膽囊收縮素A型受體基因序列變異和表達(dá)與略陽烏雞飼料轉(zhuǎn)化率的關(guān)聯(lián)性研究

王哲鵬，周雯馨，賀俊錫，虎巧燕，趙家悅

膽囊收縮素A型受體基因序列變異和表達(dá)與略陽烏雞飼料轉(zhuǎn)化率的關(guān)聯(lián)性研究

王哲鵬，周雯馨，賀俊錫，虎巧燕，趙家悅

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100

【背景】食欲和飼料轉(zhuǎn)化率的提高構(gòu)成了現(xiàn)代肉雞快速生長的生理基礎(chǔ)。膽囊收縮素A型受體（CCKAR）是介導(dǎo)膽囊收縮素（CCK）飽食信號(hào)和消化調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵受體。鑒于CCK信號(hào)在能量平衡調(diào)節(jié)中的重要作用，CCKAR的表達(dá)水平與雞的生長性能密切相關(guān)。然而，CCKAR水平調(diào)節(jié)雞生長的確切機(jī)制尚不清楚。【目的】通過研究闡明CCKAR基因表達(dá)水平和序列變異與雞飼料轉(zhuǎn)化率的關(guān)系，為雞生長性狀遺傳調(diào)控研究和飼料轉(zhuǎn)化率選育奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā繙y定略陽烏雞12—16周齡料肉比（公雞n=62，母雞n=67）和26—30周齡料蛋比（n=150）。用PCR-RFLP法檢測CCKAR基因內(nèi)兩個(gè)同義突變（g.73206714T＞C和g.73209189C＞T）的基因型。以性別為固定效應(yīng)，用雙因素方差分析檢驗(yàn)g.73206714T＞C和g.73209189C＞T與料肉比的關(guān)聯(lián)性，用單因素方差分析檢驗(yàn)2個(gè)SNP與料蛋比的關(guān)聯(lián)性。用JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測g.73206714T＞C對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生的影響。以g.73206714T＞C為標(biāo)記，選取10只雜合子（CT）公雞，用PCR-RFLP法檢測CCKAR基因在g.73206714T＞C位點(diǎn)等位基因間的表達(dá)差異。選取30只帶有采食量和料肉比記錄的公雞，用qPCR檢測CCKAR基因在下丘腦、腦垂體、胰腺、膽囊和十二指腸中的表達(dá)水平，分析CCKAR表達(dá)水平與采食量和料肉比的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】性別效應(yīng)對略陽烏雞料肉比有顯著影響（=29.44，<0.0001），公雞的料肉比（5.41±0.76）顯著低于母雞（6.62±1.00）。在兩個(gè)同義突變中，只有g(shù).73206714T＞C與料肉比顯著關(guān)聯(lián)（=8.44，=0.0004），其中，TT型的料肉比（5.18±0.63）顯著低于CC（6.37±1.1）和CT型（6.17±0.95）。CC型和CT型的料肉比無顯著差異。g.73206714T＞C與性別的互作效應(yīng)對料肉比的影響不顯著。G.73206714T＞C對28個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)有潛在影響。等位基因特異性表達(dá)試驗(yàn)顯示，T等位基因的轉(zhuǎn)錄本豐度顯著高于C等位基因，表明CCKAR在等位基因間的表達(dá)差異很可能是構(gòu)成g.73206714T＞C與料肉比關(guān)聯(lián)性的遺傳基礎(chǔ)。略陽烏雞26—30周齡的平均料蛋比為2.85±0.41。g.73206714T＞C和g.73209189C＞T的基因型效應(yīng)對料蛋比的影響均不顯著。在5個(gè)組織中，CCKAR基因在胰腺中的表達(dá)水平最高，且與采食量呈負(fù)相關(guān)（=-0.45,=0.017）。但是，在其他組織中，CCKAR的表達(dá)水平與采食量的關(guān)聯(lián)性均不顯著。對于料肉比性狀，CCKAR基因在胰腺（=-0.41，=0.03）和腦垂體（=-0.57,=0.0018）中的表達(dá)水平越高，料肉比越低。在其他組織中，這種負(fù)相關(guān)性均不顯著?！窘Y(jié)論】研究發(fā)現(xiàn)CCKAR基因表達(dá)水平上調(diào)有利于提高雞的飼料轉(zhuǎn)化率。G.73206714T＞C的T等位基因是一個(gè)與CCKAR基因高表達(dá)活性和高飼料轉(zhuǎn)化率顯著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記。

雞；生長；CCKAR；飼料轉(zhuǎn)化率；食欲

0 引言

【研究意義】鑒定影響雞飼料轉(zhuǎn)化率的候選基因?qū)μ岣唢暳系睦寐?，降低養(yǎng)殖成本，節(jié)約飼料用糧，緩解人畜爭糧的矛盾具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】膽囊收縮素（CCK）是一種主要由小腸Ⅰ型內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的肽類激素，具有誘導(dǎo)食欲調(diào)控中樞產(chǎn)生飽腹感，促進(jìn)膽囊收縮、胰酶分泌，抑制嗉囊排空、胃酸分泌、調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)等多種生理功能[1]。膽囊收縮素A型受體（CCKAR）是介導(dǎo)CCK信號(hào)的關(guān)鍵受體[2]。在人類中，CCKAR轉(zhuǎn)錄本異常剪切與肥胖和膽結(jié)石顯著關(guān)聯(lián)[3]。在大鼠中，由基因突變引起的CCKAR缺失將導(dǎo)致貪吃、肥胖和糖尿病[4]。在雞中，CCKAR基因表達(dá)下調(diào)能顯著提高生長速度[5]。CCKAR拮抗劑（對CCK與受體的結(jié)合產(chǎn)生競爭性抑制）處理能刺激食欲、提高采食量[6-7]，而CCKAR類似物處理會(huì)減少采食量[8]，表明CCKAR水平對哺乳動(dòng)物能量平衡的調(diào)節(jié)極有可能通過食欲調(diào)控途徑來實(shí)現(xiàn)。但是，CCKAR拮抗劑、CCK類似物和CCK釋放促進(jìn)劑處理并不能改變雞的采食量，而是對膽汁和胰淀粉酶的分泌、嗉囊的排空有明顯調(diào)節(jié)作用[9-10]。Covasa等發(fā)現(xiàn)CCKAR拮抗劑只有在高劑量（＞90 μg·kg-1BW）添加的情況下才能提高雞的采食量，但CCKAR拮抗劑預(yù)處理并不能有效阻斷內(nèi)源CCK誘導(dǎo)的厭食效應(yīng)[11]。這些研究對CCK信號(hào)在雞中的食欲調(diào)節(jié)作用提出質(zhì)疑，但支持CCK信號(hào)與消化液分泌、嗉囊排空等消化相關(guān)的生理活動(dòng)存在密切聯(lián)系。【本研究切入點(diǎn)】鑒于CCK信號(hào)對消化的調(diào)節(jié)作用及CCKAR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，本研究推測CCKAR水平可能通過營養(yǎng)物質(zhì)消化途徑影響雞的飼料轉(zhuǎn)化率。Xu等發(fā)現(xiàn)CCKAR在低剩余采食量組特異表達(dá)，支持CCKAR是影響雞飼料轉(zhuǎn)化率的一個(gè)候選基因[12]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】測定了略陽烏雞12—16周齡的料肉比和26—30周齡的料蛋比，檢測了CCKAR基因在下丘腦、腦垂體、胰腺、膽囊和十二指腸中的表達(dá)水平，研究了CCKAR基因表達(dá)水平及序列變異與飼料轉(zhuǎn)化率的關(guān)聯(lián)性，旨在闡明CCKAR基因遺傳差異與飼料轉(zhuǎn)化率的聯(lián)系，為從育種和CCKAR活性干預(yù)角度提高雞的飼料轉(zhuǎn)化率奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 略陽烏雞的飼養(yǎng)和飼料轉(zhuǎn)化率測定

略陽烏雞是產(chǎn)自陜西省略陽縣的地方雞種。具有類似于絲羽烏雞的真皮超黑色素（dermal hyperpigmentation）特征，是我國一種體形較大的烏雞品種[13]。由于缺乏系統(tǒng)選育，略陽烏雞在產(chǎn)蛋和生長性能方面存在較大群體變異性，表明一些調(diào)控生產(chǎn)性能的功能突變很可能處于分離狀態(tài)[14]。這為功能突變的鑒定創(chuàng)造了條件。

在略陽烏雞蛋用系育種核心群三世代41個(gè)半同胞家系中隨機(jī)選取62只公雞和67只母雞，測定料肉比。在四世代56個(gè)半同胞家系中隨機(jī)選取150只母雞，測定料蛋比。料肉比和料蛋比測定所用樣本為同一批次孵化，在同一棟雞舍飼養(yǎng)?；\養(yǎng)育雛，全價(jià)料飼喂，自由采食、飲水。育雛期采用18—22 h光照，育成期采用自然光照，產(chǎn)蛋期采用16 h恒定光照。在60 d時(shí)將雞從育雛舍轉(zhuǎn)入產(chǎn)蛋雞舍，單籠飼養(yǎng)。三世代在2019年2月25日出雛，2020年1月8日淘汰，四世代在2019年12月9日出雛，2020年12月21日淘汰。三世代雞的性別用PCR法鑒定，用5′-GTAGTCTGTGTCTTATCATAGC-3′和5′-GGT CTCTGTACTTGGCATT-3′ 引物檢測個(gè)體是否攜帶W染色，用5′-GCCATGCATGTCTAAGTAC-3′和5′-G CACAGACAGTACCATCG -3′ 擴(kuò)增18 s rRNA片段，確保PCR成功進(jìn)行[15]。

以個(gè)體為單位，測定料肉比和料蛋比。2只雞之間隔1個(gè)空籠位，避免互相采食對方的飼料。每周測定初始料重、初始體重，周末料重、周末體重和產(chǎn)蛋量，按（期末料重-初始料重）/（期末體重-初始體重）計(jì)算料肉比，按（期末料重-初始料重）/試驗(yàn)期內(nèi)產(chǎn)蛋量計(jì)算料蛋比。料肉比測定周期為12—16周齡，測定時(shí)間為2019年5月22日至2019年6月19日；料蛋比測定周期為26—30周齡，測定時(shí)間為2020年6月8日至2020年7月5日。略陽烏雞養(yǎng)殖和料肉比、料蛋比測定均在陜西略陽龍佳農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司完成。

1.2 CCKAR序列變異基因型檢測

在飼料轉(zhuǎn)化率測定結(jié)束后，翅靜脈采血0.5 mL，用ACD（血：ACD=3﹕1）抗凝。ACD的配方為0.48 g檸檬酸，1.32 g檸檬酸三鈉，1.47 g葡萄糖，用雙蒸水溶解后，定容至100 mL。取20 μL抗凝血，用Blood Genome DNA Extraction試劑盒（Takara）按試劑盒說明提取基因組DNA。用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，用NanoDrop? 2000（Thermo）分光光度計(jì)測定DNA濃度，將DNA濃度調(diào)至50 ng·μL-1備用。

g.73206714T＞C （dbSNP登錄號(hào)：rs315131298）和g.73209189C＞T（dbSNP登錄號(hào)：rs317682933）是分布位于CCKAR基因第3和第5外顯子內(nèi)的兩個(gè)同義突變。研究發(fā)現(xiàn)g.73206714T＞C和g.73209189C＞T與雞的生長速度顯著關(guān)聯(lián)[5]。本研究用PCR-RFLP法檢測這兩個(gè)SNP的基因型。PCR體系由1 μL DNA（50 ng·μL-1），0.5 μL正鏈引物（10 μmol·L-1），0.5 μL反鏈引物（10 μmol·L-1），10 μL預(yù)染2 × Taq Plus MasterMix (康為) 和8 μLddH2O組成。g.73206714T＞C位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物為5′-AGCACGGAGACC AAGACCCA-3′和5′-GCAAATGGCACTGTACCGCT -3′，g.73209189C＞T位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物為5′-ATGC TGATGGTGATAGTGGT-3′和5′-GGTGAAAGTGGC TAGAAAAC-3′。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3 min，（94℃變性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸20 s）×33個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR在伯樂T100TM熱循環(huán)儀上進(jìn)行。g.73206714T＞C擴(kuò)增產(chǎn)物用MnlI內(nèi)切酶（NEB）消化，g.73209189C＞T擴(kuò)增產(chǎn)物用MboII內(nèi)切酶（NEB）消化。消化反應(yīng)體系為1 μL 10× CutSmart Buffer, 1.5 μLPCR產(chǎn)物, 0.6 μL（3 U）內(nèi)切酶和6.4 μL ddH2O。消化條件為37℃水浴消化1 h。用3.0%（wt/vol）瓊脂糖凝膠電泳分離消化產(chǎn)物，經(jīng)0.1%（vol/vol）的溴乙錠染色，用Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)（伯樂）拍照記錄結(jié)果。電泳條件為90 V，40 min。部分PCR-RFLP基因型檢測結(jié)果用Sanger測序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 g.73206714T＞C位點(diǎn)對轉(zhuǎn)錄因子擾動(dòng)作用預(yù)測

在JASPAR（http://jaspar.genereg.net）數(shù)據(jù)庫中，選取Vertebrata門類下1 011個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，在Scan窗口提交FASTA格式序列，分別搜索T等位基因可結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子和C等位基因可結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，分析g.73206714T＞C對轉(zhuǎn)錄因子-DNA結(jié)合產(chǎn)生的潛在影響。搜索轉(zhuǎn)錄因子的Relative profile score 閾值設(shè)定為80 %。

1.4 CCKAR基因表達(dá)量檢測

在參與料肉比測定的62只公雞中隨機(jī)選取30只公雞，在16周齡宰殺，采集下丘腦、腦垂體、胰腺、膽囊和十二指腸，剪碎，置RNAstore（康為）4 ℃浸泡過夜，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。在采集膽囊時(shí)，需劃破膽囊，棄膽汁，用1×PBS緩沖液（Gibco）漂洗3次后，保存?zhèn)溆谩Ｔ诰嘤拈T約5 cm處采集十二指腸。取約100 mg組織，用1 mL TRNzol Universal 總 RNA 提取試劑（天根），按TRNzol操作說明提取總RNA。用1 %瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，用NanoDrop? 2000（Thermo）分光光度計(jì)測定RNA的濃度。取1 μg RNA，用PrimeScriptTM1st Strand cDNA synthesis試劑盒（Takara）按試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用qPCR檢測CCKAR基因在各組織中的表達(dá)量。qPCR體系為2 μL cDNA，10 μL 2×TB Green Advantage qPCR Premix （Takara）, 0.4 μL正鏈引物（10 μmol·L-1），0.4 μL 反鏈引物（10 μmol·L-1）和7.2 μL ddH2O。qPCR在LightCycler? 96 Instrument實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche）上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為95℃ 30 s,（95℃5 s, 60℃20 s 72℃ 15 s）×40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后執(zhí)行熔解曲線反應(yīng)程序，檢測qPCR的特異性，溶解曲線反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10 s，65℃ 60 s和97℃ for 1 s。LBr被用作持家基因，校正由cDNA濃度和cDNA模板加樣量差異引起的實(shí)驗(yàn)誤差。CCKAR基因擴(kuò)增引物：5′-TACAGCAAGCTGGTC CCTTT-3′和5′-AATGAAATGAGGCCATACGC-3′， LBr擴(kuò)增引物：5′-AGGGCTTCTTGTCACAGGTT-3′和5′-ATCACGAGCTTCTCGATGAACA-3′。目標(biāo)和持家基因每個(gè)樣本均執(zhí)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。用ΔCt（CtLBr- CtCCKAR）表示CCKAR基因的表達(dá)水平，即CCKAR基因表達(dá)水平越高，ΔCt值越大。

1.5 g.73206714T＞C位點(diǎn)等位基因特異性表達(dá)水平檢測

在30只采集組織樣的公雞中，有10只公雞g.73206714T＞C的基因型為CT。取10只公雞下丘腦、腦垂體、胰腺、膽囊和十二指腸cDNA，執(zhí)行RT-PCR，獲得包含g.73206714T＞C位點(diǎn)的擴(kuò)增片段。RT-PCR擴(kuò)增體系為cDNA模板2 μL，正鏈引物0.5 μL（10 μmol·L-1），反鏈引物0.5 μL（10 μmol·L-1），2× Taq MasterMix（康為）10 μL，ddH2O 7μL。RT-PCR所用引物序列為5′-CTCATTCCCAACCTGCTGAA-3′和5′-GCAAATGGCACTGTACCGCT-3′。RT-PCR產(chǎn)物用MnlI（NEB）內(nèi)切酶消化。RT-PCR擴(kuò)增條件，酶切體系、條件，酶切產(chǎn)物電泳檢測方法見材料方法1.2。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

在統(tǒng)計(jì)分析前，以下四分位數(shù)（first quantile）-1.5 ×四分位距（interquantile range）為下限，以上四分位數(shù)（third quantile）+ 1.5 ×四分位距（interquantile range）為上限，刪除采食量、增重、產(chǎn)蛋量和CCKAR表達(dá)量數(shù)據(jù)中的異常值。g.73206714T＞C和g.73209189C＞T與料肉比的關(guān)聯(lián)性用雙因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，模型為FCRi= μ + sexi+ genotypei+ sexi× genotypei+ ei，F(xiàn)CRi為個(gè)體i的料肉比，μ為群體均值，genotypei為基因型效應(yīng)，sexi×genotypei為性別與基因型的互作效應(yīng)，ei為誤差項(xiàng)；料蛋比方差分析模型為FCRi= μ + genotypei+ ei，各項(xiàng)含義與料肉比模型相同。CCKAR基因在各組織間的表達(dá)差異用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)模型為ΔCt = μ + tissue + e。如果主效應(yīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的結(jié)果為顯著，則進(jìn)一步執(zhí)行各水平間最小二乘均數(shù)多重比較，多重比較校正方法為Tukey-Kramer。顯著水平為P<0.05。方差分析用SAS University Edition的GLM過程完成。CCKAR表達(dá)水平與采食量和料肉比的相關(guān)性用R語言Hmisc軟件包分析。

2 結(jié)果

2.1 略陽烏雞飼料轉(zhuǎn)化率描述統(tǒng)計(jì)

性別效應(yīng)對略陽烏雞料肉比有顯著（F=29.44,<0.0001）影響，公雞料肉比5.41±0.76顯著低于母雞（6.62±1.00；圖1）。略陽烏雞26到30周齡平均料蛋比為2.85±0.41。略陽烏雞同期飼料轉(zhuǎn)化率不僅低于商業(yè)蛋雞和肉雞，而且存在較大群體變異性，公雞料肉比變異范圍在3.6—7.4之間（變異系數(shù)（C.V.）=14.0 %），母雞在4.8—9.1之間（C.V.= 15.1%），料蛋比變異范圍在2.0—4.4之間（C.V.=14.3%；圖2）。

圖1 略陽烏雞12—16周齡料肉比分布

2.2 CCKAR序列變異與略陽烏雞飼料轉(zhuǎn)化率的關(guān)聯(lián)性

本研究分析了CCKAR基因內(nèi)兩個(gè)SNP與略陽烏雞料肉比和料蛋比的關(guān)聯(lián)性。g.73206714T＞C的基因型效應(yīng)對略陽烏雞12—16周齡料肉比有顯著影響（= 8.44，=0.0004），TT型料肉比（5.18±0.63）顯著低于CC（6.37±1.1）和CT型（6.17±0.95），CC型和CT型的料肉比無顯著差異（圖2）。g.73206714T＞C與性別的互作效應(yīng)對料肉比無顯著影響（=0.72，=0.49）。g.73206714T＞C位點(diǎn)的基因型效應(yīng)對略陽烏雞26—30周齡的料蛋比無顯著影響（=2.16，=0.12；圖2）。在略陽烏雞樣本中，本研究在g.73209189C＞T位點(diǎn)主要檢測到CC和CT兩種基因型。g.73209189C＞T的基因型效應(yīng)對料肉比（=0.67，=0.41）和料蛋比（=0.48，=0.62）均無顯著影響（圖2）。在料肉比性狀上，g.73209189C＞T與性別也不存在顯著的互作效應(yīng)（=3.20，=0.07）。

箱線圖上方小寫字母標(biāo)出多重比較結(jié)果，相同字母或未標(biāo)注字母代表基因型間差異不顯著，不同字母代表基因型間存在差異顯著（P<0.05）

2.3 g.73206714T＞C位點(diǎn)等位基因特異性表達(dá)分析結(jié)果

關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)g.73206714T＞C顯著關(guān)聯(lián)到略陽烏雞料肉比。g.73206714T＞C是CCKAR基因第三外顯子上的一個(gè)同義突變。如果g.73206714T＞C直接參與飼料轉(zhuǎn)化效率調(diào)控，g.73206714T＞C可能通過影響CCKAR基因的表達(dá)發(fā)揮作用。經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，g.73206714T＞C的T等位基因會(huì)影響RORC、Myb、Tcf15、Mycn、HOXA4、GSX2、hoxc4、YY2與DNA的結(jié)合，而C等位基因會(huì)影響NR5A1、Esrrg、VDR、Dmrt1、HLTF、Nr2e3、ZEB1、FOXK1、SOX10、Foxo1、DMRTA2、Sox5、LBX1、Foxj2、FOXO3、FOXC1、FOXO4、FOXO6、FOXI1、C/EBPα與DNA的結(jié)合。

為了進(jìn)一步闡明g.73206714T＞C與CCKAR基因表達(dá)水平間的聯(lián)系，本研究通過等位基因特異性表達(dá)試驗(yàn)檢測CCKAR基因在T和C等位基因間的表達(dá)差異。本研究以基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物為對照，控制由酶切效率產(chǎn)生的潛在誤差。在理論上，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，CT雜合子將產(chǎn)生數(shù)量相當(dāng)?shù)腃等位基因和T等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR-RFLP結(jié)果顯示，CT產(chǎn)生138 bp（T等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物）和109 bp（C等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物）兩種亮度接近的電泳條帶（圖3），表明PCR-RFLP能夠準(zhǔn)確檢測等位基因特異性擴(kuò)增子豐度。在對10只雜合仔雞的RT-PCR（模板為cDNA）產(chǎn)物酶切后，除了個(gè)別樣本外，多數(shù)樣本T等位基因轉(zhuǎn)錄本豐度均明顯高于C等位基因，說明CCKAR基因在g.73206714T＞C位點(diǎn)存在等位基因表達(dá)不平衡性，其中，T等位基因與CCKAR基因高表達(dá)活性關(guān)聯(lián)。

以g.73206714T＞C為標(biāo)記，選取10只雜合子（CT）個(gè)體，用MnlI內(nèi)切酶消化各組織RT-PCR產(chǎn)物。消化產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳分離。T等位基因?qū)a(chǎn)生138 bp條帶，C等位基因?qū)a(chǎn)生109 bp和29 bp兩種條帶，29 bp條帶在3%瓊脂糖電泳中不可見。基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物被用作對照，驗(yàn)證MnlI檢測等位基因特異性轉(zhuǎn)錄本豐度差異的準(zhǔn)確性

2.4 CCKAR基因表達(dá)水平與料肉比的相關(guān)性

為了進(jìn)一步分析CCKAR基因表達(dá)水平與料肉比的關(guān)系，本研究檢測了CCKAR基因在下丘腦、腦垂體、胰腺、膽囊和十二指腸中的表達(dá)量。CCKAR基因在胰腺中表達(dá)水平最高（圖4）。CCKAR基因表達(dá)水平除了在十二指腸和下丘腦間無顯著差異外，在其他組織間均存在顯著差異。CCKAR基因在胰腺和腦垂體中的表達(dá)水平與料肉比呈現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)（圖5）。CCKAR基因在膽囊中的表達(dá)水平與料肉比存在潛在的負(fù)相關(guān)。在十二指腸和下丘腦中，CCKAR表達(dá)水平與料肉比間的負(fù)相關(guān)均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著水平。CCKAR基因在胰腺中的表達(dá)水平與采食量存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，但在其他組織中，二者的相關(guān)關(guān)系均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

箱線圖上方的字母標(biāo)出了多重比較的結(jié)果，相同字母表示組織間差異不顯著，不同字母表示組織間差異顯著（P<0.05）

3 討論

鑒于CCK信號(hào)在食欲調(diào)控和能量平衡調(diào)節(jié)中的作用[16-17]，CCKAR的表達(dá)水平與動(dòng)物的采食量、生長速度及一些代謝疾病的發(fā)生密切相關(guān)[3-5]。在雞中，CCKAR基因在快速生長型雞中的表達(dá)水平顯著低于慢速生長型雞[5]。研究人員推測CCKAR基因低表達(dá)促生長的機(jī)制很可能與飽食信號(hào)閾值改變有關(guān)[5]。除了影響食欲外，CCK信號(hào)對消化的調(diào)節(jié)作用表明，CCKAR的表達(dá)水平很可能與飼料利用率也有密切聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)CCKAR基因在胰腺、腦垂體和膽囊中的表達(dá)水平越高，雞的料肉比越低，為上述推測提供了直接證據(jù)。進(jìn)而，在CCKAR基因第三外顯子上發(fā)現(xiàn)同義突變g.73206714T＞C不僅與CCKAR基因的表達(dá)活性有關(guān)，而且與料肉比顯著關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果支持CCKAR基因是一個(gè)調(diào)節(jié)雞飼料轉(zhuǎn)化率的候選基因，而該基因內(nèi)一些影響表達(dá)的功能變異很可能構(gòu)成了雞飼料轉(zhuǎn)化率差異的分子基礎(chǔ)。

3.1 CCKAR基因表達(dá)水平影響飼料轉(zhuǎn)化率的潛在機(jī)制

基于相關(guān)分析的結(jié)果，本研究推測CCKAR水平可能通過以下3種途徑影響飼料轉(zhuǎn)化率。第一、消化液分泌途徑。CCK作為一種腸肽激素，能刺激胰酶和膽汁分泌[1]。CCKAR拮抗劑能有效阻斷CCK對胰酶分泌的刺激作用，說明CCKAR是介導(dǎo)CCK消化調(diào)節(jié)作用的特異性受體，CCKAR水平直接影響消化液的分泌[9]。本研究發(fā)現(xiàn)CCKAR基因在胰腺中的表達(dá)水平與料肉比呈中等強(qiáng)度的負(fù)相關(guān)，支持CCKAR水平可以通過影響消化液的分泌，影響飼料利用率。第二、脂代謝途徑。將飼料轉(zhuǎn)化為脂肪是極不經(jīng)濟(jì)的一種做法。相反，提高脂肪的分解效率，抑制脂肪的沉積將有助于提高飼料利用率[18]。膽汁可以通過脂滴乳化促進(jìn)脂肪的消化，也可以通過白色脂肪棕色化促進(jìn)脂肪組織的分解[19]。外源CCK注射證明，膽汁的分泌量隨CCK劑量的增加而增加[9]。所以，CCKAR表達(dá)水平的升高有可能通過提高膽汁的分泌量，促進(jìn)脂代謝，提高飼料轉(zhuǎn)化率。此外，生長激素可以促進(jìn)脂代謝和同化作用[20]。外源注射CCK能顯著提高生長激素的分泌量[21]。本研究發(fā)現(xiàn)CCKAR基因在腦垂體中的表達(dá)水平與料肉比存在負(fù)相關(guān)性。據(jù)此推測CCKAR表達(dá)上調(diào)可能對生長激素的分泌有促進(jìn)作用，進(jìn)而提高飼料轉(zhuǎn)化率。第三、采食量途徑。研究表明，家禽的采食量越低，飼料利用率越高[12,22-23]。Zeng等[23]發(fā)現(xiàn)CCK在下丘腦中的表達(dá)水平越高，鴨的飼料轉(zhuǎn)化率越高。本研究發(fā)現(xiàn)CCKAR基因在胰腺中的表達(dá)水平不僅與采食量呈負(fù)相關(guān)，而且與料肉比也呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果支持CCK系統(tǒng)也可能通過抑制雞的采食量，提高飼料轉(zhuǎn)化率。

ADFI_16wk代表16周齡日平均采食量，F(xiàn)CR_16wk代表16周齡料肉比。圖上方的數(shù)字是相關(guān)系數(shù)和相關(guān)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)的P值

3.2 CCKAR基因表達(dá)水平對雞食欲的調(diào)節(jié)作用

在腸-腦軸食欲調(diào)控系統(tǒng)中，CCK作為一種小腸分泌的飽食信號(hào)分子，它通過與迷走神經(jīng)中的受體結(jié)合向食欲調(diào)控中樞（下丘腦弓狀核）傳遞飽食信號(hào)，也可以直接與食欲調(diào)控神經(jīng)元表面的受體結(jié)合產(chǎn)生飽食信號(hào)，調(diào)節(jié)動(dòng)物的食欲和采食量[24-25]。CCKAR作為CCK飽食信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，其表達(dá)水平與采食量密切相關(guān)[5]。本研究在胰腺中檢測到CCKAR表達(dá)水平與采食量呈負(fù)相關(guān)，但是在食欲調(diào)控關(guān)鍵組織（下丘腦和十二指腸）中均未檢測到這種負(fù)相關(guān)性。鑒于CCKAR基因在胰腺中表達(dá)水平最高，本研究推測胰腺很可能是發(fā)出CCK飽食信號(hào)的關(guān)鍵外周器官。

3.3 g.73206714T＞C對CCKAR基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制

本研究發(fā)現(xiàn)CCKAR基因的表達(dá)水平與雞飼料轉(zhuǎn)化率顯著相關(guān)，而鑒定表達(dá)調(diào)節(jié)突變是從分子層面揭示CCKAR對飼料轉(zhuǎn)化率遺傳調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵。g.73206714T＞C是一個(gè)與雞的體重顯著關(guān)聯(lián)的突變[5]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這個(gè)變異不僅與料肉比顯著關(guān)聯(lián)，而且與CCKAR基因的表達(dá)水平也密切相關(guān)。g.73206714T＞C對28個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合產(chǎn)生潛在影響。這些轉(zhuǎn)錄因子的功能涉及脂代謝、性別決定、神經(jīng)、軟骨、肌肉等組織的發(fā)育等多個(gè)生物學(xué)過程[26-31]。其中，F(xiàn)OXO1, C/EBPα和FOXK1是3個(gè)潛在的CCKAR表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白。FOXO1通過調(diào)節(jié)食欲調(diào)控神經(jīng)肽在下丘腦弓狀核中的表達(dá)來調(diào)控動(dòng)物的食欲，而C/EBPα和FOXK1通過調(diào)節(jié)能量代謝相關(guān)蛋白FTO、PPARγ、IGF-1、leptin、insulin等的表達(dá)，參與能量平衡調(diào)節(jié)[29-33]。盡管目前并無直接證據(jù)表明這些轉(zhuǎn)錄因子參與CCKAR的表達(dá)調(diào)控，但是鑒于CCK系統(tǒng)在鳥類食欲和能量平衡調(diào)節(jié)中的作用[16]，CCKAR很可能也是受這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的靶基因。

3.4 g.73206714T＞C與飼料轉(zhuǎn)化率關(guān)聯(lián)性對雞育種的意義

通過檢測C等位基因在不同生長性能品種中的頻率分布，研究人員發(fā)現(xiàn)C等位基因頻率與雞生長性能存在顯著正相關(guān)性[5]。這表明C等位基因很可能是受到正向選擇的一個(gè)功能突變。然而，對飼料轉(zhuǎn)化率而言，本研究發(fā)現(xiàn)C等位基因并不是一個(gè)優(yōu)勢等位基因。C等位基因有更低的表達(dá)活性，而CCKAR基因低表達(dá)將減弱雞飽食信號(hào)閾值，增大采食量[5]。這些結(jié)果提示，如果以C等位基因?yàn)闃?biāo)記，對雞生長性能進(jìn)行輔助選擇，極有可能是以提高雞采食量的方式促進(jìn)雞的生長[34]。這種育種策略并不利于提高飼料利用率，降低養(yǎng)殖成本。相反，以犧牲一定生長速度為代價(jià)改進(jìn)品種的飼料轉(zhuǎn)化率，可能具有更大的實(shí)際意義。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)提高CCKAR基因表達(dá)水平更有利于改進(jìn)雞的飼料轉(zhuǎn)化率，而g.73206714T＞C的T等位基因是一個(gè)與CCKAR基因的高表達(dá)活性和高飼料轉(zhuǎn)化率關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記。這些發(fā)現(xiàn)為雞的飼料轉(zhuǎn)化率遺傳調(diào)控機(jī)制研究提供線索，為從育種和CCKAR活性干預(yù)角度改進(jìn)雞的飼料轉(zhuǎn)化率提供思路。

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WANG ZhePeng, ZHOU WenXin, HE JunXi, HU QiaoYan, ZHAO JiaYue

College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi

【Background】Increased appetite and feed conversion efficiency forms a physiological basis underlying high growth of modern commercial broiler chickens. Cholecystokinin A receptor (CCKAR) is a key receptor for mediating CCK signals and involving in regulation of appetite and digestion. In view of the important role of CCK signals in the control of energy balance, the levels of CCKAR expression are closely related to the growth of chickens. However, the mechanism by which the abundance of CCKAR affects the growth of chickens remains unclear. 【Objective】 The aim of this study was to elucidate the relationship of levels of CCKAR expression and sequence variants with feed conversion efficiency, which would promote the understanding of genetic basis of the growth traits and breeding for improvement of feed efficiency in the chicken. 【Method】The feed to meat conversion ratio of Lueyang black-boned chickens (rooster n=62, pullet n=67) from 12 to 16 weeks of age and the feed to egg conversion ratio from 26 to 30 weeks of age (n=150) were individually measured. Two synonymous mutations (g.73206714T＞C and g.73209189C＞T) in the CCKAR gene were genotyped by using PCR-RFLP. Association of two SNP with the feed to meat conversion ratio was tested by using two-way analysis of variance with sex treated as a fixed effect. Association of two SNP with the feed to egg conversion ratio was tested by using one-way analysis of variance. Disrupting effect of g.73206714T＞C on transcription factor binding sites was predicted in silico by using JASPAR database. Ten birds that were heterozygotes (CT) at the g.73206714T＞C locus were selected to analyze imbalance of CCKAR expression between T and C alleles. The difference of allele-specific expression was detected by using PCR-RFLP. The Levels of CCKAR expression were detected by qPCR in the hypothalamus, pituitary, pancreas, gallbladder and duodenum of Lueyang black-boned chickens (n=30). The correlation of levels of CCKAR expression with food intake and feed to meat conversion ratio was analyzed. 【Result】 Sex had a significant (=29.44，<0.0001) effect on the feed to meat conversion ratio, and the feed efficiency (5.41±0.76) of roosters was significantly superior to pullets (6.62± 1.00). Of two SNP, only g.73206714T＞C was significantly associated with the feed to meat conversion ratio. The feed to meat conversion ratio (5.18±0.63) of the TT genotype was significantly lower than ones of CC (6.37±1.1) and CT (6.17±0.95) genotypes. The feed to meat conversion ratio had no significant difference between CC and CT. There was no significant interaction effect between genotypes of g.73206714T＞C and sex. G.73206714T＞C potentially disrupted binding sites of 28 transcription factors. Allele-specific expression assay showed that the abundance of transcripts with the T allele was higher than one of transcripts with the C allele, supporting that differential expression of CCKAR gene between alleles might likely contribute to genetic association of g.73206714 with the feed to meat conversion ratio. Average feed to egg conversion ratio of Lueyang black-boned chickens was 2.85±0.41 at the 26-30 weeks of age. Both g.73206714T＞C and g.73209189C＞T had no significant effect on the feed to egg conversion ratio. The levels of CCKAR expression in the pancreas were the highest among five tissues, which showed a negative correlation (=-0.45,=0.017) with feed intake. But there was no significant correlation between levels of CCKAR expression and feed intake in other tissues. In the pancreas (=-0.41,=0.03) and pituitary (=-0.57,=0.0018), the higher levels of CCKAR expression was, the lower the feed to meat conversion ratio was. But in other tissues, there was no the negative correlation.【Conclusion】This study found that increased levels of CCKAR was associated with high feed efficiency. The T allele of g.73296714T＞C was associated with high expression activity of CCKAR gene, and with high feed efficiency.

chicken; growth; CCKAR; feed conversion efficiency; appetite

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.22.017

2021-09-03；

2021-11-24

陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021NY-028）、略陽烏雞蛋用型配套系選育（WJYJY-2021-3）

王哲鵬，Tel：15619295726；E-mail：wangzhepeng-001@163.com

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