N末端乙酰轉(zhuǎn)移酶Naa20抑制植物發(fā)育時(shí)相的轉(zhuǎn)變

馮金林， 姚麗霞， 秦銘徽

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/植物分子與環(huán)境脅迫響應(yīng)山西省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西臨汾 041004)

在真核生物中，蛋白質(zhì)N末端乙?；揎?N-terminal acetylation，NTA)是一種非常普遍的共價(jià)修飾。蛋白質(zhì)NTA是由一系列的N末端乙酰轉(zhuǎn)移酶(N-terminal acetyltransferase，Nat)催化完成的，Nat以乙酰輔酶A作為乙?；鶊F(tuán)的供體，對(duì)蛋白質(zhì)N末端的α氨基進(jìn)行乙?；揎?，這種修飾主要是共翻譯修飾。不同的蛋白質(zhì)NTA的生物學(xué)意義是不同的，包括調(diào)節(jié)蛋白的穩(wěn)定性、介導(dǎo)蛋白和蛋白之間的相互作用、影響蛋白的亞細(xì)胞定位等。擬南芥中有7種Nat，依次命名為Naa10～Naa70。已有研究表明，Naa10在植物胚胎發(fā)育過(guò)程中起了不可缺少的作用，Naa10缺失突變體表現(xiàn)出胚胎致死的表型。Naa20缺失突變體表現(xiàn)出植物生長(zhǎng)的抑制，并且對(duì)鹽脅迫和滲透脅迫敏感。Naa30缺失突變體表現(xiàn)出光合效率的降低。Naa40在植物中的作用尚未報(bào)道。Naa50缺失突變體表現(xiàn)出根發(fā)育的缺陷和對(duì)ABA脅迫的敏感。Naa60蛋白定位于細(xì)胞膜，在植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Naa70是植物特異的葉綠體定位的N末端乙酰轉(zhuǎn)移酶。

高等植物的胚后發(fā)育主要包括營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)2個(gè)階段。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，植物會(huì)經(jīng)歷幼年態(tài)向成年態(tài)的轉(zhuǎn)變，只有成年態(tài)的植物在合適的外界環(huán)境刺激下才會(huì)被誘導(dǎo)開花，進(jìn)而進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段。植物幼年態(tài)向成年態(tài)以及成年態(tài)向開花的生理轉(zhuǎn)變受到嚴(yán)格且復(fù)雜的調(diào)控，它能夠保證植物的繁殖以及后代的延續(xù)。在植物幼年態(tài)向成年態(tài)轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，microRNA156和它的靶基因發(fā)揮了重要的作用。在幼年態(tài)的葉片中，葉片背面沒(méi)有表皮毛，microRNA156基因高水平表達(dá)，其靶基因的表達(dá)量較低；隨著發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，microRNA156基因的表達(dá)量逐漸降低，其靶基因的表達(dá)量逐漸升高，促進(jìn)植物由幼年態(tài)向成年態(tài)的轉(zhuǎn)變，成年態(tài)的葉片背面開始出現(xiàn)表皮毛。擬南芥中HST(HASTY)是人輸出蛋白5(Exportin-5)的同源蛋白，參與植物microRNA156從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，其突變體()植株表現(xiàn)出幼年態(tài)向成年態(tài)轉(zhuǎn)變的提前，并且開花時(shí)間也提前。

本研究通過(guò)對(duì)N末端乙酰轉(zhuǎn)移酶基因缺失突變體的表型進(jìn)行觀察，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)、遺傳學(xué)分析和酵母雙雜交試驗(yàn)，表明Naa20與Naa25具有直接的相互作用，通過(guò)調(diào)控HST進(jìn)而抑制植物幼年態(tài)向成年態(tài)的轉(zhuǎn)變以及調(diào)控開花時(shí)間，在植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期轉(zhuǎn)變和生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料和試劑

擬南芥野生型種子和突變體(CS814943)、(GK-134G09)和(CS24279)的種子背景為哥倫比亞生態(tài)型(Col-0)，購(gòu)自Arabidopsis Biological Resource Center。轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)所用的包含GFP標(biāo)簽的pCAMBIA1300載體為實(shí)驗(yàn)室前期保存。

植物培養(yǎng)基所用MS鹽、Phytagel，均購(gòu)自Sigma公司；RNA提取試劑、載體構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶和T連接酶，均購(gòu)自全式金公司；RNase-free DNase，購(gòu)自Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 突變體轉(zhuǎn)錄本水平的鑒定 將野生型和突變體的種子用75%乙醇消毒2 min，用滅菌水洗3次，4 ℃處理3 d，然后點(diǎn)種子到MS培養(yǎng)基上，在長(zhǎng)日照培養(yǎng)箱(22 ℃，16 h光照；18 ℃，8 h黑暗)培養(yǎng)8 d。取野生型和突變體的幼苗100 mg，提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以獲得的cDNA作為模板，以基因特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以Actin作為內(nèi)參基因。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.2 突變體表型分析 將消毒后的擬南芥種子4 ℃處理3 d后，點(diǎn)種子到MS培養(yǎng)基上，在長(zhǎng)日照培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 d，然后將擬南芥幼苗移栽到土里(蛭石和營(yíng)養(yǎng)土按照體積比1 ∶1混勻)，在長(zhǎng)日照植物培養(yǎng)間繼續(xù)培養(yǎng)，直至開花。對(duì)開花植物的葉片數(shù)和第1朵花開的天數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，同時(shí)在體視顯微鏡下對(duì)葉片背面是否有表皮毛的葉片數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。將和突變體分別與突變體進(jìn)行雜交，之后自交分別獲得和的雙重突變體。試驗(yàn)時(shí)間為2019年1月至2021年1月，試驗(yàn)地點(diǎn)為山西師范大學(xué)3號(hào)樓植物培養(yǎng)間。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)試驗(yàn) 以野生型8 d幼苗的cDNA作為模板，以基因特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得帶有Ⅰ和HⅠ酶切位點(diǎn)的的CDS(coding sequence)；以野生型的DNA作為模板，以基因啟動(dòng)子特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得帶有Ⅰ和Ⅰ酶切位點(diǎn)的基因自身啟動(dòng)子序列(ATG上游1 080 bp)；用Ⅰ和HⅠ對(duì)包含GFP標(biāo)簽的pCAMBIA1300載體進(jìn)行雙酶切，與Ⅰ和HⅠ雙酶切的的CDS序列以及Ⅰ和Ⅰ雙酶切的自身啟動(dòng)子序列進(jìn)行連接，測(cè)序正確后最終獲得p：：(CDS)-GFP的載體構(gòu)建，引物序列見表1。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，通過(guò)浸花法對(duì)突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行篩選，直到獲得單拷貝純合轉(zhuǎn)基因恢復(fù)株系，并進(jìn)行表型的觀察。

1.2.4 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位觀察 將生長(zhǎng)5 d的轉(zhuǎn)基因恢復(fù)植株的根放置到激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus Corporation，F(xiàn)V1000S)下，用488 nm的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，收集綠色熒光信號(hào)。

1.2.5 酵母雙雜交試驗(yàn) 將和基因的CDS序列分別構(gòu)建到pGADT7和pGBKT7載體上，將構(gòu)建好的載體共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，在二缺培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中缺失亮氨酸和色氨酸)上進(jìn)行篩選，將二缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落轉(zhuǎn)移到三缺培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中缺失亮氨酸、色氨酸和組氨酸)進(jìn)行相互作用的檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2017對(duì)本試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥naa20突變體表現(xiàn)出幼年態(tài)向成年態(tài)轉(zhuǎn)變提前和開花提前的表型

為了探究Naa20在植物發(fā)育過(guò)程中的作用，我們從ABRC購(gòu)買到基因的2個(gè)T-DNA插入突變體，分別將其命名為和(圖1-A)。轉(zhuǎn)錄本水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，基因的表達(dá)在和突變體中幾乎完全缺失(圖1-B)。對(duì)突變體的表型觀察發(fā)現(xiàn)，和突變體均表現(xiàn)出明顯的開花提前的表型(圖1-C和表2)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，和突變體中幼年態(tài)的葉片和成年態(tài)的葉片數(shù)目均少于野生型(表2)。為了進(jìn)一步確定突變體的表型是由于基因表達(dá)缺失所引起的，將融合GFP標(biāo)簽的野生型基因轉(zhuǎn)入突變體中，轉(zhuǎn)基因株系(Com-3和Com-8)可以恢復(fù)突變體幼年態(tài)向成年態(tài)轉(zhuǎn)變提前和開花時(shí)間提前的表型(表2)。以上結(jié)果說(shuō)明，Naa20可以抑制植物從幼年態(tài)向成年態(tài)的轉(zhuǎn)變，并且抑制植物過(guò)早開花。

表2 不同基因型植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變和開花時(shí)間的統(tǒng)計(jì)

2.2 Naa20蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)

利用融合GFP標(biāo)簽的轉(zhuǎn)基因恢復(fù)株系對(duì)Naa20蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行觀察，在擬南芥的根細(xì)胞中Naa20蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)，這與Naa20共翻譯修飾的功能一致(圖2)。

2.3 Naa20與Naa25具有直接的相互作用

在酵母和人細(xì)胞中，Naa20與輔助亞基Naa25形成一個(gè)復(fù)合體，對(duì)底物蛋白進(jìn)行N末端乙?；揎?，為了探究在擬南芥中Naa20是否與Naa25具有相互作用，進(jìn)行了酵母雙雜交試驗(yàn)，結(jié)果表明Naa20和Naa25具有直接的相互作用(圖3)，說(shuō)明Naa20和Naa25存在于同一個(gè)復(fù)合體中發(fā)揮作用。

2.4 Naa20通過(guò)HST調(diào)控植物幼年態(tài)向成年態(tài)的轉(zhuǎn)變和開花時(shí)間

HST作為microRNA156的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在其核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。突變體表現(xiàn)出幼年態(tài)向成年態(tài)轉(zhuǎn)變提前、開花時(shí)間提前的表型。為了分析Naa20與HST在遺傳學(xué)上的關(guān)系，獲得了雙重突變體，雙突變體表現(xiàn)出與hst單突變體相似的表型(圖4和表3)。因此，HST位于Naa20的下游，調(diào)控植物發(fā)育時(shí)相的轉(zhuǎn)變。

表3 naa20突變體和hst突變體的表型

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)對(duì)N末端乙酰轉(zhuǎn)移酶Naa20的基因突變體進(jìn)行表型觀察及突變體的轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)試驗(yàn)，揭示了Naa20抑制植物幼年態(tài)向成年態(tài)的轉(zhuǎn)變以及開花時(shí)間的轉(zhuǎn)變，在植物發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。已有研究報(bào)道表明，Naa20輔助亞基TCU2/Naa25的基因突變體表現(xiàn)出相似的開花時(shí)間提前的表型。酵母雙雜交的結(jié)果表明，Naa20與Naa25具有直接的相互作用。綜合以上結(jié)果表明，Naa20和TCU2/Naa25形成的蛋白質(zhì)N末端乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體在抑制植物發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要的作用。

遺傳分析表明，Naa20通過(guò)下游調(diào)控HST進(jìn)而調(diào)控植物發(fā)育時(shí)相的轉(zhuǎn)變。HST是microRNA156核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的重要因子，因此Naa20可能通過(guò)控制葉片中microRNA156的水平進(jìn)而調(diào)控植物發(fā)育時(shí)相的轉(zhuǎn)變。因此，蛋白質(zhì)N末端乙酰轉(zhuǎn)移酶Naa20作為一個(gè)新的調(diào)控因子，參與植物發(fā)育時(shí)相的轉(zhuǎn)變，豐富了植物發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)變的調(diào)控層次。