貴州廢棄煙葉抗炎活性部位及其化學(xué)成分分析鑒定*

孫佳玉，穆淑珍，李 江，鄧璐璐，蘇賢坤

(1 貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550000；2 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550000；3 貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550000)

炎癥是機(jī)體對于刺激的一種防御反應(yīng)，其參與了多種病理疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致多種組織、器官的嚴(yán)重?fù)p害，進(jìn)而誘發(fā)疾病的產(chǎn)生，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致休克或死亡[1-3]。目前臨床上主要使用甾體和非甾體兩大類抗炎藥物治療炎癥性疾病，其治療效果雖然顯著，但它們可能對組織器官和機(jī)體造成不可逆的損傷，甚至引起死亡，嚴(yán)重影響著人類和動物的健康[4-5]，目前尚無有效的特效抗炎藥物。因此，尋找新型的抗炎候選藥物先導(dǎo)化合物依然是當(dāng)前創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要組成部分。

從藥用植物中尋找活性成分是創(chuàng)新藥物先導(dǎo)物發(fā)現(xiàn)的重要途徑之一。煙葉除作為卷煙的重要原料之外，也是很有價值的藥用植物，在我國各地廣泛種植，其中含有煙堿、茄尼醇、綠原酸等多種有效成分，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、生物和化學(xué)等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景和良好的研究價值[6-7]。煙葉屬于茄科(Solanaceae)煙草屬(Nicotiana)一年生或有限多年生草本植物煙草(NicotianatabacumL.)，其全株可作農(nóng)藥殺蟲劑，亦可藥用[8]。煙葉作為一種高產(chǎn)、重要的經(jīng)濟(jì)作物，其廢棄物的增量也隨煙葉產(chǎn)量大幅度增長，但通過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外對煙葉提取物生物活性主要體現(xiàn)在抗神經(jīng)系統(tǒng)疾病、抗腫瘤、抗病毒等方面，抗炎方面的研究卻鮮見報道[9-12]。因此，本研究旨在研究廢棄煙葉提取物不同極性部位的抗炎活性作用及其化學(xué)成分分析與鑒定，為進(jìn)一步高值化、綠色開發(fā)多用途的廢棄煙葉，研制出具有綠色、毒副作用小的天然抗炎產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀 器

Dionex Ultimate 3000 RSLC/Thermo Scientific Q Exactive Focus型高分辨質(zhì)譜儀，3111型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國 Thermo Fisher Scientific公司；EPOCH 型多功能酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司；離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；CX23 型生物顯微鏡，日本Olympus公司；HFsafe-1200LC型生物安全柜，上海力新儀器有限公司。

脂多糖，北京索萊寶科技有限公司；NO 檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；青霉素鏈霉素雙抗、胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿、凍存管、96孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶，美國Corning 公司；甲醇、乙腈試劑為色譜純，上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.2 藥材與細(xì)胞

煙葉(云煙87)于2021年6月采自貴州省安順市平壩區(qū)鼓樓辦事處天馬村(貴州省煙草科學(xué)研究院提供)。標(biāo)本存放于貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室。

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方 法

2.1 煙葉不同萃取部位的制備

將廢棄煙葉(1.0 kg)晾曬粉碎后，用95%的工業(yè)乙醇提取，提取3次，每次提取3 h，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，制得煙葉醇提物浸膏；將煙葉醇提物(32.8 g)溶解后用 40～80目硅膠拌樣裝入玻璃柱(36 cm×7.5 cm)中，依次使用不同極性溶劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇洗脫，將各種不同極性溶劑的濾液分別收集并減壓濃縮后，可得到石油醚組(M1)、乙酸乙酯組(M2)、正丁醇組(M3)和甲醇組(M4)等 4種不同極性部位。稱取適量上述4種不同極性部位和乙醇提取物(M5)，用DMSO溶液將上述不同極性部位溶解，制得濃度為50 mg/mL的藥物母液，分別為石油醚組(M1)、乙酸乙酯組(M2)、正丁醇組(M3)、甲醇組(M4)和乙醇提取物組(M5)，置于4 ℃冰箱中保存，以備后續(xù)抗炎活性篩選實驗所用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7加入DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及1%的青鏈霉素雙抗)中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，次日換液[13]。

2.3 抗炎活性篩選

參照文獻(xiàn)[14]的方法，利用LPS誘導(dǎo)RAW 264.7 細(xì)胞建立炎癥模型，以細(xì)胞培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO濃度評價煙葉不同極性部位的抗炎活性。取對數(shù)生長期的RAW 264.7 細(xì)胞，按2×104個/孔接種于96孔板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，棄去上清液，將細(xì)胞分為空白對照組、模型組和藥物組(乙醇提取物組、石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組、甲醇組)。模型組加入與藥物組DMSO含量相同的溶液，藥物組分別加入含相應(yīng)藥物的溶液，每孔100 μL，上述藥物的質(zhì)量濃度(終濃度)分別為25.0、50.0、100.0 μg/mL，每組設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，按5 μL/孔加入2 μg/mL的LPS(溶劑為含10% FBS、1%的青霉素和鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基)；繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，棄去上清液，按NO檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用多功能酶標(biāo)儀于540 nm波長下檢測各孔的光密度(optical density，OD)值，配置NaNO2標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度范圍為100～0.31 μM，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算出培養(yǎng)基RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生亞硝酸鹽的濃度。

2.4 抗炎活性部位化學(xué)成分的分析與鑒定

2.4.1 檢測方法與條件

(1)液相色譜方法：UHPLC為Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLC；色譜柱為ACE Ultracore 2.5 SuperC18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流速為 0.3 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣體積為 5 μL；流動相：A相為乙腈(含0.1%甲酸)，B相水(含0.1%甲酸)，梯度洗脫條件見表1。(2)質(zhì)譜方法：質(zhì)譜儀為Thermo Scientific Q Exactive Focus臺式高分辨質(zhì)譜儀；實驗采用正負(fù)切換Full MS-ddMS2掃描方式進(jìn)行篩查分析，F(xiàn)ull MS：分辨率為 70000，isolation width為 1.5 m/z，MS/MS 采集：17500分辨率下數(shù)據(jù)依賴采集；碰撞能梯度(NCE 模式)：20、40、60 eV；質(zhì)荷比窗口寬度(TopN)：3；質(zhì)譜測定數(shù)據(jù)采用全掃描模式采集，數(shù)據(jù)采集范圍m/z 100～1500。(3)樣品前處理：參照文獻(xiàn)[15]，抗炎活性部位組經(jīng)1%甲酸乙腈/水溶液溶解，離心，過濾，供測定分析。

表1 UHPLC檢測條件Table 1 UHPLC detection conditions

2.4.2 數(shù)據(jù)分析

分別精密吸取“2.1”項下抗炎活性檢測組中明確為活性部位的供試品溶液，按“2.4.1”項下檢測條件進(jìn)樣分析，得總離子流圖。根據(jù)所得總離子流圖，提取化合物精確分子質(zhì)量信息，運用 Xcalibur 3.0軟件(美國 Thermo Fisher Scientific 公司)在質(zhì)量偏差小于5 ppm 的范圍內(nèi)計算其可能的元素組成。其次，以一級質(zhì)譜獲取的分子離子峰作為母離子，進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)二級質(zhì)譜分析，獲得相應(yīng)化合物的碎片離子。

3 結(jié)果與討論

3.1 廢棄煙葉乙醇提取物中不同極性部位的抗炎活性

廢棄煙葉提取物中不同極性部位在200 μg/mL濃度下對RAW 264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果見圖1，由圖可見廢棄煙葉石油醚組(M1)、乙酸乙酯組(M2)、正丁醇組(M3)、甲醇組(M4)和乙醇提取物(M5)對RAW 264.7 細(xì)胞均沒有細(xì)胞毒性；上述五組樣品對RAW 264.7細(xì)胞均顯示有抗炎活性，如圖2所示，其中乙酸乙酯組(M2)和正丁醇組(M3)的抗炎活性尤為突出。

圖1 不同極性部位對RAW 264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性Fig.1 Cytotoxicity of different polar parts on RAW 264.7 cells

圖2 不同極性部位對RAW 264.7細(xì)胞生成NO的影響Fig.2 Effects of different polar parts on NO production in RAW 264.7 cells

3.2 抗炎活性部位的化學(xué)成分分析與鑒定結(jié)果

煙葉提取物中抗炎活性顯著的乙酸乙酯組(M2)和正丁醇組(M3)部位的總離子流圖見圖3和4。根據(jù)所得總離子流圖(TIC)，提取化合物精確分子質(zhì)量信息，與化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫比對，并結(jié)合化合物質(zhì)譜的碎片離子信息和相關(guān)文獻(xiàn)報道，最終從乙酸乙酯組中鑒定了 21個化合物，正丁醇組中鑒定了21個化合物，結(jié)果見表2和表3。

圖3 乙酸乙酯組在正離子和負(fù)離子模式下的TIC圖Fig.3 TIC of ethyl acetate group in positive and negative ion mode

圖4 正丁醇組在正離子和負(fù)離子模式下的TIC圖Fig.4 TIC of n-butanol group in positive and negative ion mode

表2 乙酸乙酯組化學(xué)成分分析與鑒定結(jié)果Table 2 Chemical components from ethyl acetate group by analyzing and identifying

表3 正丁醇組化學(xué)成分分析與鑒定結(jié)果Table 3 Chemical components from n-butanol group by analyzing and identifying

通過對貴州廢棄煙葉中乙醇提取物及其不同極性部位進(jìn)行體外抗炎活性篩選，發(fā)現(xiàn)上述不同極性部位對RAW 264.7細(xì)胞均有抗炎活性，尤其是乙酸乙酯組和正丁醇組的抗炎活性較為突出，提示了廢棄煙葉在抗炎活性方面應(yīng)該具有較好的研發(fā)潛力。進(jìn)一步運用高分辨質(zhì)譜技術(shù)，結(jié)合二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)、保留時間，與相關(guān)數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)進(jìn)行比對，分別從抗炎活性顯著的乙酸乙酯組和正丁醇組中各分析鑒定出21種化學(xué)成分。通過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)其中的(-)-可替寧、東莨菪內(nèi)酯、松香酸和石吊蘭素等單體化合物是具有一定的抗炎活性的，推測乙酸乙酯組和正丁醇組產(chǎn)生的抗炎活性可能與上述具有抗炎活性的化合物有著密切關(guān)系。

4 結(jié) 論

本研究對貴州廢棄煙葉中不同極性部位抗炎活性篩選并采用高分辨質(zhì)譜Q Exactive Focus分析鑒定了活性部位乙酸乙酯組和正丁醇組中的化學(xué)成分。通過調(diào)研發(fā)現(xiàn)部分化合物有文獻(xiàn)報道其具有抗炎活性，其主要成分為萜類和黃酮類化合物，其次為生物堿類和酚類化合物，這為進(jìn)一步開展廢棄煙葉中的活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)，同時為廢棄煙葉的多用途研究，進(jìn)而研制出具有毒副作用小的天然抗炎保健品或藥物提供了新思路和科學(xué)依據(jù)。