高濃度CO2對(duì)2株生防真菌生長與致病力的影響

王從林，刁紅亮，邢培翔，王 迪，王志鑫，馬瑞燕

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 山西 太谷 030801）

工業(yè)革命之后，全球大氣中的CO2濃度一直處于上升狀態(tài)，目前大氣CO2濃度已達(dá)到400 μmol/mol，預(yù)計(jì)2100 年將上升至730～1 020 μmol/mol。升高的CO2濃度除了對(duì)全球氣候的變化產(chǎn)生重大影響之外，還對(duì)各種植物、昆蟲以及微生物的生長和活動(dòng)等都有不同程度的影響[1-2]。環(huán)境中CO2濃度的增加可加大植物分支和分蘗的機(jī)會(huì)以及促進(jìn)根系和幼苗的生長，促進(jìn)水分的利用，加快植物自身循環(huán)代謝積累和生長，提高植物的抗逆境和光合等作用[3]。與此同時(shí)，發(fā)展富碳農(nóng)業(yè)也逐漸成為各國應(yīng)對(duì)氣候變化和糧食安全的重要舉措。富碳農(nóng)業(yè)是以高于大氣中二氧化碳濃度作為氣肥釋放在相對(duì)密閉的人造氣候的小區(qū)域中，培養(yǎng)種植各類作物，輔以其他科學(xué)技術(shù)手段，創(chuàng)造一個(gè)高效率的光合作用環(huán)境，生產(chǎn)出大量農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的一類農(nóng)業(yè)生產(chǎn)新技術(shù)[4]，其中以富碳溫室的應(yīng)用最為普遍。富碳溫室的出現(xiàn)解決了作物光合作用活動(dòng)加強(qiáng)時(shí)CO2濃度降低引起的CO“2饑餓癥”，進(jìn)而影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的問題。有研究表明，在黃瓜棚中適量增加CO2濃度后，平均葉寬和葉長會(huì)增加1.0～1.3 cm，平均株高、平均莖圍以及平均掛果數(shù)都有顯著增加，增施CO2也可促進(jìn)作物提前成熟，改善蔬菜品質(zhì)，使作物根系更發(fā)達(dá)等[5]。趙靜等[6]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度CO2加快了草莓果實(shí)的生長，提高了產(chǎn)量，改善了果實(shí)品質(zhì)。因此，對(duì)C3植物來說，CO2濃度升高具有顯著的“CO2施肥效應(yīng)”，而現(xiàn)有CO2條件下其光合速率受到限制，其最適CO2濃度約為1 000 μmol/mol[7]。

另一方面，CO2濃度升高也會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生一些負(fù)面影響[8]。王璐等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CO2濃度升高使甜椒光合作用和水分利用率升高，促進(jìn)了其生長發(fā)育，但同時(shí)也使甜椒蚜蟲數(shù)總量顯著增加97.30%，整體蟲害發(fā)生加劇，導(dǎo)致其產(chǎn)量及地上部生物量無顯著變化。因此，關(guān)注富碳環(huán)境下病蟲害的安全高效治理是保障富碳農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要舉措。昆蟲病原真菌可與節(jié)肢動(dòng)物形成一種有利于自身但有害于寄主的共生關(guān)系，是一種寄生性真菌，其中一些可用于蟲害防治的又被稱作生防真菌[10]。生防真菌在昆蟲綱（Insecta）和蜱螨目（Acarina）中具有較廣的寄主范圍和顯著的應(yīng)用特點(diǎn)，是目前唯一可高效防治半翅目刺吸式口器害蟲的生防資源[11]。以蟲生真菌為活性物的真菌殺蟲劑已被廣泛應(yīng)用于溫室、大田和園林中的薊馬、白粉虱、蚜蟲等主要害蟲的防治[12]，是一種安全高效的生物防治技術(shù)。玉米粘蟲（Mythimna separateWalker），又名東方粘蟲，屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），喜食稻、麥、粟、黍、玉米、高粱等作物，是嚴(yán)重威脅我國糧食生產(chǎn)安全的重大蟲害[13]。溫室白粉虱（Trialeurodes vaporariorumWestwood）屬同翅目（Homoptera）粉虱科（Aleyrodidae），繁殖力強(qiáng)，食性雜，是溫室蔬菜的主要害蟲之一[14]。

本試驗(yàn)以2 株重要的生防真菌玫煙色棒束孢（Isaria fumosoroseaWize）和白僵菌（Beauveria bassianaVuill）為對(duì)象，研究了富碳條件對(duì)菌株孢子萌發(fā)能力和對(duì)玉米粘蟲和白粉虱2 種寄主害蟲致病力的影響，并進(jìn)一步研究了高濃度CO2條件對(duì)2 個(gè)菌株萌發(fā)與生長的影響，旨在為富碳溫室中應(yīng)用生防真菌防治蟲害提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 玫煙色棒束孢IF-1106 菌株（簡稱IF-1106），分離自山西省晉中市太谷縣普通溫室大棚中，保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.7514。

白僵菌購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)為CICC 41021（簡稱BB-1021），為凍干菌種，經(jīng)打管活化后再轉(zhuǎn)接2～3 代恢復(fù)菌種活力后使用。

1.1.2 供試?yán)ハx 溫室白粉虱（Trialeurodes vaporariorumWestwood）為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定培養(yǎng)種群，飼養(yǎng)與繁殖條件為溫度為（26±1）℃，濕度65%±5%，光照L∶D＝14∶10。

玉米粘蟲（Mythimna separateWalker）為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定培養(yǎng)種群，飼養(yǎng)與繁殖條件為溫度（25±1）℃，濕度60%～80%，光照L∶D＝12∶12。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防真菌孢子懸浮液的配制 將2 株生防菌株接種于PDA 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃、12∶12（L∶D），培養(yǎng)10 d產(chǎn)孢。將一定量0.1%吐溫-80無菌水加入到長滿菌絲的培養(yǎng)皿中，用刮板輕輕將孢子和菌絲刮下，將孢子混合液轉(zhuǎn)移至盛有玻璃珠的錐形瓶中，將孢子均勻打散，用滅菌紗布過濾得到母液。先用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整母液至孢子濃度為1.0×108個(gè)/mL，再將其稀釋相應(yīng)濃度。

1.2.2 生防真菌孢子萌發(fā)率的測定 采用改進(jìn)后COHEN 等[15]的CFU 孢子萌發(fā)率方法測定菌株的孢子萌發(fā)率。使用無菌移液器吸取200 μL配制好的孢子懸浮液（濃度為1.5×103個(gè)/mL）置于直徑為150 mm PDA平板中（每皿約含300個(gè)孢子），以無菌涂布器涂布均勻。將接種后的平板分別置于25 ℃的普通霉菌培養(yǎng)箱和富含CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48～72 h直至生長出清晰菌落，使用菌落計(jì)數(shù)器確定平板中的菌落數(shù)，并計(jì)算孢子萌發(fā)率。富碳條件的CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 000 mg/kg（0.1%），高體積分?jǐn)?shù)CO2條件分別設(shè)定為5%、10%、15%和20%，普通條件下CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為400 mg/kg（0.04%）為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。

1.2.3 生防真菌生長速率的測定 首先將直徑6 mm 的滅菌濾紙片置于PDA 平板中央，以無菌移液器吸取2.5 μL 孢子懸浮液（1.0×107個(gè)/mL）輕輕接種在濾紙片上，將接種后的平板置于25 ℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h 后取出平板采用十字交叉法測定菌落直徑，連續(xù)測定10 d。

1.2.4 生防真菌致病力測定 分別配制3 個(gè)濃度的孢子懸浮液（1.0×106、1.0×107和1.0×108個(gè)/mL），對(duì)玉米粘蟲3齡幼蟲進(jìn)行浸漬感染。浸漬20 s后放入培養(yǎng)皿中并用保鮮膜封口，在薄膜上扎小孔通氣，置于25 ℃、12 L∶12 D、相對(duì)濕度80%以上CO2人工氣候箱培養(yǎng)。每天更換新鮮玉米葉，每日檢查死亡蟲數(shù)，根據(jù)蟲尸體表長出的真菌孢子確定為感染致死，連續(xù)觀察7 d。每個(gè)處理設(shè)6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15頭試蟲，以0.01%吐溫-80的無菌水處理作為空白對(duì)照。

用同上所述的3 個(gè)濃度的孢子懸浮液對(duì)帶有白粉虱2齡若蟲的黃瓜葉片進(jìn)行噴霧侵染，直至葉片上形成液滴并自然滴下，用0.1%的吐溫-80 無菌水處理作為對(duì)照。每處理設(shè)6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)中含2齡若蟲50頭。待黃瓜葉片自然晾干后，將幼苗置于25 ℃、14 L∶10 D、相對(duì)濕度80%以上的CO2人工氣候箱中，在富碳條件（CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 000 mg/kg）和普通條件（CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)400 mg/kg）下培養(yǎng)，并逐日觀察記錄白粉虱致死情況，連續(xù)觀察7 d。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)生防真菌的萌發(fā)與生長進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，萌發(fā)率通過Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）?；貧w方程用SPSS 19.0 線性回歸分析得出，回歸方程斜率即為菌落生長速率。

生防真菌在不同CO2條件下對(duì)試蟲的累計(jì)校正死亡率采用Duncan多重比較法進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。生防菌株的致病力數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 富碳條件對(duì)2株生防真菌萌發(fā)率的影響

2株生防真菌在富碳條件與普通條件下的萌發(fā)率對(duì)比結(jié)果如圖1 所示。從圖1 可以看出，生防菌株IF-1106 在富碳條件與普通條件下的孢子萌發(fā)率（F＝0.079；df＝1，8；P＝0.785）差異不顯著；而生防菌株BB-1021 在富碳條件與普通條件下的孢子萌發(fā)率（F＝0.087；df＝1，8；P＝0.776）同樣差異不顯著。表明富碳溫室中的高CO2濃度環(huán)境對(duì)2株生防真菌的萌發(fā)沒有影響。

2.2 高體積分?jǐn)?shù)CO2對(duì)2株生防真菌萌發(fā)率的影響

在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%時(shí)，2株菌株的萌發(fā)率分別如圖2、3 所示。由圖2 可知，在不同體積分?jǐn)?shù)CO2條件下，IF-1106 孢子萌發(fā)率存在顯著差異（F＝94.050；df＝4，24；P＜0.001），其中當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，菌株的萌發(fā)率最高，為96.68%±3.29%，且與對(duì)照差異不顯著（P＝0.964）；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為5%和15%時(shí)，孢子萌發(fā)率分別為69.08%±3.11%和65.44%±1.64%；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，孢子萌發(fā)率最低，為19.48%±3.44%。結(jié)果表明，在CO2體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，IF1106 菌株孢子的萌發(fā)無抑制作用。

由圖3 可知，不同濃度CO2對(duì)BB-1021 的孢子萌發(fā)率也存在顯著的差異（F＝120.64；df＝4，24；P＜0.001）。其中，當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為5%和10%時(shí)，孢子萌發(fā)率均為100%，且顯著高于對(duì)照（P＝0.015；P＝0.040）；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為15%和20%時(shí)，菌株的萌發(fā)率分別為79.73%±2.02%和61.60%±2.09%，且顯著低于對(duì)照（P＜0.05）。表明CO2體積分?jǐn)?shù)為5%和10%對(duì)BB-1021 菌株孢子的萌發(fā)無抑制作用。

2.3 高體積分?jǐn)?shù)CO2對(duì)2株生防菌株生長的影響

在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%時(shí)，2個(gè)菌株菌落的生長擬合曲線分別如圖4、5所示，其生長速率回歸方程及其參數(shù)如表1、2所示。從圖4和表1可以看出，不同體積分?jǐn)?shù)CO2條件對(duì)IF-1106菌株菌落的生長有一定影響。當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、10%和15%時(shí)，對(duì)2 個(gè)菌株菌落的生長具有一定促進(jìn)作用，其中CO2體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，菌株的生長速率顯著最大（P＜0.05），達(dá)到3.019 mm/d；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為5%和15%時(shí)，菌株的生長速率較對(duì)照差異不顯著；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，2個(gè)菌株菌落的生長速率為2.505 mm/d，顯著低于對(duì)照（P＜0.05）。

表1 玫煙色棒束孢的生IF-長1速10率6在回不歸同方體程積分?jǐn)?shù)CO2條件下Tab.1 Growth rate regression equation of Isaria fumosorosea IF-1106 at different CO2 concentrations

從圖5 和表2 可以看出，不同體積分?jǐn)?shù)CO2對(duì)BB-1021菌株菌落的生長也有一定影響。當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、10%和15%時(shí)，對(duì)菌落的生長具有顯著的促進(jìn)作用（P＜0.05），其中CO2體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)菌株的生長速率最大，達(dá)到（3.398±0.055）mm/d；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，菌落的生長速率為（2.359±0.0317）mm/d，顯著低于對(duì)照。

表2 白僵菌BB生-長10速21率在回不歸同方濃程度CO2條件下的Tab.2 Growth rate regression equation of Beauveria bassiana BB-1021 at different CO2 concentrations

2.4 富碳條件對(duì)2株生防真菌致病力的影響

2.4.1 富碳條件對(duì)2株生防真菌感染玉米粘蟲3齡幼蟲致病力的影響 在普通環(huán)境（CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)400 mg/kg）和富碳環(huán)境（CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 000 mg/kg）中，用不同濃度的孢子懸浮液處理玉米粘蟲3齡幼蟲，7 d后的累計(jì)校正死亡率如圖6所示。

從圖6 可以看出，在2 種CO2濃度條件下，IF-1106菌株1.0×107個(gè)/mL和1.0×108個(gè)/mL這2個(gè)濃度孢子懸浮液對(duì)玉米粘蟲3 齡幼蟲的感染死亡率與對(duì)照存在顯著性差異（P＜0.05）。當(dāng)濃度為1.0×106個(gè)/mL 時(shí)，2 種CO2條件下的校正死亡率差異不顯著（F＝0.078；df＝1，8；P＝0.788）；當(dāng)濃度為1.0×107個(gè)/mL 和1.0×108個(gè)/mL 時(shí)2 種CO2條件下的校正死亡率差異顯著（（F＝16.010；df＝1，8；P＝0.004），（F＝10.021；df＝1，8；P＝0.013）），且富碳環(huán)境下IF-1106菌株對(duì)粘蟲3齡幼蟲的感染致死能力顯著高于普通環(huán)境。

BB-1021菌株在濃度為1.0×106個(gè)/mL時(shí)，2種CO2濃度條件下的校正死亡率差異顯著（F＝28.048；df＝1，8；P＝0.001）；當(dāng)濃度1.0×107個(gè)/mL 和1.0×108個(gè)/mL時(shí)，校正死亡率差異均不顯著（（F＝2.208；df＝1，8；P＝0.176）；（F＝0.186；df＝1，8；P＝0.677））。在富碳環(huán)境下BB-1021菌株1.0×106個(gè)/mL濃度感染致死能力顯著高于普通環(huán)境。

2.4.2 富碳條件對(duì)2 株生防真菌感染溫室白粉虱2 齡若蟲致病力的影響 用不同濃度的IF-1106和BB-1021 分別在普通環(huán)境和富碳環(huán)境中感染溫室白粉虱2 齡若蟲，7 d 后累計(jì)校正死亡率如圖7所示。

從圖7 可以看出，2 種CO2濃度條件下IF-1106孢子懸浮液對(duì)白粉虱2 齡若蟲的感染死亡率差異均不顯著（（F＝0.002；df＝1，8；P＝0.965）；（F＝3.821；df＝1，8；P＝0.086）；（F＝0.094；df＝1，8；P＝0.768））。

BB-1021 菌株各個(gè)濃度孢子懸浮液對(duì)白粉虱2 齡若蟲的感染死亡率差異均不顯著（（F＝0.051；df＝1，8；P＝0.827）；（F＝0.899；df＝1，8；P＝0.371）；（F＝1.355；df＝1，8；P＝0.278））。

3 結(jié)論與討論

近年來，CO2濃度升高對(duì)微生物群落和生長的影響已成為研究熱點(diǎn)，但多集中于對(duì)土壤微生物的研究，鮮有涉及昆蟲病原真菌。一般認(rèn)為，CO2濃度升高促進(jìn)了碳輸入，對(duì)真菌的生長更為有利[16]，例如土壤功能微生物叢枝菌根真菌豐富度在CO2濃度升高下平均增加了21%[17]。本研究結(jié)果顯示，CO2濃度提高到富碳溫室水平時(shí)，生防真菌玫煙色棒束孢IF-1106 和白僵菌BB-1021 的孢子萌發(fā)沒有受到影響，可以保持正常的萌發(fā)率。當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)提高至10%時(shí)，玫煙色棒束孢IF-1106孢子萌發(fā)無顯著影響并且菌絲生長速率明顯提高；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，白僵菌BB-1021 孢子萌發(fā)無顯著影響且菌絲生長速率顯著增加。結(jié)果表明，一定體積分?jǐn)?shù)的CO2可在不影響孢子萌發(fā)的前提下促進(jìn)菌株的菌落生長，這種響應(yīng)特點(diǎn)應(yīng)該與菌株生長萌發(fā)的需氧量特性有關(guān)，例如，玫煙色棒束孢屬于發(fā)酵培養(yǎng)需氧量較低的蟲生真菌[18]，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。而過高的CO2濃度開始影響到菌株的正常呼吸作用，因此，當(dāng)試驗(yàn)中CO2體積分?jǐn)?shù)≥15%時(shí)，菌株的萌發(fā)生長被明顯抑制。

玫煙色棒束孢和白僵菌可有效感染溫室白粉虱。孟豪[19]測定了玫煙色棒束孢和白僵菌對(duì)溫室白粉虱2齡若蟲的致病力，其LC50值分別為1.58×105、3.57×106個(gè)/mL。NAEEM 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，玫煙色棒束孢和白僵菌也可有效感染玉米粘蟲，對(duì)玉米粘蟲3齡幼蟲的LC50值分別為3.19×108、6.48×108個(gè)/mL。提高CO2的濃度對(duì)昆蟲和微生物都會(huì)產(chǎn)生一定影響，因此，在富碳條件下生防真菌的致病力可能是交互作用影響的結(jié)果。林春燕等[21]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度CO2對(duì)II 型豌豆蚜產(chǎn)蚜前歷期無明顯影響，但能顯著抑制其繁殖力。CO2濃度的升高會(huì)引起自然界各個(gè)組分的改變，使昆蟲的生存環(huán)境和競爭者發(fā)生改變，從而間接影響昆蟲生長發(fā)育的過程以及生活習(xí)性[22-23]。趙磊[24]研究發(fā)現(xiàn)，CO2濃度升高對(duì)亞洲玉米螟的生長發(fā)育、取食效應(yīng)、種群特性都產(chǎn)生了顯著影響。本研究對(duì)比了富碳條件與普通條件下生防真菌玫煙色棒束孢和白僵菌對(duì)2 種害蟲的致死率，結(jié)果顯示，富碳條件對(duì)2株生防真菌感染2種害蟲的致死率無顯著影響并具有一定促進(jìn)作用，這表明在富碳條件下可以使用這2 株生防真菌作為害蟲防治因子。

本研究表明，富碳溫室中的高CO2濃度環(huán)境對(duì)生防真菌玫煙色棒束孢和白僵菌的萌發(fā)沒有影響，同時(shí)也對(duì)菌株侵染玉米粘蟲和溫室白粉虱的致病力沒有顯著影響。當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)小于10%時(shí)，白僵菌孢子的萌發(fā)不受到抑制，玫煙色棒束孢孢子的萌發(fā)受到輕微抑制；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)大于10%時(shí)，對(duì)2株菌株的孢子萌發(fā)均有較強(qiáng)的抑制作用，表明10%的CO2體積分?jǐn)?shù)可能是2株病原真菌孢子萌發(fā)的臨界值。同時(shí)，白僵菌較玫煙色蟲草對(duì)高體積分?jǐn)?shù)的CO2表現(xiàn)出更高的耐受性。當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，3株生防真菌的菌絲生長均受到了抑制，表明15%～20%的CO2體積分?jǐn)?shù)可能是2株真菌菌絲生長的臨界值。張鑫等[25]研究表明，高濃度CO2會(huì)降低黏蟲體內(nèi)甘油三脂含量及體質(zhì)量，使水分含量增大，這有利于昆蟲病原真菌在侵染寄主時(shí)，需要一定的濕度，在寄主體內(nèi)需要吸收寄主營養(yǎng)和水分，來滿足自身的生長。因此，高體積分?jǐn)?shù)CO2對(duì)真菌的生長提供了更加合適的環(huán)境，粘蟲的死亡率相應(yīng)增加。本研究表明，富碳溫室的高濃度CO2環(huán)境不影響2株生防真菌的萌發(fā)，支持了以生防真菌作為富碳溫室的生防因子防治溫室蟲害的可行性，且進(jìn)一步明確了一定的高濃度CO2條件可在不影響孢子萌發(fā)的前提下有效促進(jìn)生防真菌的生長。