胡麻連作對土壤細(xì)菌群落的影響

王立光,葉春雷,陳 軍,李進(jìn)京,羅俊杰

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070)

連作障礙作為困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個復(fù)雜問題，其形成機(jī)制是農(nóng)業(yè)發(fā)展研究的熱點(diǎn)，備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。連作障礙是土壤內(nèi)部諸多因素綜合作用的外在表現(xiàn)，目前研究主要認(rèn)為土壤理化性質(zhì)、自毒作用及土壤微生物群落是引起連作障礙發(fā)生的主要因素[1-3]。土壤微生物在土壤中一直扮演著重要角色，對土壤養(yǎng)分的吸收轉(zhuǎn)化及作物生長發(fā)育具有顯著影響[4-5]。研究表明，連作障礙程度受到種植作物、種植模式、土壤類型及連作年限等因素的影響，連作會對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與物種多樣性造成破壞，抑制有益微生物的生長，促進(jìn)病原微生物積累與生長，造成土壤微生態(tài)系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低[6-13]。細(xì)菌是土壤微生物群落中的重要類群，在土壤微生物群落中起著重要作用。大豆、硒砂瓜及煙草等研究發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與連作障礙關(guān)系密切，受連作年限和作物種類的影響[6-7,14]。因此，對不同作物連作中的細(xì)菌群落變化進(jìn)行研究，將對破解其連作障礙有重要意義。

胡麻(Linumusitatissimum)是我國西北和華北黃土高原地區(qū)重要的油料作物。在實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，尤其干旱和半旱區(qū)的種植戶發(fā)現(xiàn)，胡麻連作2～3 a后其產(chǎn)量就顯著降低，而利用間作或輪作模式，可使其狀況得到明顯改善。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，胡麻連作3 a會導(dǎo)致土壤水提液自毒作用明顯加強(qiáng)，降低種子萌發(fā)、抑制植株生長，降低產(chǎn)量，并對土壤酶活性造成不利影響，表現(xiàn)出明顯的連作障礙現(xiàn)象[15-18]。目前，關(guān)于胡麻連作障礙的研究雖然已經(jīng)取得部分成果，但胡麻連作對土壤細(xì)菌群落多樣性及群落結(jié)構(gòu)影響的研究少有報(bào)道，因此，本試驗(yàn)通過高通量測序技術(shù)對胡麻連作土壤內(nèi)細(xì)菌群落進(jìn)行測定，研究胡麻連作條件下土壤細(xì)菌群落變化，以期從細(xì)菌群落變化角度解析胡麻連作障礙機(jī)制，從而為消減胡麻連作障礙提供理論依據(jù)，為胡麻產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)所用胡麻品種為隴亞10號，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所提供。試驗(yàn)地點(diǎn)為甘肅省榆中縣試驗(yàn)地(E104°06′35″、N35°50′36″)，海拔1 600 m，屬于黃土高原丘陵溝壑半干旱高寒區(qū)，年均降水量450 mm，年蒸發(fā)量1 400～1 450 mm,樣地區(qū)域土壤類型為黃綿土，有機(jī)質(zhì)18.5 g·kg-1,全氮1.15 g·kg-1,全磷1.5 g·kg-1,有效氮49.4 mg·kg-1,有效磷38.9 mg·kg-1,速效鉀104.1 mg·kg-1,pH 8.13。試驗(yàn)地為澆灌地，3月底胡麻種植，整個生長期實(shí)行規(guī)范化管理，胡麻生育期充分澆灌2次。

1.2 田間試驗(yàn)處理

田間試驗(yàn)設(shè)置胡麻種植1 a(T1)、連作2 a(T2)和連作3 a(T3)，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，每小區(qū)面積30 m2(6 m×5 m)。為防止小區(qū)間相互影響，小區(qū)間用寬60 cm、高50 cm土埂分隔。

1.3 土樣采集

在收獲后分別采集胡麻種植1 a、連作2 a和連作3 a的根際土壤，土壤樣品采集采用“S”型布點(diǎn)，保證6～8個采樣點(diǎn)，采樣土壤充分混合，剔除枯葉、腐葉等，每小區(qū)獲得2份土樣。每種處理的3個重復(fù)土樣充分混合，最終每種處理獲得2個土壤樣本，用四分法取適量土樣放入自封袋，迅速置于干冰上保存，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4 樣品DNA提取及高通量測序

準(zhǔn)確稱取0.1 g土樣，按照土壤微生物DNA提取試劑盒說明書步驟，分別提取各土樣的總DNA，Drop2000測定濃度和純度,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。設(shè)計(jì)帶有barcode的融合引物，針對細(xì)菌16S rRNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增特異性引物序列為338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA，806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2 %瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收PCR產(chǎn)物，并用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測,按照每個樣本測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合，合格樣品交由美吉生物醫(yī)藥科技公司進(jìn)行Miseq文庫構(gòu)建及高通量測序，測序平臺為PE300。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

測序后，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾處理，得到優(yōu)化序列，進(jìn)行OTU(Operational taxonomic uniits)聚類分析、Alpha多樣性分析、物種組成分析、Beta多樣性分析及物種差異分析。其中，序列拼接利用FLASH、序列過濾利用QIME，聚類利用UPARSE pipeline軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡麻不同連作年限下土壤細(xì)菌OTU分布

測序結(jié)果優(yōu)化后共獲得193 836條有效序列，按97%相似度歸并后通過OTU聚類分析得到1 861條OTU。對各土樣測序得到的OTU進(jìn)行分類，結(jié)果表明三類樣品中共有的OTU為1 578條，T1、T2和T3分別具有特異OTU為30、13和37條，僅T1和T2共有的OTU為45條，T1與T3共有而T2沒有的OTU為67條，T1不具有而T2和T3共有的OTU為91條(圖1)。

2.2 胡麻不同連作年限下土壤細(xì)菌物種多樣性分析

采用Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)對不同連作年限的胡麻根際土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性進(jìn)行分析，從而反映細(xì)菌群落的豐度和多樣性。由表1可知各樣本文庫覆蓋率均大于99.4%，說明測定結(jié)果能夠真實(shí)反映各樣本的細(xì)菌群落組成。不同處理樣本根際細(xì)菌多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)表現(xiàn)為T1>T2>T3，Simpson指數(shù)表現(xiàn)為T3>T2>T1，細(xì)菌群落豐度(Chao指數(shù)和Ace指數(shù))則表現(xiàn)T3>T1>T2，說明細(xì)菌多樣性隨著連作年限增加而降低，而細(xì)菌豐度先降低后再升高，且連作3 a的細(xì)菌豐度高于連作1 a。

表1 不同連作年限土壤中細(xì)菌的Alpha多樣性分析Table 1 Alpha bacteria diversity statistical in soil samples of different continuous cropping years

2.3 胡麻不同連作年限下土壤細(xì)菌物種豐富度分析

樣本檢測出的細(xì)菌主要分布在36個門，77個綱，144個目，259個科，428個屬，804個種。在門分類水平對土壤細(xì)菌分析發(fā)現(xiàn)，T1、T2和T3土壤具有的細(xì)菌門數(shù)分別為33、32個和35個，其中有31個細(xì)菌門三者所共有，T1和T2土壤內(nèi)的WWE3菌門在T3土壤內(nèi)未檢測到，T2土壤內(nèi)未檢測到T1和T3土壤內(nèi)的Peregrinibacteria菌門，衣原體門(Chlamydiae)、梭桿菌門(Fusobacteria)和BJ-169菌門只有在T3土壤內(nèi)檢測到(圖2A)。對土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌門(豐度占比>0.01)分析表明，3種土壤內(nèi)的優(yōu)勢菌門均為相同的12個菌門，但不同土壤內(nèi)各優(yōu)勢細(xì)菌門的相對豐度存在差異，相對豐度前四的優(yōu)勢菌門分別為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和綠灣菌門(Chloroflexi)(圖2B)。相對豐度第一的變形菌門隨著種植年限增長相對豐度逐年降低，其相對豐度分別為31.74%、27.69%和25.21%。酸桿菌門表現(xiàn)出先升高再降低，T3中的相對豐度比T1降低了35.76%。放線菌門相對豐度變化與變形菌門相反，表現(xiàn)出隨著種植年限增長相對豐度逐年升高，相對豐度分別為12.16%、15.38%和24.12%。綠灣菌門的相對豐度分別為9.58%、10.99%和11.82%，與放線菌門一樣，都是隨著種植年限增長而升高。T3土壤中擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度明顯低于T1和 T2，僅是T1和T2的29.82%和35.62%。芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)在T2和T3土壤內(nèi)的相對豐度接近，分別為4.98%和5.35%，但T1土壤內(nèi)相對豐度為8.02%，明顯高于T1和T2。后壁菌門(Firmicutes)在各土壤內(nèi)的相對豐度為T3(9.67%)>T1(3.29%)>T2(1.32%)。硝化螺旋菌門(Nitrospirae)在T1土壤內(nèi)相對豐度為2.99%，高于T2和T3土壤內(nèi)的相對豐度1.28 %和1.33%。疣微菌門(Verrucomicrobiae)和浮霉菌門(Planctomycetes)也隨著連作年限增長相對豐度逐漸增加，T3土壤內(nèi)其相對豐度分別達(dá)到1.57%和1.41%。另外藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)和Saccharibacteria菌門在T2土壤內(nèi)的相對豐度較高，分別為2.06%和1.02%(圖2B)。

圖2 門分類水平上不同連作年限土壤細(xì)菌物種相對豐度(A)及主要菌門(B)Fig.2 Relative abundance of different continuous cropping years of soil bacterial community(A)and major bacteria (B)at the level of phylum

2.4 胡麻連作對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響

對測序結(jié)果的主成分分析(Principal component analysis，PCA)發(fā)現(xiàn)，胡麻不同種植年限土壤細(xì)菌群落豐度差異比較明顯。如圖3A所示，土壤PC1貢獻(xiàn)率為38.81%，PC2的貢獻(xiàn)率為24.55%，T1分布在PC1的負(fù)值區(qū)域和PC2的正值區(qū)域，且分布集中，而T2分布于PC1和PC2的負(fù)值區(qū)域，分布相對較遠(yuǎn)，T3聚集到PC1和PC2的正值區(qū)域，樣本集中?；赪eighted Unifrac距離矩陣進(jìn)行聚類分析，如圖3B所示，T1和T2土壤聚為一類，T3土壤單獨(dú)分為一類，說明T1和T2土壤細(xì)菌群落差異相對小，隨著連作年限增長土壤細(xì)菌群落差異變大。

圖3 不同連作年限土壤中細(xì)菌群落β多樣性分析Fig.3 β diversity analysis of different continuous cropping years of soil bacterial communities

3 討論與結(jié)論

土壤內(nèi)細(xì)菌群落多樣性往往會伴隨連作障礙發(fā)生而改變。岳思君等[6]對不同連作年限硒砂瓜土壤群落研究發(fā)現(xiàn)，隨著連作年限增長，細(xì)菌菌群多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)都逐漸增加。林震等[19]也研究證明連作4 a苜蓿根際土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)高于0 a苜蓿。而高林等[7]對煙草連作土壤微生物群落分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)都隨著連作年限增長而下降。納小凡等[20]對枸杞種植研究表明，與對照樣地相比，連作地種植枸杞根際細(xì)菌群落α多樣性降低。大豆中也有證據(jù)表明，連作2 a根際土壤中細(xì)菌豐富度和多樣性指數(shù)低于連作0 a[14]。這種隨連作種植年限增長而細(xì)菌多樣性指數(shù)降低的現(xiàn)象也在黑胡椒、黃瓜、草莓和花生等作物中得到證實(shí)[21-24]。這些研究成果顯示，連作土壤根際中細(xì)菌群落多樣性的變化與栽培作物及連作年限相關(guān)，在特定的連作年限內(nèi)，有的隨連作年限而升高，有的隨連作年限而降低。本研究中胡麻連作土壤根際細(xì)菌群落的多樣性隨著連作年限而逐漸降低，但細(xì)菌豐度并未保持持續(xù)降低趨勢，而在連作3 a根際土壤內(nèi)豐富度指數(shù)最大，這與以上所示的研究成果都有所差異。

種植連作年限增加，土壤內(nèi)細(xì)菌群落差異也隨之改變，但不同作物連作對細(xì)菌群落影響也存在差別。煙草不同連作年限土壤細(xì)菌中變形菌門占比最高，放線菌門和泉古菌門的豐富度則隨著增加，細(xì)菌群落差異變大[7]。硒砂瓜連作土壤內(nèi)的優(yōu)勢菌門為放線菌門、變形菌門、綠灣菌門和酸桿菌門，放線菌門和酸桿菌門豐度隨著連作時間先增后降，變形菌門豐度隨著連作年限增長逐漸降低，而綠灣菌門豐度先降后增[6]。在大豆連作根際土壤細(xì)菌群落測定中發(fā)現(xiàn)，變形菌門和放線菌門豐度在連作2 a土壤中低于對照，而酸桿菌門和綠彎菌門豐度表現(xiàn)相反的趨勢[14]。這些已有的報(bào)道說明，不同作物種植土壤中各菌門的豐度存在差異，但放線菌門、變形菌門、酸桿菌門和綠灣菌門等一般都包含在優(yōu)勢菌門內(nèi)。番茄根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌門中也包含變形菌門和酸桿菌門[25]。本研究也得到相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在胡麻不同連作年限根際土壤內(nèi)的優(yōu)勢菌門數(shù)量和種類是相同的，但不同土壤中各菌門豐度不同。變形菌門和放線菌門在土壤中是有益的菌門，參與有機(jī)碳氮循環(huán)，在胡麻連作中，變形菌門豐度隨連作年限增長而降低，表現(xiàn)出與大豆、硒砂瓜等連作中相似的趨勢，不利于作物的生長，但放線菌門豐度卻表現(xiàn)出持續(xù)增高的趨勢，這與大豆連作中的趨勢相反，卻與煙草、硒砂瓜等連作中的早期趨勢相一致，說明隨著連作年限進(jìn)一步增長，胡麻根際土壤內(nèi)的放線菌門豐度很可能會表現(xiàn)出下降的趨勢，從而進(jìn)一步加劇連作障礙的危害。因此，今后繼續(xù)深入開展胡麻更長連作時間對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響研究，將對有效解決胡麻連作障礙十分必要。主成分分析表明，在胡麻不同種植年限的根際土壤內(nèi)，代表細(xì)菌群落分布的距離較遠(yuǎn)，說明群落結(jié)構(gòu)存在較顯著差異。進(jìn)一步的聚類分析顯示，相同連作年限的樣品聚集在一個分支，且隨連作年限增長樣品間聚類水平降低，說明連作改變細(xì)菌菌門所占比例，影響菌群結(jié)構(gòu)組成，這與煙草和黃花蒿連作土壤的研究結(jié)果一致[7,26]。本研究通過高通量測序分析了胡麻連作條件下根際土壤細(xì)菌群落的豐度及其變化規(guī)律，這些成果對改良胡麻種植技術(shù)及緩解連作障礙提供了理論基礎(chǔ)。