加壓毛細(xì)管電色譜分離檢測(cè)苦參中苦參堿成分*

張瀟晗，牛麗穎，2，3，畢曉東，2，3

(1 河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050091；2 河北省中藥配方顆粒創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050091；3 河北省中藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，河北 石家莊 050091)

苦參，為豆科槐屬植物，苦參的干燥根可作為中藥。其味苦、性寒，歸心、肝、胃、大腸、膀胱經(jīng)，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿之功效[1]?？鄥⒌姆N植范圍比較廣，隨著各地的自然環(huán)境的變化，山西、貴州、陜西、河北、遼寧的栽培種植面積逐漸擴(kuò)大，成為大家公認(rèn)的道地產(chǎn)地[2]。苦參研究報(bào)道中主要化學(xué)成分分為生物堿類、黃酮類、二苯甲酰基衍生物、萜類、脂肪酸、揮發(fā)油類等[3]。其中苦參堿和黃酮類化合物是苦參最主要的化合物，生物堿作為苦參的特征性成分，近年來備受關(guān)注。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，近年來對(duì)于苦參生物堿的研究主要集中于苦參堿抗腫瘤抗肝癌作用，氧化苦參堿治療胰腺炎、陰道炎等多種藥理作用。由于這兩種成分的結(jié)構(gòu)相似(圖1)，因此對(duì)于苦參堿和氧化苦參堿的分離分析具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

圖1 兩種苦參生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formulae of two sophora flaveseed alkaloids

經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，關(guān)于苦參中生物堿類成分的分離分析常用到的有薄層色譜法[4，5]，氣相色譜法[6]，高效液相色譜法[7]和高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法[8]等。加壓毛細(xì)管電色譜(Pressurized capillary electrochromatography， pCEC)是結(jié)合了毛細(xì)管電色譜和高效液相色譜法的一種新發(fā)展起來的分離分析技術(shù)，具有電滲流和壓力的雙重驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)分配系數(shù)的不同，從而實(shí)現(xiàn)樣品的高速分析。本實(shí)驗(yàn)采用新型高效環(huán)保的加壓毛細(xì)管電色譜法，對(duì)苦參中兩種生物堿成分進(jìn)行分離。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器試劑

TriSepTM-2100加壓毛細(xì)管電色譜，上海通微分析技術(shù)有限公司；UV-2102PC 型紫外-可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；KQ250型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BSA224SCW電子分析天平，北京賽多利斯；旋渦混合器；濾頭，注射器；純水機(jī)。

苦參堿和氧化苦參堿(含量均為98%)，北京百靈威科技有限公司；苦參藥材(批號(hào)121019-201407)，中國食品藥品鑒定研究院；乙腈(色譜純)，F(xiàn)isher化學(xué)試劑公司；其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為RO級(jí)別用水。所有試劑和溶液在進(jìn)樣器前都需要用0.2 μm濾膜過濾，流動(dòng)相需超聲除氣。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

分別精密稱取苦參堿以及氧化苦參堿適量加適量乙腈溶解，配置成質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，超聲十分鐘，備用。臨用時(shí)分別稀釋成0.33 mg·L-1的對(duì)照品溶液用旋渦混合器震蕩搖勻，待用。

pCEC-UV色譜條件，毛細(xì)管填充柱(EP-100-20/45-3-C18，內(nèi)徑 100 μm，總長度 45 μm，有效長度20cm，ODS填料內(nèi)徑3 μm)；流動(dòng)相：流動(dòng)相為乙腈-3%乙酸溶液(97∶3)；流動(dòng)相的流速為0.06 mL/min，分離電壓為0 KV，紫外檢測(cè)波長為220 nm。進(jìn)樣量 1.5 μL；電壓施加在毛細(xì)管的出口端，進(jìn)口端接地。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相的種類以及體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行了優(yōu)化，首先選用甲醇-0.1%磷酸水溶液(10∶90)，此時(shí)苦參堿與氧化苦參堿可成功分離，但是當(dāng)檢測(cè)波長為210時(shí)溶劑峰較大，溶劑影響明顯。因此將甲醇替換成乙腈進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，選用乙腈-1%乙酸水溶液(90∶10)，此時(shí)苦參堿和氧化苦參堿不能完全達(dá)到極限分離。提高乙酸水溶液的濃度，可明顯改善峰形，提高靈敏度。進(jìn)一步繼續(xù)改善流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)選用乙腈-3%乙酸水溶液(97∶3)時(shí)，基線可以得到很好的分離，峰形較好.本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了以氯化銨和異丙醇為添加劑對(duì)苦參堿和氧化苦參堿分離的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩種添加劑會(huì)對(duì)基線造成較大波動(dòng)，導(dǎo)致平衡時(shí)間過長，因此最終選97%的乙腈為有機(jī)相，3%乙酸水溶液為水相流動(dòng)相。

2.2 流速和分離電壓的選擇

流速的大小直接改變柱壓，從而影響出峰時(shí)間以及分離度，本實(shí)驗(yàn)考察了(0.04，0.05，0.06 mL/min)三種流速對(duì)苦參堿和氧化苦參堿的分離效果。實(shí)驗(yàn)表明在壓力允許的范圍內(nèi)，流速的增大，可減小分離時(shí)間，縮短單個(gè)組分的出峰時(shí)間。流速小，單個(gè)組分出峰時(shí)間過長，因此本實(shí)驗(yàn)選擇 0.06 mL/min的流速。電壓的增加會(huì)改變電滲流的大小，從而影響各組分之間的保留情況。本實(shí)驗(yàn)考察了(-5，-3，-1，0，1，3，5)七種電壓大小，結(jié)果表明，在毛細(xì)管出口端施加正電壓時(shí)，兩種生物堿出峰時(shí)間提前，導(dǎo)致基線分離受到影響，無改善峰形等影響效果。并且隨著電壓的增大，電流持續(xù)時(shí)間增長，會(huì)出現(xiàn)焦耳熱，從而增加基線的平衡時(shí)間。對(duì)比不加電壓的情況，綜合選擇0 kV為分離電壓。此時(shí)氧化苦參堿在10 min處先出峰，苦參堿在14 min處出峰。

圖2 混標(biāo)(流速0.06，進(jìn)樣量1.5 μL)Fig.2 Mixed standard (flow rate of 0.06， sample volume of 1.5 μL)

圖3 氧化苦參堿(流速0.06，進(jìn)樣量1.5 μL)Fig.3 Oxymatrine (flow rate of 0.06,sample volume of 1.5 μL)

圖4 苦參堿(流速0.06，進(jìn)樣量1.5 μL)Fig.4 Matrine (flow rate of 0.06, sample volume of 1.5 μL)

圖5 乙腈(流速0.06，進(jìn)樣量1.5 μL)Fig.5 Acetonitrile (flow rate of 0.06， sample volume of 1.5 μL)

圖6 苦參藥材(流速0.06，進(jìn)樣量1.5 μL)Fig.6 Sophora flavescens (flow rate of 0.06, sample volume of 1.5 μL)

3 結(jié) 論

本文建立了加壓毛細(xì)管電色譜分離苦參兩種生物堿類成分，在18 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了苦參堿和氧化苦參堿的兩種種生物堿快速高效分離，該方法的分離時(shí)間短，消耗有機(jī)試劑量小，為苦參等生物堿類成分的分離提供了一種新型快速高效的分離方法。對(duì)于苦參堿和氧化苦參堿的分離分析具有較大的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。