思茅松毛蟲2齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性

包書軍， 熊 智， 李雕益， 李選文， 熊忠平， 羅 曼

(1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)繼續(xù)教育學(xué)院，云南昆明 650224；3.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性學(xué)院，云南昆明 650224；4.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明 650224)

我國松毛蟲可分為7個屬82種，分別是松毛蟲屬()、云毛蟲屬、大毛蟲屬、小毛蟲屬、丫毛蟲屬、雜毛蟲屬、櫟毛蟲屬，而思茅松毛蟲屬于松毛蟲屬()，因最早在云南思茅地區(qū)發(fā)現(xiàn)而被命名為思茅松毛蟲，主要分布在我國四川、云南、廣東、江西、臺灣、安徽等省份，一年發(fā)生1～2代，以幼蟲危害最大，是我國南方重要松樹害蟲，主要危害松樹有思茅松、云南松、海南松、云南油杉、馬尾松和短葉松等，嚴(yán)重時可造成毀滅性災(zāi)害。

思茅松毛蟲的防治方法主要包括：生物防治、物理防治、化學(xué)防治等。生物防治是近年常用效果較好的方法，主要是利用微生物、激素等方法進(jìn)行防治；萬鷹等利用白僵菌粉噴灑于有思茅松毛蟲的樹上，研究白僵菌對思茅松毛蟲的防治效果，結(jié)果顯示，白僵菌的防治效果相對于其他3種藥劑要慢，但防治效果持久。物理防治是利用燈光誘集成蟲使其接觸高壓電而死亡，或利用人工摘繭除卵等的方法?；瘜W(xué)防治是指利用化學(xué)藥劑殺滅害蟲的方法，通常使用的化學(xué)藥劑有50%馬拉硫磷乳劑、殺螟松乳劑等，每年的4—6月在大面積防治中使用濃度為20%殺滅菊酯較為適用。

微生物研究一直是人們研究的熱點，其中，昆蟲腸道微生物也是人們的研究焦點之一，且隨著測序技術(shù)的不斷提升和發(fā)展，對于微生物的識別更加迅速和準(zhǔn)確。昆蟲腸道微生物的數(shù)量和種類均非常多，且腸道微生物對機體的發(fā)育、生理、營養(yǎng)吸收等均有巨大影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗時間：2018年10月至2019年5月。試驗地點：云南省安寧市草鋪鎮(zhèn)森林地區(qū)(24°31′～25°6′ N，102°8′～102°37′ E)，平均海拔1 968 m。

試驗樣本為思茅松毛蟲2齡幼蟲，根據(jù)安寧市森林的情況在采集地方圓1 km范圍內(nèi)隨機挑選10個樣品點，每個樣品點采集10頭健康的2齡幼蟲，總計100頭，采集樣本的同時將樣本所在的樹枝帶回實驗室，用于2齡幼蟲飼養(yǎng)，為后續(xù)研究做準(zhǔn)備。

1.2 分離培養(yǎng)基與試劑、儀器

分離培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

主要試劑：培養(yǎng)基及生理生化鑒定所用分析純、化學(xué)試劑(西隴化工股份有限公司)，Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，PCR擴增體系試劑(碩擎生物科技有限公司)。

主要儀器：YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、AL204電子天平(Mettler-Toledo Group)、SW-CI超凈工作臺(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、HHB11電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)科技儀器廠)、Haier冷藏柜、HH-2數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(金壇市丹瑞電器廠)DHG-9053A型、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、ZHWY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)、Galanz微波爐、Midea電磁爐、70型離子交換純水器(上海南華醫(yī)療器械廠)、SZ-96自動純水器(上海亞榮生化儀器廠)、FM130制冰機(GRANT)、微量移液器(2.5、10.0、50.0、200.0、1 000 μL)(芬蘭Finnpipette)、HBA-1960 PCR擴增儀(MJ RESEARCH)、DYY-8C電泳儀及電泳槽(北京市六一儀器廠)、凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad公司，Gel-Doc XR+)。

1.3 腸道細(xì)菌的分離純化

選取100頭健康的2齡幼蟲，試驗前饑餓處理40 h即在恒溫22～24 ℃、恒濕80%～85%條件下，無菌水喂養(yǎng)幼蟲，40 h后待其排空體內(nèi)食物殘渣后進(jìn)行試驗。將試驗幼蟲置于冰上3～5 min，待其昏迷；采用70%乙醇擦拭幼蟲體表30 s，無菌水沖洗 2～3遍，0.1%HgCl棉球擦拭幼蟲體表10 s，無菌水沖洗4～5次，在超凈工作臺中將體表消毒好的幼蟲固定于無菌蠟盤上，使用滅菌后的細(xì)尖鉗將幼蟲腹部剖開，取出整個腸道，并立即用0.9%無菌NaCl溶液沖洗表面2次，然后將腸道取出放入無菌離心管中，并向離心管中加入1 mL PBS緩沖液研磨成勻漿，備用。

吸取上述腸道勻漿1 mL置于9 mL PBS緩沖液中，稀釋成10，按照10倍梯度稀釋至10，吸取每個濃度稀釋液100 μL分別涂布于NA培養(yǎng)基中，每個梯度涂3個平板，作為試驗組。取最后一次清洗的無菌水100 μL涂布于NA培養(yǎng)基上，作為試驗空白對照組。將涂布均勻的培養(yǎng)平板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)72 h后觀察空白對照是否有菌落形成，若無菌落長出，則選擇單菌落數(shù)在30～300的培養(yǎng)皿，根據(jù)涂有腸道內(nèi)容物懸液培養(yǎng)皿上單菌落的不同形態(tài)特征，挑選單菌落移至新的NA培養(yǎng)基平板上，采用分三區(qū)的劃線法進(jìn)行菌株純化，直至菌株形態(tài)基本一致，得到純菌株。將得到的菌種保藏于NA斜面培養(yǎng)基中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 2齡幼蟲腸道可培養(yǎng)菌株的形態(tài)觀察

將經(jīng)分離純化得到的純菌株用平板劃線法接種于新的NA平板上，在37 ℃下培養(yǎng)24～48 h，待菌落長成后，對菌落進(jìn)行染色并參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌落特征進(jìn)行描述。

1.5 2齡幼蟲腸道可培養(yǎng)菌株的生理生化鑒定

按照《現(xiàn)代微生物學(xué)實驗技術(shù)》、《微生物學(xué)實驗教程》等微生物生理生化鑒定的方法，對2齡幼蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定。

1.6 2齡幼蟲腸道細(xì)菌16S rDNA分子鑒定

1.6.1 腸道細(xì)菌基因組DNA提取及PCR擴增 在NA培養(yǎng)基上活化分離得到的純菌株，然后接種至液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)、離心、收集菌體，利用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取2齡幼蟲腸道細(xì)菌基因組DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測提取出的細(xì)菌基因組DNA，得到的片段大小符合細(xì)菌基因組DNA后，再將檢測合格的DNA產(chǎn)物作為16S rDNA序列擴增模板。擴增引物選擇：正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR擴增體系為：25.0 μL的2×PCR MasterMix；3.0 μL的模板DNA；10.0 μmol/L 正向引物27F和反向引物1492R各1.0 μL；雙蒸水補充至50.0 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，-20 ℃保存。取 4.0 μL PCR擴增后的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，將檢測合格的PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6.2 2齡幼蟲腸道細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 通過DNA MAN6.0軟件進(jìn)行矯正及拼接測得的序列，然后將拼接完成的16S rDNA序列在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/中與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST同源性比對，選出與菌株相似度最高的序列，運用軟件MEGA 7.0構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，判定其分類學(xué)關(guān)系。

1.7 分離率與群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

(1)分離率與相對分離率，分別衡量的是2齡幼蟲腸道細(xì)菌豐富度和某種2齡幼蟲腸道細(xì)菌的優(yōu)勢度。分離率指從樣品中分離純化得到的菌株數(shù)與全部樣本蟲數(shù)的比值；相對分離率指分離到的某種2齡幼蟲腸道細(xì)菌株數(shù)占分離到的總菌株數(shù)的百分率。

(2)群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

多樣性指數(shù)的計算公式如下：

③Margalef豐富度指數(shù)：=(-1)/ln；

上述3個公式中，表示某個2齡幼蟲腸道細(xì)菌的種類數(shù)，表示某個2齡幼蟲腸道細(xì)菌的總量，表示某種2齡幼蟲腸道細(xì)菌的相對分離率。

2 結(jié)果與分析

2.1 2齡幼蟲腸道細(xì)菌的分離結(jié)果

從100頭2齡幼蟲腸道中共分離得到115株細(xì)菌，分離率達(dá)115.00%。根據(jù)菌落的形態(tài)特征共有8個類群，整理編號得：N201～N208。

2.2 2齡幼蟲腸道細(xì)菌形態(tài)特征

對分離得到的8株細(xì)菌的菌落特征與革蘭氏染色結(jié)果進(jìn)行觀察，結(jié)果(表1)表明，8株菌株中多數(shù)菌株的革蘭氏染色結(jié)果呈陽性，僅有1株呈陰性。且大部分菌株為桿狀，僅有N207、N208為球狀，N202為擬球狀；大部分菌株邊緣整齊且不透明，只有N206、N207半透明；多數(shù)菌株表面光滑濕潤。

表1 2齡幼蟲腸道細(xì)菌的菌落形態(tài)特征

2.3 2齡幼蟲腸道細(xì)菌生理生化鑒定及多樣性分析

經(jīng)過對生理生化指標(biāo)(表2)的聚類分析可知，在歐氏距離4.8左右處，可將8個細(xì)菌類群劃分為2個遺傳聚類組，N204自成一類，其他7個細(xì)菌類群為一類，其中，N201、N206屬于一類，N202、N203、N205、N207、N208屬于另一類(圖1)。

表2 2齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的生理生化特征

結(jié)合生理生化指標(biāo)、細(xì)菌的形態(tài)特征、菌落及顯微形態(tài)特征，查詢細(xì)菌鑒定手冊后，將分離到的8種細(xì)菌形態(tài)，初步鑒定為，N201、N206均屬于腸桿菌屬sp.，N202、N207、N208為葡萄球菌屬sp.，N203、N203為芽孢桿菌屬sp.，N204為棒狀桿菌屬sp.，部分菌株因為菌種形態(tài)過于相似，需進(jìn)一步進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)鑒定。

由表1可知，115株2齡幼蟲腸道細(xì)菌中，葡萄球菌屬sp.(N202、N207和N208)相對分離率為48.00%，是思茅松毛蟲2齡幼蟲腸道細(xì)菌的優(yōu)勢菌群。另外，思茅松毛蟲2齡幼蟲腸道細(xì)菌的Shannon多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)、Margalef豐富度指數(shù)分別為2.052 6、0.868 2、1.475 3，說明思茅松毛蟲2齡幼蟲腸道細(xì)菌具有豐富的多樣性。

2.4 2齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌16S rDNA分析結(jié)果

將所獲8種細(xì)菌形態(tài)2齡幼蟲腸道細(xì)菌16S rDNA序列在GenBank中注冊，獲得GenBank登錄號。由表3可知，分離到的2齡幼蟲腸道細(xì)菌與相應(yīng)菌株的16S rDNA序列相似度在97%～99%。115株細(xì)菌隸屬于4個屬、8個類群，初步鑒定為，N201為阿氏腸桿菌，N202為木糖葡萄球菌，N203為枯草芽孢桿菌，N204為嗜甘氨酸棒狀桿菌，N205為阿氏芽孢桿菌，N206為腸桿菌屬sp，N207為科氏葡萄球菌，N208為表皮葡萄球菌，這些思茅松毛蟲2齡幼蟲腸道細(xì)菌均不能確定其真正的種屬地位，需要做進(jìn)一步研究以鑒定其分類學(xué)地位。

表3 2齡幼蟲腸道細(xì)菌GenBank登錄號及最大相似菌株

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹

將2齡幼蟲腸道細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖2可知，思茅松毛蟲2齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌歸屬于3個大類，第一大類為厚壁菌門，分別為：芽孢桿菌屬sp.、葡萄球菌屬sp.；第二大類為變形菌門，為腸桿菌屬sp.；第三大類為放線菌門，為棒狀桿菌屬sp.。

3 結(jié)論與討論

思茅松毛蟲對思茅松等松科植物有嚴(yán)重危害，由于對松科植物的危害而對林業(yè)造成巨大的損失，對生態(tài)環(huán)境和人類生產(chǎn)生活造成巨大影響。本研究以思茅松毛蟲2齡幼蟲為研究材料，通過對2齡幼蟲腸道中的可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行菌落觀察、生理生化實驗和16S rDNA同源性分析，共分離得到115株腸道可培養(yǎng)細(xì)菌，初步推測隸屬于4個屬、8個類群。通過對腸道細(xì)菌的相對分離率進(jìn)行分析，葡萄球菌屬的相對分離率最高，為48.00%，是2齡幼蟲腸道細(xì)菌的優(yōu)勢菌屬。通過對其多樣性做一步分析，得到腸道可培養(yǎng)細(xì)菌具有豐富的多樣性。

不同地域的思茅松毛蟲腸道細(xì)菌種類存在一定差異。本次試驗樣品2齡思茅松毛蟲幼蟲采集地為云南安寧地區(qū)，結(jié)果顯示2齡思茅松毛蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌有115株，屬于sp.、sp.、sp.、sp.；張武先等利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法從采自云南思茅地區(qū)的思茅松毛蟲2齡幼蟲腸道內(nèi)分離出了5株好氧細(xì)菌屬于sp.。

同一區(qū)域不同齡期思茅松毛蟲腸道微生物種類不盡相同。李選文等從云南安寧采集的思茅松毛蟲6齡幼蟲，從腸道內(nèi)分離出104株菌，隸屬于芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、蒼白桿菌屬、短芽孢桿菌屬、微球菌屬、莫拉菌屬、棲水菌屬、土壤芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、普羅威登斯菌屬?？盗葟脑颇侠ッ鞑杉】档乃擅x，實驗室人工飼養(yǎng)至3齡然后在其腸道內(nèi)分離出11株細(xì)菌，分別屬于sp.、sp.、sp.、sp.、sp.。孫佑赫等從采自普洱地區(qū)的4齡幼蟲腸道內(nèi)分離出11株細(xì)菌，分別屬于sp.、sp.、sp.、sp.、sp.、sp.。王金華等從采自普洱的5齡幼蟲腸道內(nèi)分離出10株細(xì)菌，分別屬于sp.、sp.、sp.、sp.。孫佑赫等從采自普洱市的6齡幼蟲腸道內(nèi)分離出6株細(xì)菌，分別屬于sp.，sp.。馬艷芳等從采自普洱市的7齡幼蟲腸道內(nèi)分離出14株細(xì)菌，分別屬于sp.、sp.、sp.、sp.。

昆蟲通常通過環(huán)境和食物獲取各類微生物，所以不同的生長環(huán)境及食物使幼蟲攝入體內(nèi)的細(xì)菌不同，從而影響幼蟲腸道細(xì)菌的種類。研究發(fā)現(xiàn)極端堿性條件不利于絕大多數(shù)細(xì)菌的生長，也有些細(xì)菌能在極端堿性條件下生活，如腸球菌能在pH值卻高達(dá)11～12的鱗翅目幼蟲中腸里生活，說明腸球菌可能以某種方式緩沖腸道極端pH值。本研究通過對2齡幼蟲的腸道細(xì)菌分離得到了包含球菌在內(nèi)的8個類群細(xì)菌，這為防治思茅松毛蟲提供了依據(jù)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可以通過宏基因?qū)W技術(shù)直接提取腸道細(xì)菌的總DNA，進(jìn)而分析出整個腸道的細(xì)菌種類，使得對昆蟲的腸道微生物的研究更加方便。本次試驗通過純培養(yǎng)技術(shù)分離得到的2齡幼蟲腸道細(xì)菌只是腸道細(xì)菌中很少的一部分，需要結(jié)合宏基因組技術(shù)，才能得到較為全面的細(xì)菌類群。

思茅松毛蟲是林業(yè)重要的害蟲，尤其是對松科植物危害十分嚴(yán)重，對其腸道微生物進(jìn)行研究，不僅可以補充昆蟲腸道微生物資源庫，還可以據(jù)此進(jìn)一步分析腸道細(xì)菌對昆蟲生長發(fā)育的影響，最終得到防治思茅松毛蟲的生物制劑，從而減少林業(yè)害蟲的危害。