陳芊如, 丁蓬勃, 胡希好, 趙福彬, 邰振益, 趙忠利, 劉宗霞, 李義強(qiáng), 鄒 平
(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,山東青島 266000; 2.山東青島煙草有限公司,山東青島 266000)
煙草是一種喜溫植物,其最適生長溫度范圍是25~28 ℃,當(dāng)溫度下降至12 ℃以下時,煙草出苗率下降,苗期生長緩慢。低溫脅迫下,煙草幼苗體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧(ROS),生理代謝發(fā)生紊亂,葉片光合速率下降,能量產(chǎn)生和物質(zhì)代謝受阻,最終導(dǎo)致植株葉片萎蔫甚至死亡。在福建省、江西省等南方煙區(qū),在早春常有倒春寒等低溫危害發(fā)生;在西南、黃淮、東北煙區(qū),苗床期低溫寡照的情況也時常發(fā)生,導(dǎo)致移栽后煙苗質(zhì)量差,還苗期延長,煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量受到影響。因此,如何緩解低溫脅迫對煙草植株尤其是煙草幼苗的傷害是煙草生產(chǎn)中亟待解決的問題。
幾丁質(zhì)(別稱甲殼素)是一種天然聚合物,在地球上含量非常豐富,幾丁質(zhì)脫乙?;蠼到猱a(chǎn)生殼寡糖(COS)。殼寡糖是一種水溶性的堿性寡糖,也是一種海洋來源生物刺激素,能夠促進(jìn)植物生長,增強(qiáng)植物的抗病性和抗逆性。研究表明,殼寡糖能夠通過增強(qiáng)植株光合作用及抗氧化酶活性提高油菜、甘蔗、玉米、花生等作物的抗旱性。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),殼寡糖能夠通過調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)及滲透調(diào)節(jié)提高小麥幼苗的抗鹽性;還能夠增強(qiáng)小麥光合作用及抗氧化能力,從而提高小麥低溫抗性。在煙草上,相關(guān)文獻(xiàn)報道,殼寡糖能夠誘導(dǎo)煙草對煙草花葉病毒(TMV)的侵染產(chǎn)生系統(tǒng)抗性;對煙草赤星病病原菌菌絲生長、孢子萌發(fā)、產(chǎn)孢量均有一定的抑制作用;但對殼寡糖能否提高煙草抗低溫脅迫的研究還未見報道。針對煙草幼苗易受冷害影響的生產(chǎn)實(shí)際問題,本試驗(yàn)選用低溫敏感的煙草品種為材料,研究低溫脅迫下殼寡糖對煙草幼苗生理指標(biāo)的影響,以期為煙草苗期栽培管理提供理論和技術(shù)依據(jù)。
供試煙草資源為H382,屬于低溫敏感材料,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所國家煙草種質(zhì)資源中期庫提供。殼寡糖(脫乙酰度>95%,聚合度3~10)購自肇慶市生物科技有限公司。試驗(yàn)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所人工氣候箱中進(jìn)行,試驗(yàn)時間為2020年10—12月。
1.2.1 培養(yǎng)方法 用1%次氯酸鈉溶液將H382種子消毒10 min,再用蒸餾水反復(fù)沖洗后晾干,點(diǎn)種至育苗盤。待煙草幼苗長到4葉期時,將長勢一致的煙苗移栽到直徑為10 cm的塑料盆中,放入光照時間為14 h、晝/夜溫度為25 ℃/20 ℃、光照度為 800 μm/(m·s)、相對濕度為(65±5)%的人工氣候培養(yǎng)箱中。
待煙草幼苗長出第6張葉片時,將其隨機(jī)分為3組(每組20盆)。對照組(CK)于人工氣候培養(yǎng)箱25 ℃培養(yǎng);低溫脅迫組于人工氣候培養(yǎng)箱4 ℃培養(yǎng),并分別噴施0(Chilling stress)、50(T1)、100(T2)、500 mg/L(T3)殼寡糖,24 h后移到4 ℃人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在低溫脅迫后24、48、72 h取葉片,迅速放入液氮中速凍,并置于-80 ℃超低溫冰箱中保存,用以測定各項(xiàng)生理指標(biāo),每個處理3次重復(fù)。在低溫脅迫7 d后,進(jìn)行樣品采集測定其生物量。
采用 SPSS(version 19.0)軟件中的Duncan’s多重比較分析法,對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
從圖2可以看出,低溫脅迫下,煙草幼苗體內(nèi)MDA含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢,在脅迫24、48、72 h時,MDA含量分別比對照組高47.3%、62.9%、67.4%。殼寡糖處理能夠顯著降低煙草葉片中MDA含量,其中,100 mg/L殼寡糖效果最好,其處理組MDA含量顯著降低,與對照組沒有顯著性差異。在處理24、48、72 h時,T2處理組MDA含量分別比低溫脅迫組低26.6%、34.4%、37.6%(圖2-A)。隨著低溫處理時間的不斷延長,煙草幼苗中脯氨酸含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在脅迫24、48 h 時,脯氨酸含量分別是對照組的1.37、1.85倍;脅迫72 h時脯氨酸含量有所下降,但仍然是對照組的1.48倍。在低溫脅迫下,施用不同濃度殼寡糖能夠顯著增加煙草葉片脯氨酸含量。其中,100 mg/L 殼寡糖處理組脯氨酸含量顯著高于其他濃度處理組,在處理24、48、72 h時,脯氨酸含量分別比低溫脅迫組高37.2%、19.6%、40.1%(圖2-B)。
從圖3可以看出,低溫脅迫24、48、72 h后,煙草幼苗葉片可溶性糖含量先升高后降低。在24、48 h 時,煙草葉片可溶性糖含量比對照組分別升高12.9%、12.7%;脅迫72 h后,煙草葉片可溶性糖含量比對照組略低,但與對照組之間無顯著性差異。不同濃度殼寡糖處理后,煙草葉片可溶性糖含量顯著升高;其中100 mg/L殼寡糖處理組在24、48、72 h時,可溶性糖含量比低溫脅迫組分別高19.9%、28.1%、64.6%(圖3-A)。在低溫脅迫下,煙草幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢;施用外源殼寡糖可以顯著提高煙草葉片可溶性蛋白含量(圖3-B)。
低溫脅迫下,煙草幼苗葉片中的SOD、POD、CAT及APX活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在低溫脅迫24、48 h時,SOD活性分別比對照組高30.3%、26.1%(圖4-A);POD活性分別比對照組高12.6%、26.3%(圖4-B);CAT活性分別比對照組高45.0%、53.1%(圖5-A);APX活性分別比對照組高24.5%、33.1%(圖5-B)。在低溫脅迫 72 h 后,SOD、POD、CAT及APX活性均有所下降。不同濃度殼寡糖處理能夠繼續(xù)提升SOD、POD、CAT及APX活性。在100 mg/L殼寡糖處理的24、48、72 h 時,SOD活性分別比低溫脅迫組高48.0%、70.4%、124.3%(圖4-A);POD活性分別比低溫脅迫組高36.0%、47.0%、92.2%(圖4-B);APX活性分別比低溫脅迫組高13.9%、35.1%、51.6%(圖5-A);APX活性分別比低溫脅迫組高59.6%、69.0%、79.6%(圖5-B)。可見,施用外源殼寡糖可以顯著提高煙草幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性,其中,100 mg/L殼寡糖處理組中煙草幼苗抗氧化酶活性最高。
對煙草幼苗繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)及低溫脅迫,在培養(yǎng)7 d時,處理組間煙苗表型差異明顯,低溫脅迫下,煙草幼苗長勢緩慢,植株矮小,葉片出現(xiàn)萎蔫。與對照組相比,煙草幼苗根長減少41.0%,地上部分和根系的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別減少22.5%、24.9%和45.4%、49.1%(表1)。噴施不同濃度殼寡糖溶液能夠緩解低溫脅迫對煙草幼苗的傷害,促進(jìn)植株與根系生長。從表1可以看出,殼寡糖處理能夠顯著增加根長,顯著提高煙草幼苗地上部分以及根系的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量。其中,100 mg/L殼寡糖處理后,煙草幼苗根系的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量與其他濃度殼寡糖處理組差異顯著。
表1 低溫脅迫下殼寡糖對煙草幼苗生物量的影響
植物在逆境脅迫下細(xì)胞滲透勢會發(fā)生改變。植物通過積累可溶性糖和可溶性蛋白等小分子物質(zhì),來降低細(xì)胞的水勢,維持細(xì)胞內(nèi)水分平衡和膜的穩(wěn)定性,從而動態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢;同時,糖類是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要組成部分,而且是能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。周培祿通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析發(fā)現(xiàn),在低溫脅迫下煙草氮代謝和糖代謝增強(qiáng),提高了細(xì)胞內(nèi)游離氨基酸和其他含氮物質(zhì)甜菜堿的含量,增加了可溶性糖含量,從而調(diào)節(jié)了細(xì)胞滲透式,維持細(xì)胞水分平衡,提高了煙草抗寒性。本試驗(yàn)中低溫脅迫24、48 h時,煙草幼苗體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均明顯增加;而在脅迫72 h時,含量則開始下降,這可能是因?yàn)榈蜏匾种屏酥参矬w內(nèi)酶活,造成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成和代謝受阻。外源施用殼寡糖可以進(jìn)一步顯著提高煙草幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量,有助于維持植物的滲透平衡和細(xì)胞膜穩(wěn)定性。有研究表明,低溫脅迫下,噴施殼寡糖可以增加小麥體內(nèi)可溶性糖含量,減弱低溫對植物組織液的冷滯效應(yīng),保證細(xì)胞中溶質(zhì)的流動性。
在逆境脅迫下,脯氨酸發(fā)揮著多種生理學(xué)功能,游離脯氨酸具有強(qiáng)親水性,能夠降低細(xì)胞水勢,緩解逆境脅迫造成的細(xì)胞脫水;脯氨酸還能夠與蛋白質(zhì)形成輸水的骨架,保護(hù)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,維護(hù)植物體內(nèi)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整。有研究表明,外源施用脯氨酸能夠提高植物抗氧化酶活性,增強(qiáng)植株光合作用從而提高植物抗鹽性。有趣的是,脯氨酸處理組植株中內(nèi)源脯氨酸含量升高,可溶性糖含量降低,說明脯氨酸可能限制了鹽脅迫植物對可溶性糖合成的需要,而由脯氨酸起重要的滲透保護(hù)作用。本試驗(yàn)中低溫脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的脯氨酸含量高于對照組,殼寡糖處理進(jìn)一步提高了低溫脅迫下煙草幼苗的脯氨酸含量,以緩解低溫導(dǎo)致的滲透脅迫。外源施用褐藻寡糖、水楊酸、調(diào)環(huán)酸鈣均可以提高低溫脅迫下煙苗幼苗體內(nèi)的脯氨酸含量,緩解低溫造成的滲透脅迫,提高植物抵抗低溫脅迫的能力。
綜上所述,施用外源殼寡糖可以降低低溫脅迫對煙草幼苗的氧化損傷,增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量,增強(qiáng)植株抗氧化活性,從而緩解煙草幼苗在低溫環(huán)境下受到的傷害。低溫脅迫下,殼寡糖對煙草幼苗的保護(hù)作用,為緩解煙草應(yīng)對倒春寒等低溫災(zāi)害提供了良好的思路。其中,100 mg/L殼寡糖對低溫脅迫下煙草幼苗的緩解作用最強(qiáng),高濃度殼寡糖緩解效果反而降低;因此,在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中,考慮到效益及成本,100 mg/L殼寡糖是最優(yōu)選擇。為了更好地研究殼寡糖對煙草抗低溫能力的影響,其低溫緩解效應(yīng)的分子機(jī)制、品種的響應(yīng)差異還有待進(jìn)一步研究闡明。