蘭 英,鄭 佳,李 歐,封家福
(樂山職業(yè)技術學院,四川 樂山 614000)
石斛是我國傳統(tǒng)的名貴中藥,應用歷史悠久,被道家稱為中華九大仙草之首,具有滋陰清熱、生津養(yǎng)胃之功效[1]。近年來,浙江云南、廣東、廣西、湖南、安徽等省都積極發(fā)展石斛產(chǎn)業(yè),石斛產(chǎn)業(yè)已成為我國中藥產(chǎn)業(yè)中一個熱點[2]。根據(jù)《中國植物志》第19卷記載,四川南部(長寧、峨眉山、樂山)是石斛的地道產(chǎn)區(qū)之一。目前,樂山市轄屬的夾江縣歇馬鄉(xiāng)是石斛的主要產(chǎn)區(qū),主要栽培品種包括疊鞘石斛(DendrobiumdenneanumKerr.)、鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)等[3-4]。然而,石斛藥材基原復雜[5]?,F(xiàn)有的研究,包括化學成分和藥理活性的研究主要是集中于鐵皮石斛、金釵石斛等藥典收載品種[6-11],對于疊鞘石斛的研究較少,因而無法進行有效的品質評價和建立專屬的質量標準,嚴重制約石斛產(chǎn)業(yè)做大、做強。
多糖類化合物是天然藥物的主要活性成分之一,對多糖組成的分析對解釋多糖在生物體內(nèi)的作用機制具有重要意義[12-13]。然而,以多糖為指標對不同產(chǎn)地的疊鞘石斛與鐵皮石斛多糖及其化學分析方法進行比較卻不多見。因此,本研究選擇樂山地道中藥疊鞘石斛為研究對象,以中國藥典收錄品種鐵皮石斛為參照,采用柱前衍生化結合超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四級桿質譜(UPLC-QQQ-MS)檢測技術,對同2種石斛多糖水解后的單糖組成進行比較分析,從單糖組成和含量來探究不同種類石斛多糖的組成和結構特點,為后續(xù)質量標準的制定和譜效關系研究提供參考。
Agilent Technologies 1290 Infinity超高效液相色譜儀串聯(lián)Agilent 6460三重四級桿質譜儀,美國Agilent公司;十萬分之一電子天平,美國Sartorius公司;Eppendorf 5810R 高速離心機,德國Eppendorf公司。
總共6批疊鞘石斛與鐵皮石斛樣品均實地采集于各自主要產(chǎn)區(qū)。經(jīng)鑒定分別為蘭科植物疊鞘石斛DendrobiumdenneanumKerr.、鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的干燥莖。
甘露糖、葡萄糖、半乳糖、甲酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)購于美國Simga公司;色譜級乙腈、試劑級乙醇購于德國Merck公司;試驗用超純水以美國Millipore公司 Milli-QTM凈化系統(tǒng)制備。
色譜柱Waters BEH C18(1.7 μm, 2.1×100 mm)和保護柱VanGuardTM(BEH, C18, 1.7 μm, 2.1×5 mm);流動相:水(含0.01%甲酸)(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0~2 min,5% B;2~25 min,5%~25% B);柱溫30 ℃,流速0.2 mL·min-1,進樣量1 μL。
離子化模式ESI+下,采取多反應監(jiān)測(MRM)檢測并進行定量分析;離子化溫度(TEMP)550 ℃;GaTP1為379.2 kPa (55 psi),Gas2為379.2 kPa(55 psi);氣簾氣(Curtain Gas)為241.3 kPa(35 psi)同時對檢測離子對、去簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE)進行優(yōu)化。三種目標成分的優(yōu)化質譜檢測條件參數(shù)見表1。
表1 三種單糖成分測定中優(yōu)化的質譜條件參數(shù)Table 1 Parameters of optimized mass spectrometry conditions in the determination of three monosaccharide components
分別精密稱取D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖三種單糖對照品1.0 mg,將對照品分別置于1 mL容量瓶中,用超純水定容,使其配置成1.0 g·L-1的對照品儲備液。精密移取各儲備液各0.1 mL,超純水定容至1.0 mL,制備成最終濃度為 100 mg·L-1的單糖混合標準溶液,備用。
1.5.1 石斛多糖的提取與水解
精密稱取疊鞘石斛與鐵皮石斛樣品粉末約0.1 g(過三號篩),置索氏提取器中,加80%乙醇50 mL,加熱回流提取4 h,棄去乙醇液,藥渣揮干乙醇,濾紙筒拆開置于燒杯中,加水100 mL,煎煮1h,并時時攪拌,放冷,加水補至約100 mL,混勻,離心,備用。
吸取上述多糖溶液1 mL,置于10 mL安瓿瓶中,加 3.0 mol·L-1的鹽酸溶液0.5 mL,封口,混勻,110 ℃水解 1 h,放冷,用3.0 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至中性后定容,備用。
1.5.2 對照品與石斛樣品的PMP衍生化
將三種單糖混合標準溶液連續(xù)稀釋至質量濃度為0.01~1000 μg·L-1。吸取400 μL混合標準品溶液與400 μL PMP溶液與400 μL 0.3 mol/L氫氧化鈉溶液充分震蕩混勻后置于70 ℃烘箱反應100 min。反應結束后向上述溶液中加入500 μL 0.3 mol/L鹽酸,混勻后再加入2 mL氯仿溶液,充分震蕩混勻后,靜置5~10 min,取上層液體重復加氯仿洗滌2~3次后,過0.22 μm微孔濾膜后,備用。
精密吸取1.5.1項下的疊鞘石斛與鐵皮石斛多糖水解液400 μL,按以上相同方法衍生化處理后,既得衍生化的石斛樣品供試溶液。
將每種1 μL對照品溶液用于色譜-質譜條件下進樣測定,并用對照品的峰面積和對照品的質量濃度繪制校準曲線,確定回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍。分別設定信噪比(S/N)分別為3和10為檢測限(LOD=3)與定量限(LOQ=10)靈敏度閾值。結果見表2,三種單糖均顯示回歸線的相關系數(shù)R2>0.999,呈現(xiàn)良好的線性關系。
表2 三種單糖成分線性范圍、回歸方程和相關系數(shù)Table 2 Linear range, regression equation and correlation coefficient of three monosaccharide components
精密吸取一定濃度的混合對照品衍生化溶液1 μL,于“1.3”項下色譜-質譜條件下連續(xù)進樣6次,通過測定各對照品的峰面積,計算三種對照品峰面積的RSD,其范圍在1.66%~1.89%,表明儀器精密度較好。
取TP1樣品6份,每份0.1 g,精密稱定,按“1.5”所述平行制備6份石斛樣品的供試溶液,于“1.3”項下色譜-質譜條件下進樣測定,計算三種目標成分質量分數(shù)的RSD,為2.58%~3.67%,表明方法重復性較好。
取TP1樣品的供試溶液,分別在 0 h、2 h、4 h、8 h、 12 h、24 h后進行測定,于“1.3”項下色譜-質譜條件下進樣測定,計算三種目標成分峰面積的RSD,其范圍在2.17%~2.82%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。
精密稱取 TP1樣品6份,每份1.0 g,分別加入與1.0 g樣品中各待測成分含量相當?shù)膶φ掌?,照?.5”項下方法制備供試溶液,進樣測定,計算加樣回收率和RSD,計算4個成分的平均加樣回收率為99.62%~102.31%,RSD<2.67%,表明方法回收率良好。
表3 測定方法的方法學考察結果Table 3 Methodological investigation results of the determination method
采用UPLC-QQQ-MS法測定了6批樣品中三種單糖的組成和含量,結果見圖1和表4。
圖1 三種單糖供試溶液的MRM圖Fig.1 MRM diagrams of three monosaccharide test solutions
表4 疊鞘石斛與鐵皮石斛三種單糖的含量Table 4 Contents of three monosaccharides in Dendrobium denneanum and D. officinale
結果表明,疊鞘石斛與鐵皮石斛均含有甘露糖、葡萄糖和半乳糖。同時,疊鞘石斛與鐵皮石斛多糖各單糖組分中均以甘露糖含量最高,平均含量高達267.8 mg/g,其次為葡萄糖(175.3 mg/g)以及半乳糖(31.9 mg/g)。
本試驗樣品前處理方法參照中國藥典中鐵皮石斛項下,但色譜條件略加改進,各個單糖衍生物的峰很好地分離,不影響單糖組分的測定。石斛多糖經(jīng)過PMP柱前衍生化,再用UPLC-QQQ-MS進行測定具有簡單、快速、靈敏、準確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點,為不同種源的鐵皮石斛及疊鞘石斛的定性鑒別及藥材內(nèi)在質量評價提供新的參考依據(jù)。
試驗結果表明,以單糖為評價指標,甘露糖在鐵皮石斛中的含量較高,半乳糖在疊鞘石斛中含量較高,葡萄糖在兩種石斛中含量基本一致。盡管含量不同,但鐵皮石斛及疊鞘石斛樣品均檢出甘露糖、葡萄糖、半乳糖三種單糖,因此不同種源的兩種石斛有可以替代使用的可能性。
此次研究方法的確立以疊鞘石斛與鐵皮石斛中的三種單糖含量為指標,不僅提高了分析方法的科學性與準確性,而且可實現(xiàn)疊鞘石斛與鐵皮石斛質量比較的目的,實現(xiàn)了疊鞘石斛與鐵皮石斛藥效基礎物質的關聯(lián),為石斛產(chǎn)業(yè)在栽培技術、質量標準及新藥創(chuàng)制等中藥產(chǎn)業(yè)化示范提供了有力的支撐。