一株高效溶磷菌的條件優(yōu)化及其促生特性研究

李思思，符運(yùn)會(huì)，羅 宇，周 佳，趙 帥，屈建航

（河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

磷元素是植物生長的限制因子之一，缺磷會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)生長緩慢、產(chǎn)量降低等現(xiàn)象[1]，然而土壤中95%以上的磷是以難溶性磷酸鹽形式存在的無效磷，不能被植物吸收利用[2-3]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要通過施加磷肥來緩解土壤缺磷狀況，滿足作物對磷的生長需求。有研究表明，施入土壤的磷肥當(dāng)季利用率只有10%～25%[4]，大部分的水溶性磷與土壤中的金屬離子螯合成難溶性磷，造成土壤板結(jié)、肥力降低等現(xiàn)象[5-6]。

溶磷菌是一類能夠溶解難溶性磷酸鹽或有機(jī)磷的微生物，它可以參與到土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)中，間接促進(jìn)植物的生長發(fā)育[7]。因此，利用溶磷微生物提高土壤磷的有效性具有重要意義。目前，已發(fā)現(xiàn)的溶磷微生物屬主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）[8]、假單胞菌屬（Pseudomonas）[9-10]、不動(dòng)桿菌 屬（Acinetobacter）[11]、伯 克 霍 爾 德 菌 屬（Burkholderia）[6]、青霉菌屬（Penicillium）、曲霉菌屬（Aspergillus）[12]等。溶磷微生物對土壤磷養(yǎng)分循環(huán)和植物生長具有重要影響，同時(shí)還可以有效緩解土壤礦質(zhì)化污染問題，具有較好的應(yīng)用價(jià)值及生態(tài)效益[6-7，13]。如何利用溶磷微生物提高土壤磷利用率，減少磷肥使用量，仍是目前研究的熱點(diǎn)內(nèi)容之一。

沉積物是微生物天然的種質(zhì)資源庫，具有豐富的微生物多樣性[14]。目前，研究人員篩選到的溶磷菌多源自土壤[15-16]，而關(guān)于沉積物中溶磷菌的研究報(bào)道相對較少。另外，已有報(bào)道的溶磷菌大多數(shù)停留在實(shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)階段，其在活化土壤磷方面的作用仍不明確，這制約了已報(bào)道溶磷菌的廣泛應(yīng)用。鑒于此，擬以篩選自太湖沉積物的高效溶磷菌1416X3 為對象，優(yōu)化溶磷條件，明確其在土壤中的溶磷效果及其對玉米生長的影響，為該菌進(jìn)一步研究和利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株

細(xì)菌1416X3 由河南工業(yè)大學(xué)環(huán)境微生物技術(shù)課題組于2014年篩選自太湖沉積物，該沉積物樣品采集自太湖竺山灣（31°27′033″N，120°02′255″E），置于4 ℃冰箱中帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 培養(yǎng)基

NBRIP 培養(yǎng)基[17]：葡萄糖10 g、MgCl2·6H2O 5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、KCl 0.20 g、（NH4）2SO40.10 g、Ca3（PO4）25 g、蒸餾水1 L，pH 值7.0，115 ℃滅菌30 min。

LB 培養(yǎng)基[17]：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水1 L，pH 值7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.3 溶磷菌1416X3的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特性鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]進(jìn)行。采用SDS-堿裂解法提取細(xì)菌DNA，利用通用引物27F 和1492R 進(jìn)行16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增[19]。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測并進(jìn)行核苷酸序列測定，所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行對比，采用MEGA 7.0軟件以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 溶磷菌1416X3的溶磷條件優(yōu)化

采用不同碳源（葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉）代替NBRIP 培養(yǎng)基中的碳源，通過鉬銻抗比色法測定上清液有效磷含量，確定最佳碳源；采用不同氮源（尿素、硫酸銨、硝酸鉀、硫酸銨、胰蛋白胨）代替NBRIP 培養(yǎng)基中的氮源，通過鉬銻抗比色法測定上清液有效磷含量，確定最佳氮源。在其他條件不變的情況下，分別改變培養(yǎng)液的pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）和 培 養(yǎng) 溫 度（25、28、37、40 ℃）以及接種量（1%、2%、3%、5%、7%、9%、10%），選取上清液中可溶性磷含量最高時(shí)的條件進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[20]。

1.5 溶磷菌1416X3的土壤溶磷試驗(yàn)

供試土壤取自校園（34°83′N，113°55′E）菜地（西南方向）及花圃（東北方向）5～10 cm 土壤。其中，菜地土壤全磷含量為13.85 mg/kg、速效磷含量為4.53 mg/kg；花圃土壤全磷含量為26.74 mg/kg、速效磷含量為4.20 mg/kg。將土壤自然風(fēng)干后過0.85 mm 孔徑篩子，用250 mL 三角瓶分裝100 g 土壤，121 ℃、30 min 間歇滅菌3 次。1416X3 處理是向瓶中加2 mL 的1416X3 菌懸液（OD600為1），對照（CK）則是加入等體積無菌水。之后向土壤中添加1%的葡萄糖，土壤濕度為40%，28 ℃培養(yǎng)。在0、1、3、5、8、12、17、23 d 時(shí)采樣，測定土壤速效磷、pH 值變化以及菌株1416X3的定殖情況[21-23]。

1.6 溶磷菌1416X3對玉米促生效果試驗(yàn)

將供試土壤風(fēng)干過篩后做滅菌處理備用，每盆分裝1.2 kg 土壤。使用75%乙醇對玉米種子消毒，之后用無菌水沖洗干凈，置于28 ℃培養(yǎng)箱催芽，每盆播種3 粒種子。將1416X3 種子液培養(yǎng)12 h 后離心，并用無菌水重懸，制備成OD600為1 的菌懸液，接入等體積的無菌水作為對照（CK），采用澆根方式在玉米苗根際接入溶磷菌。自然條件下室內(nèi)培養(yǎng)，試驗(yàn)期間保持土壤濕潤，25 d 后收獲植株，測定株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和全磷含量；采集植株根際土壤，測定土壤速效磷、pH值[22-23]。

我在給四年級(jí)學(xué)生上《風(fēng)向和風(fēng)速》一課時(shí)，讓學(xué)生擔(dān)任“教師”的角色，讓學(xué)生說關(guān)于風(fēng)的謎語，再由學(xué)生自己回答，讓學(xué)生介紹八大方位圖和風(fēng)速歌，自己寫板書，鼓勵(lì)學(xué)生發(fā)揮各自的聰明才智動(dòng)手制作風(fēng)向標(biāo)和風(fēng)旗。有的學(xué)生不善于表達(dá)，有的學(xué)生不敢展示自己的風(fēng)向標(biāo)等等。我大膽的鍛煉學(xué)生的能力，對學(xué)生不斷的鼓勵(lì)，積極的贊揚(yáng)，此時(shí)，在這個(gè)時(shí)候，我指出學(xué)生出現(xiàn)的問題，學(xué)生會(huì)從心理改正錯(cuò)誤，激勵(lì)自己進(jìn)步。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.4 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析[24]，利用Origin 9.0軟件作圖[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷菌1416X3的形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定

溶磷菌1416X3 為革蘭氏陰性菌，長桿狀，菌落為黃色圓形（圖1）。接觸酶反應(yīng)、氧化酶反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)、熒光反應(yīng)、脲酶反應(yīng)、淀粉水解反應(yīng)均呈陽性，明膠水解反應(yīng)、精氨酸水解酶反應(yīng)均呈陰性。對新霉素、四環(huán)素敏感，對氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素、青霉素、卡那霉素不敏感。在0～3%NaCl條件下、pH值介于4～8時(shí)生長。

圖1 溶磷菌1416X3的菌落形態(tài)及電鏡掃描結(jié)果Fig.1 Colony morphology and scanning electron result of phosphate-solubilizing bacterium 1416X3

將菌株1416X3的16S rRNA 基因序列（登錄號(hào)：MK280701.1）輸入GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 對比 發(fā) 現(xiàn)，其 與Pseudomonas fildesensisKG01（NR 170438.1，假單胞菌屬）的相似度最高，同源性為99.65%。利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)合菌落形態(tài)及生理生化特征，初步鑒定菌株1416X3為假單胞菌（Pseudomonassp.）。

圖2 溶磷菌1416X3基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of phosphate-solubilizing bacterium 1416X3

2.2 溶磷菌1416X3溶磷條件優(yōu)化結(jié)果

菌株1416X3 的溶磷條件優(yōu)化結(jié)果見圖3。碳源對菌株1416X3 溶磷能力影響見圖3a，不同碳源間菌株1416X3 溶磷能力差異顯著（P＜0.05）。以葡萄糖為碳源時(shí)，溶磷量最高，為793.16 mg/L，對應(yīng)pH 值為3.72；當(dāng)碳源為麥芽糖時(shí)，溶磷效果最差，溶磷量僅為40.12 mg/L，此時(shí)pH 值為7.00。因此，選擇葡萄糖為菌株1416X3溶磷的最佳碳源。

圖3 不同因素對溶磷菌1416X3溶磷能力的影響Fig.3 Effect of different factors on the phosphorus solubilization capacity of phosphate-solubilizing bacterium 1416X3

氮源對菌株1416X3 溶磷能力影響如圖3b 所 示。菌株1416X3 在5 種氮源培養(yǎng)基的溶磷效果從大到小依次為硫酸銨、草酸銨、胰蛋白胨、尿素、硝酸鉀，且差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。以硫酸銨為氮源時(shí)，菌株1416X3 溶磷量最高，為827.12 mg/L。因此，選擇硫酸銨為1416X3最佳溶磷氮源。

初始pH 值對菌株1416X3 溶磷能力影響見圖3c。在不同初始pH 值下，菌株1416X3 都有一定的溶磷能力。pH值為6.0、7.0、7.5時(shí)，溶磷量差異不顯著（P＞0.05）。其中，pH 值為7.0 更趨近于菌株原始生長環(huán)境，此時(shí)溶磷量為774.52 mg/L。pH 值為8.0時(shí)，溶磷量最低，為608.06 mg/L。因此，選擇pH 值7.0為最佳初始pH值。

接種量對菌株1416X3 溶磷能力影響如圖3e 所示。接種量介于1%～5%時(shí)，菌株1416X3 的溶磷量差異不顯著（P＞0.05）；接種量大于5%時(shí)，溶磷量逐漸降低，且不同接種量之間差異顯著（P＜0.05）。其中，接種量為1%時(shí)，溶磷量最高，為765.46 mg/L，此時(shí)pH 值為3.99。因此，菌株1416X3 溶磷的最佳接種量為1%。

2.3 溶磷菌1416X3土壤溶磷試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 溶磷菌1416X3 在土壤中的定殖情況 菌株1416X3 在土壤中的定殖情況如圖4 所示。將菌株1416X3分別接種到菜地以及花圃中，菌落數(shù)分別在第5 天、第3 天達(dá)到最大，分別為35.4×107、30.4×107cfu/g，之后開始逐漸下降。在第23天時(shí)，菜地土壤菌落數(shù)為6.05×107cfu/g，花圃土壤菌落數(shù)為0.97×107cfu/g。綜上，菌株1416X3 在菜地土壤中具有較好的定殖能力。

圖4 溶磷菌1416X3在菜地、花圃中的定殖情況Fig.4 Colonization of vegetable patch and flower nursery by the phosphate-solubilizing bacterium 1416X3

2.3.2 溶磷菌1416X3 對土壤速效磷含量及pH 值變化的影響 由圖5可知，不論是菜地還是花圃，接種1416X3 的土壤速效磷含量均高于對照，且該菌株能夠降低土壤pH 值。接種1416X3 的菜地第3 天土壤速效磷含量達(dá)到最高，為7.87 mg/kg，較對照增加了59.46%；接種1416X3 的花圃第8 天土壤速效磷含量達(dá)到最大，為7.74 mg/kg，較對照增加了118.87%。接種1416X3 的菜地和花圃土壤pH 值在第12 天達(dá)到最低。綜上所述，接種1416X3 的2 種土壤速效磷含量均明顯高于對照，且均能夠降低土壤pH值，說明該菌株具有較好的溶磷效果。

圖5 溶磷菌1416X3對土壤速效磷含量以及pH值的影響Fig.5 Effect of phosphorus-solubilizing bacterium 1416X3 on soil available phosphorus content and pH

2.4 溶磷菌1416X3的盆栽試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 溶磷菌1416X3 對玉米幼苗生長的影響 盆栽試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，菌株1416X3 在土壤中具有較好的促生長活性，可以明顯促進(jìn)玉米幼苗的生長。第25天菌株1416X3處理玉米的根長、莖粗、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、全磷分別為29.47 cm、4.62 mm、7.77 g、0.85 g、2.06 g/kg，較 對 照 分 別 提 高 了114.02%、43.03%、80.28%、80.85%、88.99%，且差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。另外，1416X3 處理株高為51.47 cm，較對照提高了16.90%。綜上所述，菌株1416X3 對玉米植株具有較好的促生作用。

表1 溶磷菌1416X3對玉米幼苗生長的影響Tab.1 Effect of phosphorus-solubilizing bacterium 1416X3 on the growth of maize seedlings

2.4.2 溶磷菌1416X3 對土壤速效磷以及pH 值的影響 由圖6 可知，1416X3 處理在接種4、8、12 d 時(shí)可以明顯提高土壤速效磷含量，且降低土壤pH 值。由圖6a 知，1416X3 在接種4、8、12 d 時(shí)，其與對照土壤速效磷含量差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。其中，1416X3 處理土壤速效磷含量在接種8 d 時(shí)達(dá)到最大，為11.38 mg/kg，較對照提高了111.80%。此時(shí)，土壤pH 值為7.96（圖6b），與對照差異也達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。接種1416X3 的處理，土壤pH 值呈先降低后上升趨勢，在接種16 d 時(shí)，土壤pH 值降到最低，為7.00，與對照差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。隨著接種時(shí)間的推移，在土壤中營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗以及金屬離子等多種因素共同作用下，溶磷菌1416X3的活性受到影響，這導(dǎo)致溶出的速效磷再次在土壤中被固定，從而導(dǎo)致土壤速效磷含量降低，pH值上升。

圖6 接種溶磷菌1416X3后不同時(shí)間土壤速效磷含量及pH值變化Fig.6 Changes of soil available phosphorus content and pH value at different time after inoculation of phosphorussolubilizing bacterium 1416X3

3 結(jié)論與討論

假單胞菌屬是主要溶磷微生物之一，較多研究表明，該屬菌株對難溶性磷酸鹽有較好的溶解效果[9-10]。孫珊等[26]篩選的假單胞菌CJT-1 對磷酸鈣和磷礦粉的溶磷量分別達(dá)到224.51、120.59 mg/L；喬志偉等[27]篩選出的最佳溶磷組合（拉恩式菌W2、假單胞菌W3、假單胞菌W4）在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，溶磷量為664.29 mg/L。本研究中，溶磷菌1416X3 經(jīng)鑒定為假單胞菌（Pseudomonassp.），對Ca3（PO4）2的溶磷量為827.12 mg/L，具有良好的溶磷效果。

碳源、氮源作為微生物的主要能源，影響微生物的生長繁殖和生理生化代謝等。溶磷菌在以不同的碳、氮源為營養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，會(huì)表現(xiàn)出不同的溶磷能力?？麓毫恋萚28]篩選出的嗜氣芽孢桿菌B3-5-6的最優(yōu)溶磷碳、氮源分別為蔗糖、硫酸銨。本研究中，菌株1416X3 以葡萄糖為碳源時(shí)，具有較強(qiáng)的溶磷能力，以麥芽糖為碳源時(shí)，溶磷量最低；在氮源利用方面，菌株1416X3 對銨態(tài)氮的利用效果較硝態(tài)氮好，這與王俊娟等[29]的研究結(jié)果相似。本研究中，菌株1416X3 以葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源、初始pH 值為7.0、接種量為1%、溫度為28 ℃時(shí)溶磷效果最好。有研究表明，某些溶磷菌在無機(jī)磷液體培養(yǎng)中具有較高的溶磷活性，但施入土壤后卻未表現(xiàn)出對磷的活化能力，這可能是由于外源微生物在土壤中需要與土著微生物競爭生態(tài)位，以及土壤環(huán)境復(fù)雜等因素導(dǎo)致溶磷菌不能有效定殖、發(fā)揮溶磷作用[7，30]。在本研究土壤溶磷試驗(yàn)中，溶磷菌1416X3能夠活化土壤磷，增加速效磷含量，在菜地接種第3天和和花圃接種第8天土壤中速效磷含量分別提高了59.46%、118.87%，且在土壤中有較好的定殖能力。盆栽試驗(yàn)第8天，施加1416X3的處理速效磷含量為11.38 mg/kg，相比于對照增加了111.80%。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，大量的促生菌被開發(fā)為菌劑并應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[31-32]，但大多數(shù)已報(bào)到的功能菌僅具有單一的固氮或溶磷能力，為了滿足實(shí)際生產(chǎn)需要，有研究人員將不同功能的微生物進(jìn)行復(fù)配發(fā)現(xiàn)，菌株之間協(xié)同共棲，更有利于功能菌發(fā)揮作用[13]。在溶磷微生物的促生研究中，菌株的實(shí)際應(yīng)用效果是評(píng)價(jià)促生作用的重要指標(biāo)。魏暢等[33]的研究表明，接種溶磷菌W6的小麥生長30 d后，小麥的干質(zhì)量、株高、全磷含量分別增加了70.5%、32.1%、94.2%。本研究盆栽試驗(yàn)中，施加1416X3 的處理組玉米根長、莖粗、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、全磷相較對照處理分別提高了114.02%、43.03%、80.28%、80.85%、88.99%，說明該菌株可以提高玉米對磷的利用效率，促進(jìn)植株的生長。不同溶磷菌可通過分泌不同的有機(jī)酸或者通過表達(dá)磷酸酶等提高磷的溶出，張昊鑫等[34]篩選出的威茲曼芽孢桿菌YC9通過分泌吲哚乙酸促進(jìn)植物根系的生長，有利于植物汲取更多的營養(yǎng)和水分，從而達(dá)到增產(chǎn)目的?？梢?，溶磷菌對植物的促生作用是多種因素共同作用的結(jié)果，各因素之間的相互關(guān)系有待于深入研究，后續(xù)將繼續(xù)探索溶磷菌1416X3 對植物的促生機(jī)制，為其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。