草食動物腸道厭氧真菌分離培養(yǎng)技術(shù)及其在農(nóng)牧業(yè)的應(yīng)用現(xiàn)狀

■楊 闖 郭勇慶 王明月 高沖亞 孫寶麗

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642）

草食動物能夠?qū)㈦y以消化的植物纖維通過胃腸道發(fā)酵轉(zhuǎn)化成可利用的能量形式，這與棲息于它們瘤胃中數(shù)以萬億計的微生物作用密不可分。厭氧真菌（anaerobic fungi，AF）廣泛存在于反芻動物瘤胃中，因此被習(xí)慣性地稱為瘤胃真菌，由于后期在馬、牛等腸道也發(fā)現(xiàn)了同樣的厭氧真菌，因此，瘤胃厭氧真菌這一稱呼也逐漸被腸道厭氧真菌（anaerobic gut fungi，AGF）所替代。AGF被認為是重要的瘤胃功能性微生物，這主要是由于它們可以作為植物飼料高效的降解劑，雖然AGF在胃腸道中僅占微生物總量的7%～9%，卻能從植物性飼料中釋放出超過50%的發(fā)酵糖類物質(zhì)。AGF 能夠產(chǎn)生各種形式的水解酶作用于植物纖維，使得它們成為植物性飼料消化的發(fā)起者，因而具有極高應(yīng)用價值。然而，迄今為止，AGF 在現(xiàn)實中的應(yīng)用并不是太理想，這主要是由于AGF 對氧高度敏感，使得無論是運輸或是保存都成為令人頭疼的問題。因此，優(yōu)化分離培養(yǎng)以及保存技術(shù)在開發(fā)AGF利用價值方面顯得格外重要。文章擬從AGF 菌株已鑒定屬類現(xiàn)狀、分離培養(yǎng)和保存技術(shù)以及AGF現(xiàn)階段的應(yīng)用潛力情況做簡單綜述，以期能夠為相關(guān)科研人員在AGF探究過程中提供一些啟發(fā)與幫助。

1 AGF的研究發(fā)展及形態(tài)學(xué)特征

AGF發(fā)現(xiàn)過程經(jīng)歷多個階段，其種屬的分類也隨著生命科學(xué)技術(shù)的進步發(fā)生了不小的變化。1912年，相關(guān)研究在瘤胃中發(fā)現(xiàn)了AGF的存在，觀測發(fā)現(xiàn)這種新微生物具有多鞭毛的結(jié)構(gòu)，但受限于當(dāng)時的技術(shù)，并未將這種新發(fā)現(xiàn)的微生物歸類為真菌，而是歸類為原蟲，并命名為Callimastix cyclops；1913 年，相關(guān)研究在瘤胃中發(fā)現(xiàn)了在形態(tài)結(jié)構(gòu)上類似的“原蟲”，并將其命名為Callimastix frontalis；直到1975 年Orpin（1975）將C. frontalis重新培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其具有真菌的特性，并將其重新命名為Neocallimastix frontalis，歸類為藻菌綱（Phycomycetes）。至此，人們開始使用真菌的研究方式來探索AGF的奧秘。Orpin（1977）在該類生物細胞壁中發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)成分的存在，Barr（1988）認為該類微生物不應(yīng)為藻菌類生物，而是真正的真菌，重新將該類生物歸類為壺菌綱（Chytridiomycetes）。隨著分子生物學(xué)的興起，AGF 的分類更加細化。通過對核糖體RNA操縱子與蛋白質(zhì)編碼等基因以及其代謝特性進行分析，使得AGF以一個新的門類獨立出來，形成新毛菌門（Neocallimastigomycota）。自1975 年首次確定AGF 后的40 年里，僅有6 個屬為人們所鑒定與命名。隨著鑒定技術(shù)的發(fā)展以及AGF 在植物細胞降解過程中的價值逐漸為人們所重視，近些年來，不斷有新的AGF屬類被鑒別與命名，且大多來源于野生反芻動物。

AGF的形態(tài)學(xué)特征是其屬類劃分的重要依據(jù)，根據(jù)Mountfort 在1994 年所描述的方式，屬類劃分在形態(tài)學(xué)方面的標(biāo)準(zhǔn)主要根據(jù)AGF是單中心或是多中心，假根形態(tài)以及游動孢子的鞭毛特點，而種的劃分需要根據(jù)游動孢子的超微結(jié)構(gòu)來確定。上述所提到屬的形態(tài)學(xué)特點主要涉及的幾個概念如下：首先，單或多中心AGF可根據(jù)真菌形成的孢子囊數(shù)量劃分，單中心（monocentric）AGF 為僅產(chǎn)生1 個（簇）孢子囊，而多中心（polycentric）AGF 則會產(chǎn)生多個（簇）孢子囊，在生長過程中，單中心AGF 的細胞核不會遷移到假根中，而多中心AGF 的細胞核會遷移至假根中形成具核假根；其二是假根形態(tài)，絲狀（filamentous）假根AGF 的假根會經(jīng)歷多次分支而形成類似于樹根狀的結(jié)構(gòu)，而球狀假根（bulbous）AGF 的假根會膨大形成球莖狀假根結(jié)構(gòu)；其三為游動孢子的鞭毛特點，根據(jù)游動孢子體表的鞭毛數(shù)量，可分為多鞭毛（polyflflagellate）游動孢子和單鞭毛（uniflflagellate）游動孢子，單鞭毛游動孢子的體表一般有1～4根鞭毛，而多鞭毛游動孢子一般有7～30根鞭毛。目前已分離鑒定的AGF名稱及主要的形態(tài)學(xué)特點如表1所示。

表1 現(xiàn)階段已分離鑒定的菌種

2 AGF分離培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)狀

近5 年來，AGF 被鑒定與命名的數(shù)量快速增加，但這一數(shù)量遠不足以揭示厭氧真菌在微生態(tài)中的多樣性。AGF 鑒定的起始環(huán)節(jié)是要將菌體從其所處的生態(tài)中分離出來，而后經(jīng)過擴增繁殖，才能通過各類方法進行鑒定分類。然而，由于AGF的嚴格厭氧特性且連續(xù)傳代易衰老，在很大程度上限制了AGF 的發(fā)展，遑論其應(yīng)用價值。下面簡要介紹了現(xiàn)階段AGF從樣品采集、分離、培養(yǎng)以及保存與復(fù)蘇方法的研究現(xiàn)狀與注意事項，以期為AGF的分離鑒定以及應(yīng)用價值的探索提供參考。

2.1 AGF樣品的采集與分離

2.1.1 AGF樣品的采集與富集

AGF 的樣品來源主要是反芻動物的糞便以及瘤胃內(nèi)容物，在采集過程中需盡可能裝滿取樣管以排空氧氣，采集后的樣品應(yīng)24 h內(nèi)于冷藏條件下轉(zhuǎn)移至實驗室進行分離培養(yǎng)。獲取的樣品需要在厭氧工作臺內(nèi)打開，然后接種于高壓蒸汽處理后的瘤胃液-纖維二糖（rumen-fluid-cellobiose, RFC）培養(yǎng)基內(nèi)39 ℃富集24 h，其中纖維二糖可以使用0.5%的纖維素替代。當(dāng)樣品中AGF 達到一定數(shù)量后，可將富集好的AGF連續(xù)稀釋5～10倍并分別接種于添加了1∶1纖維素和柳枝稷（Panicum virgatumL.）的厭氧瘤胃液（rumen fluid, RF）培養(yǎng)基內(nèi)，39 ℃培養(yǎng)。由于AGF 常在植物表面定植，且在其生長過程產(chǎn)生的氣體會導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)的植物纖維上浮并發(fā)生顏色改變，因此該現(xiàn)象可以作為AGF 的生長旺盛的標(biāo)志，也提示分離的最佳時期，一般72 h 左右出現(xiàn)上述現(xiàn)象。此外，培養(yǎng)基內(nèi)可以加入抗生素以減少細菌對AGF生長過程中的干擾，Hanafy等（2018）在分離Feramyces austinii時推薦的抗生素組合為50 μg/mL 卡那霉素、50 μg/mL 青霉素、20 μg/mL鏈霉素以及50 μg/mL氯霉素。

2.1.2 亨氏滾管技術(shù)培養(yǎng)AGF

AGF的分離主要采用亨氏厭氧滾管技術(shù)，該方法由Hungate（1969）建立并于1969 年發(fā)表，該方法主要基于銅在高溫條件下與玻璃管腔內(nèi)氧氣反應(yīng)，進而制造出厭氧環(huán)境。經(jīng)過處理后的亨氏管管腔內(nèi)的氧氣被消耗殆盡，使用特制耐熱橡膠塞封閉開口后，便人工制造出適合AGF 生長的厭氧環(huán)境。將前文提到的培養(yǎng)完畢的AGF 使用生理鹽水稀釋后與瓊脂培養(yǎng)基（RFC+2%瓊脂）混合，使用無菌注射器接種于除氧后的亨氏管中，平放于滾管機中較低溫度迅速滾動，使得管壁內(nèi)混合AGF與培養(yǎng)基的液體凝固形成薄膜，而后置于39 ℃培養(yǎng)48～72 h，培養(yǎng)物在亨氏管內(nèi)可以長期存活。

2.2 AGF的分離純化與形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)上述方法培養(yǎng)后，可挑取形成的菌落接種于RFC培養(yǎng)基內(nèi)擴增，需進行至少3輪的純化與亨氏滾管培養(yǎng)以保證所分離菌群的純度，直至所有培養(yǎng)管內(nèi)的菌落形態(tài)一致。菌株需通過每2～3 周一次傳代培養(yǎng)到RFC培養(yǎng)基中進行維持。

形態(tài)學(xué)觀察方法可以用來判定所分離的AGF 真菌形態(tài)是否一致，可用于驗證分離的純度。主要使用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡對生長在液體或者固體（加入2%瓊脂來凝固）的RFC 培養(yǎng)基內(nèi)的AGF 進行觀察，通過鑒別假根形態(tài)、生長類型以及游動孢子的鞭毛數(shù)量來初步鑒定AGF。使用光學(xué)顯微鏡觀察菌體結(jié)構(gòu)時，可以使用乳酚棉藍染色，使用激光共聚焦顯微鏡在微分干涉對比（DIC）模式下進行觀察。為了使細胞核在光學(xué)顯微鏡下可視化，可以加入10 μg/mL的4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）并在暗室內(nèi)孵育10 min，洗去多余的DAPI后，將玻片于暗室中風(fēng)干，然后置于4%沒食子酸正丙酯和90%甘油（V/V）的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。電子顯微鏡觀察菌體結(jié)構(gòu)需將樣品在室溫下使用戊二醛中浸泡，而后使用四氧化鋨固定、多梯度乙醇溶液脫水后干燥，最后使用Au-Pb濺射涂層，置于電子顯微鏡下觀察。

2.3 AGF的保存與復(fù)蘇

根據(jù)Bio-protocol 出版的《微生物組實驗手冊》中所描述，純化后的AGF可使用稻秸培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中稻秸浮起即證明傳代成功。取培養(yǎng)72 h 且稻秸浮起的培養(yǎng)管加入含有5%二甲基亞砜的纖維二糖培養(yǎng)基，并迅速轉(zhuǎn)移至凍存管內(nèi)冰浴5～10 min 后，-80 ℃冰箱過夜，隔天放入液氮進行中長期保存。復(fù)蘇時可將凍存管于冰上解凍，而后將解凍后的稻秸置于加入0.1 mL 氯霉素溶液的纖維二糖培養(yǎng)基內(nèi)，39 ℃培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)期間內(nèi)觀察到稻秸浮起且形成菌膜則證明復(fù)蘇成功。

3 草食動物AGF在甲烷生產(chǎn)與反芻動物飼養(yǎng)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

3.1 AGF優(yōu)秀的纖維降解作用

在研究的早期人們便發(fā)現(xiàn)，新攝入植物性飼料中血紅素以及卟啉等各類植物成分會促進AGF 孢子的釋放，且游動的孢子具有趨化作用，會向可溶性糖或酚酸豐富的區(qū)域聚集，在觀察AGF 對黑麥草的作用時，發(fā)現(xiàn)AGF 會優(yōu)先對植物的氣孔或破損處進行侵襲，孢子萌發(fā)后會生長出根狀組織從植物中汲取碳源以供菌體需要。體外試驗也證實AGF 在瘤胃中對植物纖維的降解作用要遠大于瘤胃中具有纖維降解能力的細菌。優(yōu)秀的植物纖維降解能力要歸功于AGF所產(chǎn)生的種類廣泛的碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes，CAZymes）以及物理穿透能力，AGF的菌絲末端可以產(chǎn)生高濃度的纖維分解酶，這些酶類可以有效地降解植物細胞的纖維成分，其產(chǎn)物也為生態(tài)內(nèi)的其他微生物提供了養(yǎng)分，因此AGF常被認為是植物性飼料降解的發(fā)起者。

AGF在降解纖維的過程中，除了能夠形成多種游離的CAZymes外，還可以產(chǎn)生由各類纖維分解酶以及相關(guān)輔酶形成獨有的纖維復(fù)合酶體（cellulosomes，也稱纖維小體），這種纖維復(fù)合酶體是將多種纖維降解酶與相關(guān)的輔酶打包在一起，從而達到協(xié)作以高效水解纖維的效果。有研究表明，纖維素復(fù)合酶體的效率是游離狀態(tài)下酶的12 倍。此外，AGF 還可以形成細胞結(jié)合態(tài)的纖維素復(fù)合酶體，主要位于假根的末端，配合假根的物理穿透能力，可以從多角度對植物細胞壁進行侵襲，以破壞植物細胞壁，完成纖維的分解過程。Hagen 等（2021）利用分子生物學(xué)手段對AGF 以及纖維分解細菌的CAZymes進行分析，發(fā)現(xiàn)瘤胃內(nèi)的細菌所產(chǎn)生的CAZymes 主要作用于較易分解的半纖維素，而AGF 產(chǎn)生的CAZymes 主要針對難以降解的纖維素進行水解，因此二者可能會有互補作用。

3.2 AGF在產(chǎn)甲烷中的應(yīng)用

AGF 優(yōu)秀的纖維降解能力也使得其與產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生了十分緊密的共存關(guān)系。產(chǎn)甲烷菌同樣嚴格厭氧，且只能利用一些結(jié)構(gòu)較為簡單的化合物（H2、CO2、HCOOH等）來合成甲烷，并在此過程中產(chǎn)生菌體生長所需要的能量，而AGF的代謝產(chǎn)物剛好可以產(chǎn)生產(chǎn)甲烷菌代謝所需要的大部分原料。產(chǎn)甲烷菌的代謝過程對于瘤胃發(fā)酵有十分重要的作用，他們大量利用氫，通過合成甲烷來消耗電子，維持氫濃度，促進纖維降解微生物對植物組織的降解。AGF嚴格厭氧，細胞內(nèi)并不含線粒體，而是在細胞內(nèi)生物隔膜形成的小區(qū)室-氫化酶體中進行底物水平磷酸化，進而產(chǎn)生代謝所需的ATP。在AGF代謝過程中，蘋果酸和丙酮酸進入氫化酶體后會被代謝成為H2、CO2、甲酸和乙酸并產(chǎn)生ATP，而在與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)更多的蘋果酸與丙酮酸進入了氫化酶體，促使產(chǎn)生更多的乙酸和ATP。這樣的現(xiàn)象可能是由于產(chǎn)甲烷菌消耗了H2，而使得氫化酶受到的抑制減弱，促進了氫化酶體內(nèi)NAD（P）H 生成H2的途徑，進而使得更多碳水化合物被代謝成為乙酸和ATP，促進了AGF的生命活動。

AGF與產(chǎn)甲烷菌在瘤胃中共存使得反芻動物成為人為甲烷的重要來源，每年90 Tg（1 Tg=1012g）的甲烷排放量對于全球溫室治理與畜牧業(yè)來說都是一個不可忽視的問題。而AGF 與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)可以快速將含有大量纖維的植物材料轉(zhuǎn)化為甲烷，在農(nóng)副產(chǎn)品能源開發(fā)領(lǐng)域中大有可為。工業(yè)上的厭氧發(fā)酵大多都存在木質(zhì)素降解能力有限的問題，這是由于木質(zhì)素類材料無論是物理結(jié)構(gòu)還是化學(xué)性質(zhì)都相對穩(wěn)定，因此，生產(chǎn)沼氣的首要步驟是對材料進行預(yù)處理。工業(yè)上常規(guī)用于處理木質(zhì)材料的物理化學(xué)方法不但昂貴，而且廢液的處理也是對環(huán)境不小的威脅。而使用AGF 與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)來發(fā)酵木質(zhì)材料生產(chǎn)甲烷可以很好地代替?zhèn)鹘y(tǒng)物理化學(xué)處理方法，且在復(fù)雜的生物反應(yīng)過程中，能夠更加高效地生產(chǎn)甲烷，且減少了二次污染物的產(chǎn)生。產(chǎn)甲烷菌的存在也可以上調(diào)AGF對CAZymes的表達量，促進其對木質(zhì)素的降解效率。各類報道也證明了AGF 與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)可以有效地提高甲烷生產(chǎn)效率：Wei等（2016）利用從牦牛體內(nèi)分離的AGF與產(chǎn)甲烷菌進行簡單的共培養(yǎng)，分別以小麥秸稈、玉米秸稈以及稻秸作為底物，經(jīng)過7 d 的培養(yǎng)，分別產(chǎn)生了3.00、3.29 mmol/g以及3.15 mmol/g甲烷干物質(zhì)；Shi等（2019）利用AGF 和產(chǎn)甲烷菌的共同培養(yǎng)來降解未經(jīng)蒸汽爆破的玉米秸稈，便可生產(chǎn)出（37.10±1.09）mL甲烷。綜上所述，AGF與產(chǎn)甲烷菌共同接種于植物原料來生產(chǎn)甲烷是一種十分高效的方式且對環(huán)境影響較小，同時也可以解決農(nóng)副產(chǎn)品產(chǎn)量過剩的問題，但分離并篩選高效的AGF 與產(chǎn)甲烷菌組合的研究進展較為緩慢，在一定程度上制約了該技術(shù)的發(fā)展。

3.3 AGF在飼料處理及提升反芻動物健康中的作用

如前文所述，AGF可以產(chǎn)生一系列的酶類降解植物纖維，尤其引人注目的是其對木質(zhì)材料等難消化纖維的降解能力，這也使得人們開始考慮應(yīng)用AGF及其酶來改善低質(zhì)量飼料，進而提升草食動物對低質(zhì)量飼料的消化率。

資源合理化利用一直是人們的追求，在飼料資源匱乏的地區(qū)，將低質(zhì)量飼料中的能量轉(zhuǎn)化為高質(zhì)量動物蛋白是十分有意義的。AGF的嚴格厭氧特點，也使得其在青貯貯藏過程中展現(xiàn)出了較大的潛力。Lee等（2015）分離篩選出3種纖維素分解活性高的菌株參與水稻秸稈青貯的發(fā)酵，分別測得10、30、60、90 d 和120 d 的干物質(zhì)損失率以及纖維降解程度，結(jié)果表明AGF 處理后，稻秸青貯干物質(zhì)損失率下降，且纖維降解程度顯著提高；Wang 等（2019）在全株玉米青貯制作過程中以AGF作為添加劑，在發(fā)酵30 d后，發(fā)現(xiàn)接種AGF 提升了全株玉米的干物質(zhì)回收率以及中性洗滌纖維（NDF）與酸性洗滌纖維（ADF）的消化率。然而，利用AGF進行飼料開發(fā)也存在著一定的制約，Ravi等（2021）研究了3 種厭氧真菌（Anaeromyces mucronatusYE505,Neocallimastix frontalis27,Piromyces rhizinflatusYM600）對玉米和蘆葦木質(zhì)素纖維水解的影響，并測定干物質(zhì)損失率以及纖維降解程度等指標(biāo)，但遺憾的是，3種不同類型的AGF對玉米以及蘆葦纖維的水解并沒有改善作用，這可能是由于發(fā)酵系統(tǒng)中AGF的存活率較低，提示在利用AGF 開發(fā)飼料的過程中，研究優(yōu)化培養(yǎng)和工藝的重要性。

除飼料開發(fā)外，AGF也可以作為飼料添加劑提升反芻動物健康水平。Piromycessp. FNG5 菌株對反芻動物的益處早在2004年就被證實，其在瘤胃中降解纖維、提高有機物和纖維全腸道消化率的效果也讓人們相信AGF 在飼料添加劑領(lǐng)域具有極大的潛力。但就目前而言，市面上較少甚至沒有真正意義上的AGF飼料添加劑，其原因可能是由于AGF 對氧氣高度敏感，需要人工采用極其迅速的方式令其抵達瘤胃，現(xiàn)階段的方法（瘤胃插管、混拌后立即飼喂等）僅限于科學(xué)研究，很難大規(guī)模使用。當(dāng)然，也可以采取封裝的方式來降低AGF 與氧氣的接觸，以提高AGF 的存活率，Paul 等（2004）設(shè)計并封裝了Neocallimaastixsp. CF-17，從而減少氧氣對菌體的損害，成功地提高了水牛的生產(chǎn)性能，但封裝的最佳效果只能持續(xù)12 h。雖然使用AGF 作為飼料添加劑工作量巨大且難以規(guī)?；褂?，但AGF 仍然是一個未經(jīng)大規(guī)模開發(fā)的寶庫，且大多數(shù)可應(yīng)用的AGF 菌來源于草食動物胃腸道中未馴化的菌種，因此野生反芻動物體內(nèi)的AGF是一個十分有價值的益生菌庫，或許存在著對氧氣具有抗性且極具利用價值的菌種。

4 總結(jié)與展望

盡管AGF 進入人們的視野已經(jīng)有百年之久，但受限于技術(shù)水平，直到20 世紀70 年代人們才對AGF有了較為正確的認識，且AGF的高度氧敏感性也使得人們對于AGF 的研究進展遠落后于需氧真菌。近幾年來，特別是2020年以來，被分離并鑒定的AGF數(shù)量急速增加，體現(xiàn)出人們越來越重視AGF重要的應(yīng)用潛力。當(dāng)前，AGF 主要在甲烷生產(chǎn)、飼料處理及提升動物健康中表現(xiàn)出巨大潛力。在甲烷生產(chǎn)方面，AGF與產(chǎn)甲烷菌復(fù)雜的互作關(guān)系可以有效提升甲烷的生產(chǎn)效率，且利用AGF處理發(fā)酵原料是一種對環(huán)境友好的辦法，符合國家可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略。但AGF與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)還存在著許多制約：首先，AGF與產(chǎn)甲烷菌的具體協(xié)作關(guān)系并不十分明確，其具體的互作機制還有待更深入的研究；此外，AGF 與產(chǎn)甲烷菌的種類繁多，挑選出優(yōu)秀的AGF與產(chǎn)甲烷菌組合對接生產(chǎn)，以提升甲烷生產(chǎn)效率還需要不斷分離與驗證。在飼料處理與動物健康提升方面，已經(jīng)有許多學(xué)者證明AGF能夠有效地促進動物的健康養(yǎng)殖、提升飼料利用率，但受限于AGF 高度厭氧的生理特性，導(dǎo)致很少有報道將AGF 真正應(yīng)用于大規(guī)模實際生產(chǎn)之中，AGF封裝技術(shù)或可成為解決其高度厭氧導(dǎo)致難以利用的一個突破口。

就現(xiàn)階段的研究來看，AGF 的應(yīng)用潛力雖然巨大，但其高度厭氧的特性也使我們距AGF的大規(guī)模應(yīng)用仍有很長的路需要探索。對AGF的研究，無論是前文提及的篩選鑒定或是生理機制研究，都要以分離培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)。然而，現(xiàn)今人們對AGF的分離培養(yǎng)技術(shù)尚停留在較為原始的技術(shù)方法，這或許也是雖然AGF 在自然界中存在的數(shù)量、種類繁多，但能為人們所知曉的卻十分稀少的原因之一。因此，推陳出新優(yōu)化并制定出行之有效的分離培養(yǎng)方案，或成為了探索AGF 奧秘的首要任務(wù)。近些年來，雖然人們已經(jīng)對AGF 的進化、生物學(xué)特性，以及生態(tài)學(xué)領(lǐng)域方面均有了進一步了解，但諸如AGF為何高度厭氧？AGF為何能夠產(chǎn)生獨有的纖維小體等？這些疑問讓我們認識到人們對于AGF的了解仍然僅是冰山一角，但或許這些問題的答案在未來被揭曉時，AGF分離培養(yǎng)等方面的技術(shù)難題便能夠真正被破解，進而使得AGF真正體現(xiàn)出其巨大的應(yīng)用價值。