷標(biāo)志物的參考物質(zhì)及純度物質(zhì)

1.3.2不精密度 依據(jù)CLSI EP15-A3文件[5]所提供方案，分別檢測高、低2個水平的質(zhì)控品，連續(xù)檢測5 d，每天檢測4次。計(jì)算各水平重復(fù)性及室內(nèi)不精密度。

1.3.3線性范圍 其中8項(xiàng)尿液蛋白質(zhì)(u-α1MG、u-Alb、u-NGAL、u-RBP、u-β2MG、u-NAG、u-Trf、u-TP)用一份低濃度混合尿液(L)、一份高濃度混合尿液(H)及生理鹽水(S)，按0.25L∶0.75S、0.5L∶0.5S、1.0L、0.1H∶0.9L、0.2H∶0.8L、0.3H∶0.7L、0.4H∶0.6L、0.5H∶0.5L、0.6H∶0.4L、0.7H∶0.3L、0.8H∶0.2L、0.9H∶0.1L、1.0H，配成13個濃度梯度的混合樣本。其預(yù)期濃度按照公式：x=(CL×VL+CH×VH)/(VL+VH)計(jì)算，其中C為濃度，V為體積。從低到高各測3次，記錄檢測結(jié)果。按照CLSI EP06[6]文件提供的方案初步檢查數(shù)據(jù)，檢查離群值，判斷重復(fù)性，之后進(jìn)行多元線性回歸，將結(jié)果分別擬合1次、2次、3次多項(xiàng)式，并繪制散點(diǎn)圖進(jìn)行評價[7-8]。因高濃度u-IgG、u-CysC尿液留取較難，故是用一份低濃度混合尿液(L)、一份高濃度混合尿液(添加≤2%血清)配制而成，其余操作與上文一致。

1.3.4稀釋驗(yàn)證試驗(yàn) 1份混合標(biāo)本用生理鹽水進(jìn)行系列稀釋(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16)，雙份檢測，計(jì)算均值乘以稀釋倍數(shù)的結(jié)果與原倍血清檢測結(jié)果的偏差百分比。

1.3.5干擾試驗(yàn) 參考CLSI EP07[9]文件提供的方案，將不同濃度血紅蛋白加入到高、低濃度的兩份尿液中，觀察干擾物對檢測結(jié)果的影響。尿液中血紅蛋白終濃度分別為8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 g/L。以原始樣本結(jié)果為準(zhǔn)，以超過±10%為標(biāo)準(zhǔn)判斷是否存在干擾。

1.3.6方法學(xué)比對 分別用本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)用檢測試劑和北京利德曼公司試劑檢測40份患者新鮮尿液5種尿液標(biāo)志物(u-α1MG、u-IgG、u-Alb、u-NAG、u-Trf)。其中，本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)用檢測試劑包括貝克曼試劑(u-α1MG、u-IgG、u-Alb、u-Trf)和柏定生物試劑(u-NAG)。參考CLSI EP09文件[10]提供的方案，評估不同檢測系統(tǒng)間檢測結(jié)果的一致性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用Microsoft Excel 2020及SPSS 20.0軟件進(jìn)行。采用K-S正態(tài)分布檢驗(yàn)檢查數(shù)據(jù)正態(tài)性。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，線性回歸采用簡單線性回歸分析；以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1正確度 見表2。測定10項(xiàng)尿液標(biāo)志物低、中、高值標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的偏倚分別為-2.69%～4.67%、-3.60%～3.33%、-2.38%～3.02%。

表2 尿液10項(xiàng)腎損傷標(biāo)志物試劑正確度驗(yàn)證結(jié)果

2.2不精密度 見表3。尿液10項(xiàng)腎損傷標(biāo)志物的重復(fù)性以不精密度表示，低值的不精密度為1.90%～5.43%，高值為0.63%～2.42%；低值的室內(nèi)不精密度為2.27%～5.63%，高值為1.09%～3.41%之間；均小于試劑盒聲明的不精密度。

表3 尿液10項(xiàng)腎損傷標(biāo)志物試劑不精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.3線性范圍和稀釋驗(yàn)證試驗(yàn) 尿液10項(xiàng)腎損傷標(biāo)志物線性檢測理論值與實(shí)測值擬合方程中斜率a在0.98～1.08之間，截距b在-25.00～0.09之間，相關(guān)系數(shù)(r)為0.992～0.999之間，均大于0.975，說明線性良好。尿液10項(xiàng)腎損傷標(biāo)志物試劑最大稀釋倍數(shù)除u-Trf為8倍，其他均為16倍，每種標(biāo)志物的線性范圍和臨床可報(bào)告范圍見表4。

表4 尿液10項(xiàng)腎損傷標(biāo)志物試劑線性范圍和稀釋度驗(yàn)證

2.4干擾試驗(yàn) 尿液中血紅蛋白終濃度≤8 g/L時對u-α1MG、u-Alb未產(chǎn)生明顯干擾，≤4 g/L時對u-β2MG、u-Trf未產(chǎn)生明顯干擾，≤2 g/L時對u-CysC未產(chǎn)生明顯干擾，≤1 g/L時對u-NAG未產(chǎn)生明顯干擾,而血紅蛋白終濃度≥0.125 g/L時，u-TP、u-IgG、u-RBP、u-NGAL即受干擾。

2.5一致性評估 Bland-Altman偏倚圖見圖1。不同檢測試劑u-Trf、u-NAG、u-Alb、u-IgG、u-α1MG結(jié)果間差值的平均偏倚(95%置信區(qū)間)為-26.9%(-68.4%～14.6%)、48.3%(-9.5%～106.0%)、1.0%(-34.3%～36.3%)、-12.6%(-72.7%～47.6%)、142.8%(108.5%～177.0%)。

注：A～E分別為u-Trf、u-NAG、u-Alb、u-IgG、u-α1MG。圖1 本室現(xiàn)用檢測試劑與北京利德曼公司試劑檢測5種尿液標(biāo)志物的一致性的Bland-Altman偏倚圖

3 討論

目前市面上的尿液檢測試劑盒種類繁多，標(biāo)準(zhǔn)化程度不一，線性范圍參差不齊，因而有必要在使用試劑盒前進(jìn)行性能評價，尤其是正確度、精密度、線性范圍和抗干擾性能，以保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確。尿液10項(xiàng)腎損傷標(biāo)志物在高、低濃度下的不精密度均≤5.63%，說明目前國產(chǎn)試劑盒穩(wěn)定性良好。正確度評價中，u-Trf、u-IgG、u-Alb、u-CysC、u-β2MG、u-TP項(xiàng)目選取了國際有證參考物質(zhì)ERM-DA470k、ERM-DA471、B2M-NIBSC、SRM-927，u-α1MG、u-NGAL、u-RBP項(xiàng)目選取了α1-MG、NGAL、RBP純品，正確度評價結(jié)果滿足臨床要求。采用國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所獲得的正確度可靠性高，良好的一致性和可比性容易達(dá)到，有助于國家衛(wèi)生健康委結(jié)果互認(rèn)的推進(jìn)。然而，部分項(xiàng)目因缺乏可靠的溯源方法，其系統(tǒng)間檢測結(jié)果的差異比較大。本研究中不同檢測系統(tǒng)間比對也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，溯源至ERM-DA470k的u-IgG、u-Alb一致性良好，u-Trf在中間范圍內(nèi)一致性良好；而沒有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可溯源的u-α1MG和u-NAG一致性較差。

尿液標(biāo)志物濃度變化非常大，要求檢測系統(tǒng)的線性范圍至少要涵蓋大部分臨床常見的濃度范圍。我院實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)數(shù)據(jù)顯示，一段時間內(nèi)u-IgG的檢測結(jié)果范圍為0～993 mg/L，u-α1MG為0～99.4 mg/L，u-Trf為0～757 mg/L，u-NAG為0～180.5 U/L，u-Alb為0～11 240 mg/L，評估結(jié)果顯示，上述尿液標(biāo)志物的線性范圍較寬，可以涵蓋絕大多數(shù)病理生理狀態(tài)下的尿蛋白濃度水平，可稀釋倍數(shù)也較高，能夠滿足高值樣本準(zhǔn)確測量的要求。然而，u-Alb濃度范圍0～11 240 mg/L、u-Trf濃度范圍0～757 mg/L，提示臨床常見濃度很容易超出試劑的檢測上限。建議測量u-Alb和u-Trf前，先用磺柳酸定性，再選擇合適的稀釋倍數(shù)稀釋后測量。

血尿在腎病患者中較為常見，因此本研究重點(diǎn)評價了血紅蛋白的干擾。研究表明，u-Alb檢測時尿中血紅蛋白和膽紅素對u-Alb檢測均呈負(fù)干擾[11]。本研究試劑多采用免疫比濁法或膠乳免疫比濁法，對于血紅蛋白產(chǎn)生的顏色效應(yīng)的抗干擾能力較強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，u-α1MG、u-Alb、u-β2MG、u-Trf、u-CysC、u-NAG未見明顯血紅蛋白的干擾。之前研究報(bào)道尿紅細(xì)胞或尿血紅蛋白對尿蛋白檢測存在干擾，但多數(shù)是對u-Alb的定性檢測結(jié)果的評價[12]，尿液蛋白定量檢測前可通過離心去除紅細(xì)胞干擾，本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)血紅蛋白濃度為0.125 g/L時，仍然對u-TP、u-IgG、u-RBP檢測結(jié)果存在明顯干擾，且隨血紅蛋白濃度的增加呈正干擾，而對u-NGAL檢測結(jié)果呈負(fù)干擾。干擾的主要原因可能來自于血紅蛋白的色源干擾，并且還與紅細(xì)胞的組成有關(guān)，由于干擾實(shí)驗(yàn)的血紅蛋白是通過溶解紅細(xì)胞得到的，可能紅細(xì)胞膜和內(nèi)部結(jié)構(gòu)物質(zhì)會對檢測造成一定影響。本研究的缺陷在于僅評價了血紅蛋白的干擾，下一步將對總蛋白、單克隆免疫球蛋白和濁度等其他物質(zhì)的干擾進(jìn)行分析。

綜上所述，10種尿液標(biāo)志物檢測試劑正確度和精密度良好，線性范圍寬，稀釋準(zhǔn)確性滿足臨床需要，大部分試劑抗血紅蛋白干擾能力較強(qiáng)。一致性方面，不同檢測系統(tǒng)間尿液標(biāo)志物測量結(jié)果存在一定差異。實(shí)驗(yàn)室在使用前應(yīng)重點(diǎn)評估試劑盒的正確度、線性范圍和抗干擾能力，以保證檢驗(yàn)結(jié)果一致化和標(biāo)準(zhǔn)化，為相關(guān)指南和共識提供一致可比的實(shí)驗(yàn)室信息。