艾比湖微生物多樣性及其功能分析?

地麗胡瑪·阿吉，常娜娜，杜菲，馬正海

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830017)

0 引言

艾比湖位于中國新疆博爾塔拉蒙古自治州，是新疆最大的咸水湖，也是準(zhǔn)噶爾盆地西部最低匯水中心，山地降水和高山融雪是其主要水源[1]．湖泊微生物是其水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是了解并有效解決艾比湖生態(tài)問題的重要參與者．受地理條件、氣候因素和人類活動等因素影響，艾比湖湖區(qū)面積正逐步縮小，形成極端干鹽湖．艾比湖獨特的生態(tài)和理化特性使得其湖水中蘊藏著極為豐富的微生物資源，邵冠軍[2]從艾比湖湖底沉積物中獲得了多種新的放線菌和古菌，韓晶等[3]報道了艾比湖湖區(qū)土壤微生物的多樣性．同時，艾比湖湖面積動態(tài)性變化引發(fā)的生態(tài)系統(tǒng)演替也將導(dǎo)致艾比湖微生物群落的變化以及部分珍稀微生物種類的消失．湖泊微生物多樣性雖然受到越來越多的關(guān)注，但是目前大多數(shù)研究主要集中在土壤和沉積物，而針對艾比湖水體微生物宏基因的研究十分有限．本文通過宏基因組學(xué)技術(shù)對艾比湖水體微生物種類、豐度及其功能進(jìn)行分析，以期為探明和挖掘艾比湖微生物資源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 采樣方法

于2017年10月采集艾比湖表層水樣，根據(jù)水域結(jié)構(gòu)選取6個采樣點（圖1），每個樣點于1～2 m深度采集500 mL水樣，之后混合為3 L．樣品置于-20℃便攜式冰箱保存，當(dāng)天運回，三層滅菌紗布過濾除去顆粒雜質(zhì)，300 r/min離心10 min以除去細(xì)小顆粒雜質(zhì)，10 000 g離心30 min收集微生物，于-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

圖1 艾比湖水樣采集點

1.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增

微生物沉淀經(jīng)CTAB法提取總DNA，瓊脂糖凝膠電泳和Qubit 2.0熒光定量儀檢測DNA的純度和濃度，DNA稀釋至1 ng/μL．此DNA為模板，以細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)通用引物341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）[4]以及真菌18S rRNA ITS1通用引物ITS5-1737F（5’-GGAAGTA AAAGTCGTAACAAGG-3’）和ITS2-2043R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）[5]分別進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收PCR產(chǎn)物．

1.3 文庫構(gòu)建和上機測序

使用Thermo fisher的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 2.0熒光定量儀定量和文庫檢測合格后，用Illumina HiSeq測序平臺測序．文庫構(gòu)建和測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成．

1.4 測序數(shù)據(jù)處理及分析

測序后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計優(yōu)化和樣品復(fù)雜度分析，對操作分類單元（Operational Taxonomic Unit,OTU）代表序列在不同分類水平上進(jìn)行物種注釋．根據(jù)注釋結(jié)果，在門、屬分類水平對微生物種類及相對豐度進(jìn)行分析．為探究艾比湖微生物的代謝功能，利用PICRUSt軟件和KEGG數(shù)據(jù)庫預(yù)測宏基因組測序數(shù)據(jù)的功能基因組成．

2 結(jié)果與分析

2.1 宏基因組測序結(jié)果

共獲得細(xì)菌16S rRNA序列84 431條，質(zhì)控后有效序列80 290條，97%的序列一致性可聚類為486個OTUs；獲得真菌ITS序列81 111條，質(zhì)控后有效序列80 117條，可聚類為391個OTUs（見表1）．

表1 艾比湖水樣宏基因組測序結(jié)果

2.2 艾比湖微生物群落組成分析

艾比湖水樣細(xì)菌OTUs分屬25個門158個屬．菌門種類及其相對豐度如圖2A所示，其中：相對豐度較高的菌門包括變形菌門（Proteobacteria，66.18%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，24.58%）、放線菌門（Actinobacteria，3.64%）、厚壁菌門（Firmicutes，2.43%），低豐度菌門包括棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、帕庫菌門（Parcubacteria）、SR1-(Absconditabacteria)、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、纖細(xì)菌門（Gracilibacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、綠菌門（Chlorobi）、螺旋體門（Spirochaetes）、異域菌門（Peregrinibacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、糖分菌門（Saccharibacteria）、熱袍菌門（Thermotogae）、綠彎菌門（Chloroflexi）、WS6、海微菌門（Marinimicrobia）、TM6-（Dependentiae）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）、酸桿菌門（Acidobacteria）、貝克爾菌門（Berkelbacteria）．屬分類水平的結(jié)果如圖2B所示，相對豐度較高的菌屬包括玫瑰變色菌屬（Roseovarius，20.25%）、鹽單胞菌屬（Halomonas，17.24%）、嗜冷彎菌屬（Psychroflexus，6.63%）、海命菌屬（Marivita，3.62%）、紅桿菌屬（Rhodobacteraceae，2.52%）、Pontimonas（2%）、梭菌屬（Fusibacter，1.51%）、洛克氏菌屬（Loktanella，1.13%），低豐度菌屬包括海桿菌屬（Marinobacter）、絲硫細(xì)菌屬（Thiothrix）、弧菌屬（Vibrio）、鹽礦單胞菌屬（Salinarimonas）等．

圖2 艾比湖微生物群落組成

艾比湖水樣真菌OTUs分屬6個門94個屬．真菌門分類的結(jié)果如圖2C所示，其中擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和子囊菌門（Ascomycota）相對豐度較高，分別為52.71%和45.61%，另外還包括壺菌門（Chytridiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、球能菌門（Glomeromycota）和新麗鞭毛菌門（Neocallimastigomycota）．屬分類水平如圖2D所示，相對豐度較高的真菌屬包括芽枝孢屬（Cladosporium，18.20%）、散尾鬼筆屬（Lysurus，14.47%）、隱球菌屬（Cryptococcus，5.66%）、鏈格孢屬（Alternaria，5.65%）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wal lemia，2.86%）和赤霉菌屬（Gibberella，1.31%），低豐度菌屬包括紅酵母屬（Rhodotorula）、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）、曲霉菌屬（Aspergillus）、線黑粉菌屬（Filobasidium）等．

2.3 艾比湖嗜鹽和耐鹽微生物組成分析

基于上述艾比湖微生物組成系統(tǒng)挖掘其中的嗜鹽菌，嗜鹽細(xì)菌為21個屬，相對豐度較高的嗜鹽細(xì)菌包括變形菌門所屬的玫瑰變色菌屬、鹽單胞菌屬和海命菌屬，放線菌門所屬的Pontimonas，擬桿菌門所屬的冷彎菌屬，厚壁菌門所屬的梭菌屬；嗜鹽真菌為12個屬，主要集中于子囊菌門，相對豐度較高的為該門所屬的芽枝孢屬和鏈格孢屬（表2）．

表2 艾比湖中的嗜鹽微生物

2.4 艾比湖菌群功能的預(yù)測分析

使用PICRUSt軟件預(yù)測艾比湖菌群的功能基因，KEGG通路分析結(jié)果如圖3所示．總體而言，與細(xì)菌生長相關(guān)的各類代謝以及遺傳信息處理、信號傳遞和細(xì)胞生長等功能基因豐度均較高．通路內(nèi)的細(xì)化分析表明：遺傳信息處理通路中翻譯（40.9%）以及復(fù)制與修復(fù)（30.67%）相關(guān)基因相對豐度較高，在環(huán)境信息處理通路中膜運輸（60%）相關(guān)基因豐度最高，在注釋到的11類代謝通路中，相對豐度較高的包括氨基酸代謝（20.33%）、碳水化合物代謝（19.04%）和能量代謝（14.27%）相關(guān)基因，以上結(jié)果說明艾比湖菌群生長旺盛．在代謝通路分析中，發(fā)現(xiàn)艾比湖菌群含有3.4%異源生物降解與代謝相關(guān)的基因（圖4），為探討艾比湖污染狀況以及微生物在修復(fù)水環(huán)境中的功能，繼而對菌群碳水化合物代謝和異源生物降解與代謝相關(guān)功能基因進(jìn)行了細(xì)化分析．圖4A顯示了碳水化合物代謝相關(guān)基因的相對豐度，其中丙酮酸代謝、甘酸酯與二甲酸酯代謝、糖酵解、三羧酸循環(huán)、氨基糖和核苷酸糖代謝、丙烷酸酯代謝、丁酸桂酯代謝相關(guān)基因的豐度較高，另外還包括淀粉和蔗糖代謝、抗血酸和阿爾達(dá)酸鹽代謝、肌醇磷酸代謝等碳水化合物代謝途徑相關(guān)基因．圖4B顯示了異源生物降解與代謝途徑相對功能基因的豐度，其中苯甲酸降解、藥物代謝、氯烷烴和氯烯烴降解、氨基苯甲酸降解、苯乙烯降解、己內(nèi)酰胺降解、藥物代謝-細(xì)胞色素P450相關(guān)基因的相對豐度均較高，除此之外，還包括甲苯、萘、多環(huán)芳烴、二噁英、氯環(huán)己烷和氯苯等有機化合物降解相關(guān)的基因．

圖3 基于KEGG次級代謝通路基因注釋結(jié)果

圖4 基于KEGG分析碳水化合物代謝（A）和環(huán)境異源生物降解（B）相關(guān)功能基因的分類及豐度

3 討論與結(jié)論

不同類型的鹽湖中含有豐富多樣的微生物資源，探究其群落組成及功能是開發(fā)和利用湖泊微生物資源的前提[6]．利用宏基因組學(xué)方法對水環(huán)境微生物總DNA進(jìn)行高通量測序和生物信息學(xué)分析可全面了解微生物組成、多樣性以及潛在的功能基因，目前已廣泛用于各類水環(huán)境微生物多樣性和生態(tài)質(zhì)量評價的研究[7]．本文利用宏基因組學(xué)方法對艾比湖水樣微生物多樣性進(jìn)行分析，共注釋到細(xì)菌OTU 486個，分屬25門、43綱、73目、127科、158屬；注釋到真菌OTU 391個，分屬6門、22綱、51目、82科、94屬（表1）．以上結(jié)果說明艾比湖富含豐富多樣的細(xì)菌和真菌，且細(xì)菌的多樣性明顯高于真菌，前期也有多項研究表明湖水中細(xì)菌的多樣性高于真菌[8]，說明細(xì)菌適應(yīng)各類水環(huán)境的能力高于真菌．

細(xì)菌多樣性方面，在門分類階元豐度最高的為變形菌和擬桿菌，這兩個菌門均廣泛棲息于各類環(huán)境中，具有富集酸性氨基酸、水解纖維素和有機化合物礦化等功能；其次為放線菌和厚壁菌，兩者均具有重要的生態(tài)功能，在維持水質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用（圖2A）．據(jù)報道變形菌、擬桿菌、酸桿菌和放線菌等是鹽湖的主要菌群[9]，但各類鹽湖菌群組成隨鹽離子種類及水質(zhì)等特性不同而呈現(xiàn)差異，如花馬鹽湖以變形菌、擬桿菌和厚壁菌為優(yōu)勢菌群[10]，青藏高原鹽水湖阿翁錯以變形菌、放線菌和厚壁菌為優(yōu)勢菌群[11]．本文研究顯示艾比湖中放線菌的相對豐度（3.64%）高于艾丁湖[12]及茶卡鹽湖[13]．通常富含鉀鹽及pH偏堿性的鹽湖中放線菌門含量較高，據(jù)報道艾比湖湖底沉積物偏堿性且富含鉀離子，其中含有豐富的放線菌[2]，湖區(qū)周邊濕地及土壤同樣偏堿性[14]，故艾比湖沉積物和周邊濕地中蘊含的放線菌進(jìn)入湖水使得其豐度增高．在屬分類階元豐度較高的菌屬包括玫瑰變色菌、鹽單胞菌、嗜冷彎菌、海命菌、紅桿菌和Pontimonas等（圖2B），與許多鹽湖的菌群組成有明顯差異，如花馬鹽湖鹵水中的細(xì)菌以乳球菌屬、假單胞菌屬和螺桿菌屬為主[15]．艾比湖屬于極端咸水湖，水體理化性質(zhì)與海洋相似，分析表明其中蘊含的一些菌屬為海洋富含菌，如玫瑰變色菌屬廣泛分布于極地海洋，約占海洋浮游細(xì)菌群落的15%～25%[16]，該菌屬也存在于一些高鹽湖泊和土壤中[17]，海命菌存在于深海沉積物中，低豐度的海桿菌亦存在于海水中．另一些為新疆多個鹽湖共有的菌屬，如鹽單胞菌在新疆達(dá)坂城鹽湖、巴里坤湖和羅布泊鹽湖中均具有較高豐度，其對溫度、鹽度和溶解氧的適應(yīng)范圍廣，具有很強的適應(yīng)能力．還有一些菌屬和艾比湖特殊的環(huán)境有關(guān)，如嗜冷彎菌主要存在于海冰等寒冷環(huán)境[18]，其在艾比湖的相對豐度達(dá)到6.63%，可能是周邊山區(qū)冰雪中存在該菌并隨冰雪融化注入艾比湖，本文于秋末采樣，低水溫也將促使該菌相對豐度的增加．此外，艾比湖還存在Pontimonas、洛克氏菌等多種特色菌屬．

真菌多樣性方面，門分類階元主要包括擔(dān)子菌、子囊菌和壺菌（圖2C）．屬分類階元包括芽枝孢、散尾鬼筆、隱球菌、鏈格孢和節(jié)擔(dān)菌等高豐度菌，以及葡萄穗霉等低豐度菌（圖2D），其中散尾鬼筆、隱球菌和赤霉菌等菌屬在其它水體環(huán)境中很少發(fā)現(xiàn)．鹽湖等水環(huán)境中的真菌群落組成隨環(huán)境差異而不同[19]，如內(nèi)蒙古鄂爾多斯一古鹽湖中曲霉屬為優(yōu)勢菌[20]，海南?？跍厝獌?yōu)勢真菌為輪枝菌屬[21]，程海湖水體和底泥中的優(yōu)勢真菌為枝孢菌屬和青霉菌屬[22]，艾比湖特有的真菌組成及多樣性與其水環(huán)境的特性有關(guān)．

艾比湖微生物組成中包含大量嗜鹽和耐鹽菌，包括21個嗜鹽細(xì)菌屬和12個嗜鹽真菌屬（表2）．其中大多菌屬在其它高鹽環(huán)境中已見報道，如鹽單胞菌屬、螺桿菌屬、島桿菌屬等廣泛存在于海洋、鹽場等高鹽水環(huán)境中，具有較高的NaCl耐受性[23?24]，青霉菌和曲霉菌存在于菲律賓海盆沉積物中，具高度耐鹽性[25]，鐮刀霉菌、鏈格孢在高鹽土壤中分布廣泛[26]．相對豐度較高的嗜鹽細(xì)菌包括變形菌門所屬的玫瑰變色菌、鹽單胞菌和海命菌，放線菌門所屬的Pontimonas，擬桿菌門所屬的冷彎菌，厚壁菌門所屬的梭菌；嗜鹽真菌主要集中于子囊菌門，相對豐度較高的為該門所屬的芽枝孢和鏈格孢．以上嗜鹽菌是適應(yīng)艾比湖極端鹽堿環(huán)境的產(chǎn)物，也是具有潛在應(yīng)用價值的微生物資源，包括海桿菌、紡錘桿菌等在內(nèi)的嗜鹽細(xì)菌能降解芳香酸污染物[27?28]，島桿菌、弧菌可以作為水環(huán)境金屬污染的指示菌[29]，青霉菌、鐮刀霉菌、曲霉菌等嗜鹽菌能有效降解烴類化合物和木質(zhì)素[30?31]，以上嗜鹽微生物在艾比湖環(huán)境修復(fù)中亦可發(fā)揮重要作用．

基于KEGG數(shù)據(jù)庫預(yù)測功能基因表明（圖3），與細(xì)菌生長相關(guān)的各類代謝以及遺傳信息處理、信號傳遞和細(xì)胞生長等功能基因豐度均較高，說明水庫中細(xì)菌生長旺盛．碳水化合物代謝相關(guān)功能基因分析表明（圖4A），艾比湖菌群富含多種碳水化合物代謝通路的功能基因，其中丙酮酸代謝、三羧酸循環(huán)和糖酵解相關(guān)通路的功能基因相對豐度較高，提示艾比湖菌群糖代謝以有氧代謝為主，并可利用多種碳源．分析異源生物降解相關(guān)功能基因表明（圖4B），苯甲酸、氯烷烴和氯烯烴、氨基苯甲酸、苯乙烯、己內(nèi)酰胺等降解代謝相關(guān)功能基因在艾比湖菌群中的相對豐度均較高，由于細(xì)菌對環(huán)境異源生物具有趨化性，即細(xì)菌感應(yīng)、趨向（或趨離）并降解環(huán)境污染物的特性，故環(huán)境污染物含量和菌群降解污染物功能基因的含量呈正相關(guān)．就本文而言，艾比湖菌群富含芳香族和有機氯等化合物降解相關(guān)基因，說明艾比湖存在相應(yīng)污染．據(jù)報道，多種細(xì)菌能有效降解各類污染物，其中艾比湖中含有的放線菌、弧菌、玫瑰桿菌[32?33]等均可趨向和降解污染物，在污染物的生物修復(fù)中可能發(fā)揮重要作用．