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    STAT5A在彌漫大B細胞淋巴瘤耐藥中的意義

    2022-02-01 03:31:08吉莉莉張邢松繆小兵
    臨床與實驗病理學雜志 2022年12期
    關(guān)鍵詞:比星結(jié)構(gòu)域磷酸化

    吉莉莉,張邢松,何 松,繆小兵

    彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是淋巴瘤中最常見的亞型,約占非霍奇金淋巴瘤的40%[1]。目前,R-CHOP(利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松)是DLBCL的一線治療方案,但仍有相當一部分患者緩解后復發(fā)或原發(fā)耐藥[2]。信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)家族由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B以及STAT6共7個成員組成。STAT5A表達異常已被證實與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本組前期實驗發(fā)現(xiàn),STAT5核表達及pSTAT5AY694表達與DLBCL的治療反應相關(guān);STAT5核陽性、pSTAT5AY694陽性患者比陰性患者的總生存期縮短[3],但STAT5A在DLBCL中的作用機制仍不清楚。本實驗旨在探討STAT5A在DLBCL耐藥中的作用及機制。

    1 材料與方法

    1.1 細胞株人DLBCL細胞OCI-Ly8由復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院周曉燕教授惠贈,OCI-Ly10細胞購自南京科佰生物公司。OCI-Ly8、OCI-Ly10細胞分別培養(yǎng)于含10%、20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。

    1.2 主要試劑STAT5A抗體(稀釋比1 ∶500)購自武漢Proteintech公司(貨號13179-1-AP),GAPDH抗體(稀釋比1 ∶5 000)購自武漢Proteintech公司(貨號HRP-60004),Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)抗體(稀釋比1 ∶10 000)購自美國Jackson ImmunoResearch Laboratories公司(貨號111-035-003),CCK-8檢測試劑盒購自上海東仁公司,多柔比星(Doxo)購自美國Sigma-Aldrich公司,臺盼藍拒染試劑盒購自上海碧云天公司,凋亡抗體芯片(proteome profiler human apoptosis array kit, ARY009)購自美國R&D Systems公司。

    1.3 慢病毒感染及篩選STAT5A過表達/干擾慢病毒以及對照慢病毒購自上海吉凱基因公司。慢病毒感染按試劑盒說明書進行。感染完成后,以2 μg/mL的嘌呤霉素對細胞進行篩選,從而獲得STAT5A穩(wěn)定過表達(STAT5AOE)、穩(wěn)定敲低(shSTAT5A)或?qū)φ占毎?Ctrl/shCtrl)。

    1.4 Western blot法收集STAT5AOE、shSTAT5A或?qū)φ占毎呀夂笮蠸DS-PAGE凝膠電泳,PVDF膜轉(zhuǎn)印后用含5%脫脂奶粉的PBST封閉2 h,加入STAT5A一抗4 ℃孵育過夜,PBST洗滌3次后使用Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)二抗室溫孵育2 h,PBST洗滌3次后ECL液顯影。

    1.5 CCK-8細胞活性檢測將STAT5AOE及對照細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中(每孔100 μL),每組設置5個復孔,并設Blank對照(只加培養(yǎng)基不接種細胞),使用不同濃度Doxo(0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L)刺激細胞,刺激完成后每孔加入10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)1 h,取出培養(yǎng)板,用酶標儀測定450 nm處的吸光度值。

    1.6 臺盼藍拒染實驗將STAT5AOE、shSTAT5A或?qū)φ占毎褂?.0 μmol/L Doxo刺激72 h,刺激完成后收集細胞,PBS洗滌并重懸于PBS中;將10 μL細胞懸液與10 μL 0.4%臺盼藍溶液混合,室溫孵育1 min。使用血球計數(shù)板計數(shù)活細胞以及死亡細胞數(shù)目,細胞死亡比例(%)=死亡細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)+死亡細胞總數(shù))×100%。

    1.7 凋亡抗體芯片分析依據(jù)R&D Systems公司Proteome profiler human apoptosis array kit(ARY009)操作說明書完成抗體芯片檢測。

    2 結(jié)果

    2.1 過表達STAT5A對OCI-Ly8及OCI-Ly10細胞Doxo敏感性的影響Western blot實驗結(jié)果顯示:與對照組(Ctrl)相比,STAT5A蛋白表達水平在STAT5AOE組中顯著上調(diào)(圖1)。CCK-8實驗發(fā)現(xiàn):在OCI-Ly8細胞中STAT5AOE組與Ctrl組IC50相比:1.334 μmol/L(95%CI=1.205~1.476)vs0.714 5 μmol/L(95%CI=0.625 8~0.815 8)(圖2A);在OCI-Ly10細胞中STAT5AOE組與Ctrl組IC50相比:1.232 μmol/L(95%CI=1.027~1.478)vs0.780 7 μmol/L(95%CI=0.701 4~0.869 0)(圖2B);提示過表達STAT5A可降低OCI-Ly8及OCI-Ly10細胞對Doxo的敏感性。臺盼藍拒染實驗顯示:在OCI-Ly8細胞中Ctrl組與STAT5AOE組細胞死亡比例:(13.0±1.4)%vs(7.9±1.8)%(t=3.89,P=0.018),Ctrl+Doxo組與STAT5AOE+Doxo組細胞死亡比例:(58.9±1.4)%vs(44.4±5.5)%(t=4.46,P=0.011,圖3A),提示在OCI-Ly8細胞中過表達STAT5A可降低Doxo刺激/未刺激狀態(tài)下的細胞死亡;與之相似,在OCI-Ly10細胞中Ctrl組與STAT5AOE組細胞死亡比例:(15.7±2.8)%vs(9.7±2.6)%(t=2.94,P=0.042),Ctrl+Doxo組與STAT5AOE+Doxo組細胞死亡比例:(53.9±3.5)%vs(34.8±4.6)%(t=5.80,P=0.004,圖3B),提示在OCI-Ly10細胞中過表達STAT5A可降低Doxo刺激/未刺激狀態(tài)下的細胞死亡。上述研究表明,過表達STAT5A可抑制Doxo誘導的細胞死亡,介導細胞耐藥性的產(chǎn)生。

    圖1 Western blot法檢測Ctrl以及STAT5AOE細胞中STAT5A蛋白表達水平:A.OCI-Ly8細胞;B.OCI-Ly10細胞

    圖2 CCK-8法檢測Ctrl以及STAT5AOE細胞對多柔比星的敏感性:A.OCI-Ly8細胞;B.OCI-Ly10細胞

    圖3 臺盼藍拒染法檢測過表達STAT5A后彌漫大B細胞瘤細胞對Doxo敏感性的影響:A.OCI-Ly8細胞;B.OCI-Ly10細胞;Untreated.未使用多柔比星刺激;Doxo. 1.0 μmol/L多柔比星刺激;*P<0.05,**P<0.01

    2.2 敲低STAT5A后OCI-Ly8、OCI-Ly10細胞對Doxo敏感性的影響Western blot證實:與對照組(shCtrl)相比,STAT5A蛋白表達水平在shSTAT5A組中顯著下調(diào)(圖4)。臺盼藍拒染實驗顯示:在OCI-Ly8細胞中shCtrl組與shSTAT5A組細胞死亡比例:(12.4±2.0)%vs(17.9±2.6)%(t=2.90,P=0.044),shCtrl+Doxo組與shSTAT5A+Doxo組細胞死亡比例:(51.8±6.1)%vs(67.7±6.5)%(t=3.10,P=0.036,圖5A);與之相似,在OCI-Ly10細胞中shCtrl組與shSTAT5A組細胞死亡比例:(12.1±1.7)%vs(20.0±4.6)%(t=2.82,P=0.048),shCtrl+Doxo組與shSTAT5A+Doxo組細胞死亡比例:(53.7±6.2)%vs(68.1±3.2)%(t=3.56,P=0.024,圖5B),提示在OCI-Ly10細胞中敲低STAT5A同樣可增加Doxo刺激/未刺激狀態(tài)下的細胞死亡。上述研究表明,敲低STAT5A可促進Doxo誘導的細胞死亡,增強Doxo的敏感性。

    圖4 Western blot法檢測shCtrl以及shSTAT5A細胞中STAT5A蛋白表達水平:A.OCI-Ly8細胞;B.OCI-Ly10細胞

    圖5 臺盼藍拒染法檢測敲低STAT5A后彌漫大B細胞瘤細胞對Doxo敏感性的影響:A.OCI-Ly8細胞;B.OCI-Ly10細胞;shCtrl.對照細胞;shSTAT5A.STAT5A穩(wěn)定敲低細胞;Untreated.未使用多柔比星刺激;Doxo.1.0 μmol/L多柔比星刺激;*P<0.05

    2.3 STAT5AOE對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響凋亡抗體芯片分析發(fā)現(xiàn):在OCI-Ly8以及OCI-Ly10細胞中,p53(pS46)[磷酸化p53(Ser46)]、p53(pS392)[磷酸化p53(Ser392)]的表達在STAT5AOE組以及Ctrl組之間差異最明顯:STAT5AOE組p53(pS46)、p53(pS392)表達水平比Ctrl組降低(圖6)。上述研究提示,在OCI-Ly8以及OCI-Ly10細胞中STAT5AOE可能通過降低p53(pS46)以及p53(pS392)的表達水平抑制細胞凋亡。

    圖6 凋亡抗體芯片分析Ctrl以及STAT5AOE細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達水平:A.OCI-Ly8細胞;B.OCI-Ly10細胞;抗體芯片陣列D9、D10代表Phospho-p53(S46)[p53(pS46)],D11、D12代表Phospho-p53(S392)[p53(pS392)]

    3 討論

    DLBCL是一類高度異質(zhì)性疾病,在生物學行為、組織病理學以及臨床特征等多方面存在明顯差異。近20年來,R-CHOP是多數(shù)未經(jīng)治療DLBCL患者的標準治療方案,但仍有高達40%患者出現(xiàn)難治或完全緩解后復發(fā),這部分患者預后較差。DLBCL耐藥的形成包括遺傳和(或)表觀遺傳修飾,浸潤性免疫細胞和腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細胞改變腫瘤免疫環(huán)境提供凋亡保護等[4]。JAK-STAT信號通路主要由酪氨酸激酶相關(guān)受體、Janus激酶(Janus kinase, JAK)和STAT三個部分組成,參與免疫反應、細胞增殖、分化等過程。未被激活的STAT以失活狀態(tài)存在于胞質(zhì)中。STAT的激活通常由細胞表面受體上的配體結(jié)合啟動,隨后保守的酪氨酸殘基發(fā)生激酶依賴性磷酸化,STAT隨后以二聚體和(或)四聚體的形式快速轉(zhuǎn)位到細胞核,并調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄[5-6]。STAT5A和STAT5B是STAT5高度同源的兩個亞型。STAT5含N端結(jié)構(gòu)域、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Src同源2結(jié)構(gòu)域以及C端反式激活結(jié)構(gòu)域等功能域?,F(xiàn)已證實,STAT5異常活化與乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[7-8]。有研究表明,STAT5組成性激活在多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病中起重要作用,如外周T細胞淋巴瘤[9]、BCR-ABL陽性慢性粒細胞白血病[10]。本組前期研究顯示:STAT5核表達以及pSTAT5AY694表達與DLBCL患者的治療反應有關(guān),其在疾病進展/疾病穩(wěn)定患者中的表達高于部分緩解/完全緩解患者,且STAT5核陽性、pSTAT5AY694陽性DLBCL患者比陰性患者的總生存期縮短[3],但STAT5A在DLBCL中的具體作用機制尚不清楚。有文獻報道,STAT5A在Doxo耐藥細胞系和化療耐藥患者中的表達水平較高,STAT5A通過調(diào)節(jié)ABCB1的轉(zhuǎn)錄促進乳腺癌細胞對Doxo的耐藥性;而利用STAT5抑制劑pimozide抑制STAT5A-ABCB1信號通路,可增強耐藥乳腺癌細胞對Doxo的敏感性[11]。Kosova等[12]報道,敲低STAT5A表達可增強伊馬替尼敏感和耐藥慢性粒細胞白血病K562細胞對伊馬替尼的敏感性。本實驗發(fā)現(xiàn),在OCI-Ly8和OCI-Ly10細胞中STAT5AOE可降低Doxo刺激/未刺激狀態(tài)下的細胞死亡;而shSTAT5A可增加Doxo刺激/未刺激狀態(tài)下的細胞死亡,提示過表達STAT5A可抑制Doxo誘導的細胞死亡,介導耐藥性的產(chǎn)生。

    p53是多種應激狀態(tài)下調(diào)節(jié)細胞凋亡的關(guān)鍵因子。p53可通過兩種機制誘導細胞凋亡:(1)p53可作為轉(zhuǎn)錄因子誘導促凋亡靶基因表達,并抑制抗凋亡靶基因表達;(2)p53轉(zhuǎn)移到線粒體可與BCL-2家族成員相互作用,誘導膜通透性和細胞色素C釋放[13]。p53的磷酸化修飾可以發(fā)生在p53的多個氨基酸殘基上,p53包含38個絲氨酸殘基和22個蘇氨酸殘基。文獻報道p53的46位絲氨酸發(fā)生磷酸化后獲得轉(zhuǎn)錄活性,可通過靶向調(diào)控p53調(diào)節(jié)凋亡誘導蛋白1(p53 regulated apoptosis inducing protein 1, p53AIP1)促進細胞色素C的釋放,繼而誘導細胞凋亡[14]。Castrogiovanni等[13]報道,p53的392位絲氨酸磷酸化可調(diào)節(jié)p53線粒體易位和轉(zhuǎn)錄非依賴性凋亡。本組通過凋亡抗體芯片分析發(fā)現(xiàn),在OCI-Ly8和OCI-Ly10細胞中p53(pS46)、p53(pS392)的表達在STAT5AOE組以及Ctrl組之間差異最明顯:STAT5AOE組p53(pS46)以及p53(pS392)表達水平比Ctrl組降低;提示在OCI-Ly8和OCI-Ly10細胞中STAT5AOE可能通過降低p53(pS46)和p53(pS392)的表達抑制細胞凋亡,繼而誘導耐藥性的產(chǎn)生。

    綜上所述,STAT5A高表達可降低DLBCL細胞對Doxo的敏感性,STAT5A可能通過降低p53(pS46)以及p53(pS392)的表達水平抑制細胞凋亡,繼而誘導耐藥性的產(chǎn)生。上述結(jié)論是否成立,還需體內(nèi)實驗進一步驗證。

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